髓核間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性與椎間盤Pfirrmann分級相關(guān)性研究

方世兵　伍耀宏　陳云生　陳勤　徐燦華　潘其林

[摘要] 目的 研究不同Pfirrmann分級椎間盤中髓核間充質(zhì)干細(xì)胞（human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs）的生物學(xué)特性，進(jìn)一步明確hNP-MSCs在椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）中的作用及其相關(guān)性。 方法 選取2017年1月～2019年1月我院椎間盤髓核摘除術(shù)的患者，根據(jù)術(shù)前MRI按Pfirrmann分級標(biāo)準(zhǔn)（Ⅰ～Ⅴ級）分為5組，各組均為3例，共15例，評價(jià)hNP-MSCs在不同椎間盤退變中的生物學(xué)特性差異及其與椎間盤退變程度的相關(guān)性。 結(jié)果 PfirrmannⅠ～Ⅴ級5組共15例標(biāo)本均分離獲取到了hNP-MSCs原代細(xì)胞，貼壁時(shí)間及80%～90%融合率時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Pfirrmann分級越高，細(xì)胞生長所需時(shí)間越長，細(xì)胞形態(tài)及增殖集落越不均一。酶標(biāo)儀檢測不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標(biāo)本接種后第1、3天，不同組hNP-MSCs標(biāo)本OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），第5、7、9、11、13天，不同組hNP-MSCs標(biāo)本OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Pfirrmann分級超高，OD值越低，提示增殖能力與Pfirrmann分級呈負(fù)相關(guān)性。不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標(biāo)本P2代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示均為高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105，低表達(dá)CD31、CD34、CD45，各組CD44、CD73、CD90、CD105陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨Pfirrmann分級的增加，陽性表達(dá)率下降，呈負(fù)相關(guān)性。 結(jié)論 hNP-MSCs的生物學(xué)特性與椎間盤Pfirrmann分級密切相關(guān)，椎間盤退變程度越重，hNP-MSCs的生物學(xué)表現(xiàn)越差。

[關(guān)鍵詞] 髓核間充質(zhì)干細(xì)胞;Pfirrmann分級;生物學(xué)特性;OD值;相關(guān)性

[中圖分類號] R681.53? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）22-0039-05

[Abstract] Objective To study the biological characteristics of human nucleus pulposus mesenchymal stem cells （hNP-MSCs） in different Pfirrmann graded intervertebral discs， and to further clarify the role and relevance of hNP-MSCs in intervertebral disc degeneration （IVDD）. Methods Patients who underwent nucleus pulposus removal from January 2017 to January 2019 in our hospital were divided into 5 groups according to the preoperative MRI according to the Pfirrmann grading standard（Ⅰ-Ⅴ grade）， with 3 cases in each group and 15 cases totally. The differences in biological characteristics of hNP-MSCs in different intervertebral disc degeneration and their correlation with the degree of intervertebral disc degeneration. Results The primary cells of hNP-MSCs were isolated from 15 specimens of Pfirrmann Ⅰ-Ⅴ group. There were statistically significant differences in the time of adherence time and the time of 80%-90% fusion rate（P<0.05）. The higher the Pfirrmann grade， the longer it took for cells to grow， and the more uniform the cell morphology and proliferation colonies. 5 groups of hNP-MSCs specimens from different Pfirrmann grades were detected by microplate reader on the first and third days after inoculation. The differences in OD values of hNP-MSCs in different groups were not statistically significant（P>0.05）. On the 5th， 7th， 9th， 11th， and 13th day， the difference of OD values between different groups of hNP-MSCs was statistically significant （P<0.05）. The higher Pfirrmann grade， the lower the OD value， indicating that the proliferation ability was negatively correlated with Pfirrmann classification. Flow cytometry results of P2 generation of hNP-MSCs samples in 5 groups from different Pfirrmann grades showed high expression of CD44， CD73， CD90 and CD105， low expression of CD31， CD34 and CD45. The difference in positive expression rate of CD44， CD73， CD90， CD105 in each group was statistically significant （P<0.05）. And with the increase in Pfirrmann grading， the positive expression rate decreased and was negatively correlated. Conclusion The biological characteristics of hNP-MSCs are closely related to the Pfirrmann classification of the intervertebral disc. The more severe the degeneration of the intervertebral disc， the worse the biological performance of hNP-MSCs.

[Key words] Nucleus pulposus mesenchymal stem cells; Pfirrmann classification; Biological characteristics; OD value; Correlation

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是引起頸肩腰腿痛的主要原因。近年來，細(xì)胞治療干預(yù)早期IVDD是當(dāng)前的熱點(diǎn)研究。然而，IVDD的機(jī)制尚不明確，這對IVDD生物治療的時(shí)機(jī)及治療方法提出了挑戰(zhàn)。椎間盤干細(xì)胞的修復(fù)作用在IVDD中起著至關(guān)重要的作用，其中以髓核間充質(zhì)干細(xì)胞（human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs）作用最為明顯。雖然目前已證明了hNP-MSCs退變是引起IVDD的重要因素，但并未對退變椎間盤進(jìn)行分級。IVDD是一個(gè)漫長的過程，不同退變程度椎間盤表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性及特征，所以基于當(dāng)前hNP-MSCs與椎間盤退變的所有研究，無法明確椎間盤退變過程中hNP-MSCs的生物學(xué)功能差異。因此，研究不同Pfirrmann分級椎間盤中hNP-MSCs的功能差異，對進(jìn)一步闡明hNP-MSCs在椎間盤退變中的作用具有重要指導(dǎo)意義，為進(jìn)一步闡述椎間盤干細(xì)胞在椎間盤退變過程中的作用機(jī)制提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選擇2017年1月～2019年1月贛州市人民醫(yī)院脊柱外科接受椎間盤髓核摘除術(shù)的患者，根據(jù)術(shù)前MRI按Pfirrmann分級標(biāo)準(zhǔn)（Ⅰ～Ⅴ級）分為5組，各組均為3例，共15例。其中男9例、女6例，年齡16～51歲，平均38.5歲;頸椎椎間盤5例，胸椎2例，腰椎8例;病種為頸椎骨折2例、頸椎病3例、結(jié)構(gòu)性脊椎側(cè)彎畸形2例、腰椎間盤突出癥及腰椎滑脫8例?；诤舜殴舱駲z查結(jié)果的Pfirrmann分級主觀評價(jià)差異大，為去除主觀差異，需要經(jīng)過3個(gè)不同的影像科醫(yī)師進(jìn)行評分分級，經(jīng)過2個(gè)醫(yī)師同意即可作為該樣本最終分級。Ⅰ級的椎間盤見于健康的青少年，本研究中采用頸椎骨折1例（23歲）及脊柱側(cè)彎畸形2例（16～21歲）的變異節(jié)段的椎間盤作為代替，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級取自接受椎間盤切除融合手術(shù)的患者，本實(shí)驗(yàn)患者知情同意并獲醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書，未成年者由監(jiān)護(hù)人簽署。

1.2 儀器及試劑

流式細(xì)胞儀（Millipore 美國），Moflo高速流式細(xì)胞分選儀（Dako cytomation 美國），離心機(jī)（Hereaus德國），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8日本），細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning 美國），磷酸鹽緩沖液PBS（Sigma 美國），倒置顯微鏡（Olympus日本），胰蛋白酶（Solaibo美國），Ⅱ型膠原酶（Gibico美國），胎牛血清（Hyclone美國），DMEM低糖培養(yǎng)基（Cyagen Biosciences中國），青霉素-鏈霉素（Hyclone 美國），熒光單克隆抗體CD90-APC、CD73-APC、CD105-APC、CD44-APC、CD31-APC、CD34-APC、CD45-APC（Abcam 美國）。

1.3 分離培養(yǎng)獲取hNP-MSCs

將手術(shù)中切下的椎間盤組織（術(shù)前按Pfirrmann分級分組）立即送中心實(shí)驗(yàn)室處理，無菌條件下超凈臺上生理鹽水清洗血塊等表面雜質(zhì)，眼科剪剔除椎間盤的纖維環(huán)及軟骨終板組織，仔細(xì)分離髓核組織，PBS清洗2遍，剪碎至1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm大小，置于0.02 mg/mL的Ⅱ型膠原酶溶液中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中消化過夜，次日取出并用200 μm無菌鋼絲網(wǎng)過濾組織碎片。1500轉(zhuǎn)/min離心4 min，棄上清液，收集細(xì)胞，加至含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，吹打混勻，置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁后每2～3天換液1次，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，0.25%胰酶、0.02%EDTA消化3 min，按照5×103個(gè)細(xì)胞/cm2重新接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取P2代細(xì)胞至80%～90%融合時(shí)，提取hNP-MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在hNP-MSCs分離培養(yǎng)過程中，利用倒置顯微鏡，每天對細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞融合率進(jìn)行觀察，拍照并記錄形態(tài)學(xué)及集落形成特征。

1.5 hNP-MSCs增殖能力的檢測

細(xì)胞增殖能力用CCK-8進(jìn)行檢測，將不同分組的P2代hNP-MSCs，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，按照每孔5×104個(gè)細(xì)胞/mL、200 μL培養(yǎng)基接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白對照組。將96孔板放置于溫度為37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后第1、3、5、7、9、11、13天檢測細(xì)胞增殖情況，在各組每孔添加10 μL CCK-8溶液（包含空白對照組），作用4 h后用檢測波長為450 nm酶標(biāo)儀測定光密度（OD）值，將各細(xì)胞培養(yǎng)孔所得OD值減去陰性空白對照OD值后，計(jì)算不同組別培養(yǎng)基組hNP-MSCs的平均OD值，比較細(xì)胞增殖活力，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 免疫表型的檢測

各組取P2代細(xì)胞，消化制備細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105/mL，每管取細(xì)胞1 mL，PBS清洗后，分別加入熒光單克隆抗體CD90-APC、CD73-APC、CD105-APC、CD44-APC、CD31-APC、CD34-APC、CD45-APC，每管共100 μL細(xì)胞懸液，根據(jù)同型對照的熒光強(qiáng)度設(shè)陰性對照組（不加任何抗體）。將每管標(biāo)本與抗體混勻后室溫避光孵育，20 min后用2 mL PBS清洗后棄上清，重懸于400 μL PBS（含1%多聚甲醛）FC500流式細(xì)胞儀上檢測，觀察各組hNP-MSCs每種單抗的陽性細(xì)胞表達(dá)率，Cellquest軟件分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以（x±s）表示，對不同組hNP-MSCs不同培養(yǎng)天數(shù)的細(xì)胞OD值，CD90、CD73、CD105、CD44、 CD31、CD34、CD45的陽性表達(dá)率進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組hNP-MSCs培養(yǎng)P2代貼壁時(shí)間（h）及80%～90%融合率時(shí)間

PfirrmannⅠ～Ⅴ級5組共15例標(biāo)本均分離獲取到了hNP-MSCs原代細(xì)胞，各組在接種后不同時(shí)間出現(xiàn)貼壁，P0代細(xì)胞形態(tài)多為長短不一的短梭紡錘形，為散在不規(guī)則貼壁生長（封三圖4），約12～19 d細(xì)胞融合率可達(dá)80%～90%。P1代細(xì)胞生長較P0代明顯增快，貼壁時(shí)間更短，細(xì)胞排列緊密、形態(tài)更均一，呈螺旋狀（封三圖5），接種后約10～17 d細(xì)胞達(dá)80%～90%融合。P2代細(xì)胞形態(tài)基本保持一致，貼壁快、約4～6 h，呈典型的長梭形，排列更加緊密、整齊，呈漩渦狀排列生長（封三圖6），約6～12 d細(xì)胞融合率即可達(dá)80%～90%。5組標(biāo)本P2代貼壁生長時(shí)間、80%～90%細(xì)胞融合率時(shí)間（表1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Pfirrmann分級越高，細(xì)胞生長所需時(shí)間越長，細(xì)胞形態(tài)及增殖集落越不均一。

2.2 不同Pfirrmann分組hNP-MSCs不同培養(yǎng)時(shí)間的OD值

酶標(biāo)儀檢測不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標(biāo)本接種后第1、3、5、7、9、11、13天的OD值結(jié)果見表2。細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，培養(yǎng)第1、3天，不同組的hNP-MSCs標(biāo)本OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），第5、7、9、11、13天，不同組的hNP-MSCs標(biāo)本OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Pfirrmann分級越高，OD值越低，提示增殖能力與Pfirrmann分級呈負(fù)相關(guān)性。

2.3 各組hNP-MSCs標(biāo)本P2代細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)率

不同Pfirrmann分級的5組hNP-MSCs標(biāo)本P2代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示均為高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105，低表達(dá)CD31、CD34、CD45（表達(dá)率見表3），各組CD44、CD73、CD90、CD105陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨Pfirrmann分級的增加，陽性表達(dá)率下降，呈負(fù)相關(guān)性。

3 討論

大量研究已證實(shí)，IVDD是脊柱相關(guān)疾病的主要原因之一，機(jī)制主要為椎間盤退變致膨出及突出，出現(xiàn)神經(jīng)根壓迫及炎性病變的發(fā)生，從而出現(xiàn)疼痛等相應(yīng)臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量[1]。椎間盤主要由終板軟骨、纖維環(huán)和髓核組織3部分組成，主要構(gòu)成為膠原蛋白和蛋白糖類[2]，營養(yǎng)主要來自椎體軟骨終板的毛細(xì)血管床[3]。IVDD的機(jī)制為尚不明確，研究報(bào)道多種因素可引起椎間盤退變，過程復(fù)雜[4-5]，Stemple DL[6]認(rèn)為髓核細(xì)胞形態(tài)改變，凋亡率和死亡率增加，細(xì)胞外基質(zhì)（蛋白多糖、Ⅱ型膠原等）合成減少是IVDD主要原因。目前尚無一種切實(shí)有效的治療或阻止椎間盤退變的方法。髓核組織中存在hNP-MSCs[7]，其可通過調(diào)節(jié)分泌作用，刺激退變的椎間盤進(jìn)行內(nèi)在修復(fù)[8]。近年來，干細(xì)胞移植成為IVDD生物學(xué)治療的研究熱點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)，自體hNP-MSCs植入退變椎間盤組織內(nèi)能明顯延緩IVDD的發(fā)展進(jìn)程[9]，然而，自體hNP-MSC并不容易獲取足量細(xì)胞，且在獲取細(xì)胞時(shí)往往引也正常椎間盤退變或原來退變加重，反而加重患者病情，成為自體干細(xì)胞移植應(yīng)用臨床最大的障礙。有學(xué)者嘗試采用不同方法激活已退變椎間盤內(nèi)的hNP-MSCs來阻止或逆轉(zhuǎn)IVDD，查相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道尚少，本課題受此啟發(fā)，研究不同退變程度的椎間盤組織內(nèi)hNP-MSCs生物活性，進(jìn)一步闡明hNP-MSCs在椎間盤退變中的作用和機(jī)制，明確兩者相關(guān)性，為生物治療椎間盤退變提供合適的治療時(shí)機(jī)與合理的治療方法。

椎間盤退變程度評估的方法有很多，最常用的有X線片、CT片、椎間盤造影、MRI檢查及術(shù)中實(shí)體觀察等。其中以MRI應(yīng)用最多，Pfirrmann分級是通過MRI對椎間盤退變進(jìn)行評估的一種方法，依據(jù)MR T2WI圖像判斷椎間盤退變的程度，它從解剖學(xué)角度清楚地描述了椎間盤退變的形態(tài)學(xué)改變，可以較好地反映椎間盤早期的退行性改變，為無創(chuàng)、有效、準(zhǔn)確及可行性強(qiáng)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床與科研[10-11]。Pfirrmann分級法是依據(jù)T2WI信號強(qiáng)度、信號是否均質(zhì)、髓核與纖維環(huán)的分界是否清晰和椎間盤的高度等指標(biāo)建立了腰椎間盤退變的MRI分級體系，分為Ⅰ～Ⅴ級。本研究采用Pfirrmann分級法對椎間盤退變進(jìn)行評估，按Ⅰ～Ⅴ級分為5組，各組均取3個(gè)標(biāo)本，共15個(gè)。Ⅰ、Ⅱ級見于正常青少年的椎間盤組織，其中Ⅰ為健康的青少年，臨床上行椎間盤摘除手術(shù)相對較少，取材資源少，本課題3例標(biāo)本來源于少年先天性脊椎側(cè)彎畸形手術(shù)，在行椎體截骨取出下椎間盤組織。Ⅱ級3例標(biāo)本來源于頸椎骨折青年患者，椎間盤信號呈均勻白色，髓核與纖維環(huán)的分界清晰，在行前路穩(wěn)定手術(shù)（頸椎融合）中切取的椎間盤組織。Ⅲ級椎間盤髓核T2WI信號呈灰色、不均勻，髓核與纖維環(huán)的分界模糊，椎間椎高度輕度降低，標(biāo)本1個(gè)取自頸椎病、2個(gè)取自腰椎間盤突出患者。Ⅳ級髓核T2WI信號呈灰色或黑色，與纖維環(huán)的分界消失，高度中度降低，3例標(biāo)本取腰椎間盤突出。Ⅴ級髓核信號比Ⅳ級更黑，伴有椎間高度塌陷，因退變嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)中分離髓核相對困難，標(biāo)本取自重型頸椎病及腰椎滑脫患者。實(shí)驗(yàn)過程中，各級標(biāo)本均分離培養(yǎng)到了符合標(biāo)準(zhǔn)的hNP-MSCs，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

椎間盤退變時(shí)，髓核組織退變最明顯，對于椎間盤退變有重要影響[12]，其進(jìn)程為不可逆性，既往研究認(rèn)為椎間盤本身不具備修復(fù)能力[13]。隨著對椎間盤組織及細(xì)胞生化研究的廣泛深入開展，Risbud首次報(bào)道了椎間盤髓核組織中存在hNP-MSCs，該細(xì)胞特征性表達(dá)一系列間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）表面蛋白分子、可完成三系誘導(dǎo)分化，符合國際細(xì)胞治療學(xué)會（International Society for Cellular Therapry，ISCT）有關(guān)MSCs 的界定標(biāo)準(zhǔn)[14]，MSCs是體內(nèi)一類特殊的細(xì)胞群體， 其具有自我更新及多向分化能力[15-17]。通過激活hNP-MSCs的生物活性來治療IVDD，現(xiàn)已成為熱點(diǎn)，并有大量的相關(guān)基礎(chǔ)研究報(bào)道[18-20]。退變對hNP-MSCs的生物活性的影響及相關(guān)性的研究比較少見，我們選取需切除椎間盤的患者，年齡16～51歲，排除腫瘤、結(jié)核等疾病，術(shù)前根據(jù)MRI結(jié)果明確Pfirrmann分級，按不同分級進(jìn)行分組納入實(shí)驗(yàn)研究。手術(shù)中獲取椎間盤髓核組織標(biāo)本，酶消化法分離髓核間充質(zhì)干細(xì)胞，比較不同分級髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)、增殖、集落形成、干細(xì)胞免疫表型，評價(jià)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞在不同椎間盤退變中的生物學(xué)特性差異及其與椎間盤退變程度的相關(guān)性。均數(shù)采用（x±s）表示，對不同組hNP-MSCs不同培養(yǎng)天數(shù)的細(xì)胞OD值，CD90、CD73、CD105、CD44、CD31、CD34、CD45的陽性表達(dá)率進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)?；诤舜殴舱駲z查結(jié)果的Pfirrmann分級主觀評價(jià)差異大，為去除主觀差異，需要經(jīng)過3個(gè)不同的影像科醫(yī)師進(jìn)行評分分級，經(jīng)過2個(gè)醫(yī)師同意即可作為該樣本最終分級。本研究結(jié)果顯示不同Pfirrmann分級的hNP-MSCs形態(tài)不同，分級越高，細(xì)胞越不規(guī)則，而且貼壁時(shí)間與80%～90%細(xì)胞融合率時(shí)間也隨退變的加重而延長。增殖能力及免疫表型檢測顯示，椎間盤退變越重，其增殖能力越差、細(xì)胞免疫標(biāo)志物的陽性率也明顯減低。本研究在不同退變程度的椎間盤內(nèi)均可培養(yǎng)出hNP-MSCs，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了隨著椎間盤退變程度的加重，hNP-MSCs生物活性變差。本實(shí)驗(yàn)首次研究Pfirrmann退變程度與髓核間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡述椎間盤干細(xì)胞在椎間盤退變過程中的作用機(jī)制提供了新方法。

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（收稿日期：2019-04-16）