毛蘭素通過MAPK途徑抑制葡萄膜黑色素瘤增殖并誘導(dǎo)凋亡

查桂平　汪卓瓊

[摘要] 目的 研究毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，以及探索潛在的信號(hào)通路。 方法 采用MTT比色法檢測(cè)毛蘭素對(duì)MUM-2B和C918葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞株增殖活力的影響，DAPI染色結(jié)合AnnexinV/PI 雙染后流式細(xì)胞分析檢測(cè)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡率，免疫印跡分析細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白如p21、MAPK及其磷酸化形式，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和PARP等的表達(dá)量。 結(jié)果 毛蘭素對(duì)C918、MUM-2B葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞均存在不同程度的抑制作用。當(dāng)濃度達(dá)到25 μmol/L時(shí)，MUM-2B 的抑制率達(dá)到（79.92±2.79）%，C918的抑制率在（84.60±0.81）%。DAPI染色可見細(xì)胞數(shù)量隨毛蘭素濃度增加而逐漸減少，而且存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。隨著毛蘭素作用濃度的增大，G2/M期細(xì)胞的比例逐漸增加，早期和晚期凋亡細(xì)胞比例增加。在毛蘭素處理后，p38 MAPK蛋白表達(dá)在MUM-2B中較為顯著的下調(diào)，PARP總蛋白水平有顯著下調(diào)（P<0.05），p38 MAPK總蛋白有一定程度的下調(diào)，而p21、PARP活化形式（cl-PARP）和Caspase-3的活化形式（cl-Caspase3）顯著上調(diào)（P<0.05）。 結(jié)論 毛蘭素能夠有效抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞C918、MUM-2B、增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡，且其作用效果呈現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的劑量依賴性。其作用機(jī)制與上調(diào)p21表達(dá)，抑制p38 MAPK表達(dá)有關(guān)，后者可削弱MAPK信號(hào)通路活化，并可活化細(xì)胞凋亡途徑關(guān)鍵蛋白Caspase-3誘導(dǎo)凋亡。

[關(guān)鍵詞] 毛蘭素;p21;MAPK途徑;葡萄膜黑色素瘤;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R739.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）22-0031-04

[Abstract] Objective To study the effects of erianin on proliferation and apoptosis of uveal melanoma cell lines and to explore potential signaling pathways. Methods MTT colorimetric assay was used to detect the effect of erianin on the proliferation of MUM-2B and C918 strains of uveal melanoma cell lines. After DAPI staining combined with AnnexinV/PI double staining， apoptotic rate of uveal melanoma cells was analyzed and detected by flow cytometry analysis. Western blot analysis was used to analyze cell proliferation-related proteins such as p21， MAPK and its phosphorylated form， expression amount of apoptosis-related proteins such as Caspase-3 and PARP. Results Erianin had different inhibitory effects on C918 and MUM-2B of uveal melanoma cells. When the concentration reached 25 μmol/L， the inhibition rate of MUM-2B was up to（79.92±2.79）%， and the inhibition rate of C918 was about（84.60±0.81）%. The number of cells visible in DAPI staining was decreased with the increase of the concentration of erianin， and there was apoptosis. As the concentration of erianin increased， the proportion of G2/M phase cells increased gradually， and the proportion of early and late apoptotic cells increased. After the treatment with erianin， among the two strains of cells， the expression of p38 MAPK protein was significantly down-regulated in MUM-2B， and the total protein level of PARP was significantly down-regulated （P<0.05）. The total protein of p38 MAPK was down-regulated to a certain extent， while p21， PARP-activated form （cl-PARP） and Caspase-3 activated form （cl-Caspase3） were significantly up-regulated（P<0.05）. Conclusion Erianin can effectively inhibit the proliferation of uveal melanoma cells C918， MUM-2B， arrest cell cycle， promote the apoptosis of uveal melanoma cells， and its effect is dose-dependent within a certain range. Its mechanism of action is related to up-regulation of p21 expression and inhibition of p38 MAPK expression. The latter can attenuate the activation of MAPK signaling pathway and activate the key protein Caspase-3 in the apoptosis pathway to induce apoptosis.

[Key words] Erianin; p21; MAPK pathways; Uveal melanoma; Apoptosis

眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤（Uveal melano-ma，UM）與結(jié)膜黑色素瘤（Choroidal melanoma，CM）[1]，其中UM是成人發(fā)生率最高的眼內(nèi)惡性腫瘤，起源于葡萄膜層，惡性程度高，極易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，死亡率高，嚴(yán)重威脅患者視力與生命。CM起病較為隱匿，早期不影響視力，發(fā)現(xiàn)時(shí)常有擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者生命安全。因此，研究眼部黑色素瘤發(fā)生機(jī)制，對(duì)探尋眼部黑色素瘤早期診斷和治療新靶點(diǎn)，提高治療有效性，降低眼球摘除率及轉(zhuǎn)移率，提高患者視覺預(yù)后及生存時(shí)間，具有十分重要的臨床指導(dǎo)和科學(xué)意義。目前，針對(duì)該腫瘤的治療主要為手術(shù)和放化療等非病因治療，缺乏針對(duì)其病因的治療手段。

從天然植物中獲得生物活性的天然產(chǎn)物是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要途徑，統(tǒng)計(jì)1981～2002年20年來美國(guó)FDA批準(zhǔn)的抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)，有74%是來自于天然產(chǎn)物或者通過其衍生物得到，比較典型的如紫杉醇、鬼臼毒素、喜樹堿等。石斛是傳統(tǒng)中藥，為蘭科多年生草本植物。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)石斛屬植物進(jìn)行了大量的藥理學(xué)研究。研究表明石斛具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、擴(kuò)張血管以及抗血小板凝集等多種效能，特別是其抗腫瘤活性日益受到廣泛關(guān)注[2]。有研究表明石斛能夠通過下調(diào)ERK通路從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖，另一方面，還能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)失巢凋亡的敏感性[3]。在其他腫瘤中，石斛及其從中提取的活性物質(zhì)表現(xiàn)出促癌細(xì)胞凋亡以及轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，包括前列腺癌[4]、白血病[5]、乳腺癌[6]、骨肉瘤[7]等。毛蘭素是石斛的活性化合物之一，屬聯(lián)芐類化合物，化學(xué)名為2-甲氧基-5-[2-（3，4，5-三甲氧基-苯基）-乙基]-苯酚，已有研究表明該化合物具有抗腫瘤活性，并可抑制視網(wǎng)膜血管新生[8]，但對(duì)其具體的分子機(jī)制及藥物靶標(biāo)卻未能明確。另一方面，毛蘭素對(duì)人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的抗癌活性也鮮有報(bào)道。因此，本文旨在通過體外研究毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡與周期的影響，并探討其可能的抗癌分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和抗體

人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞株MUM-2B及C918均購(gòu)自浙江如耀生物科技有限公司，F(xiàn)BS及RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;細(xì)胞培養(yǎng)用PBS與雙抗購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)所需耗材均購(gòu)自美國(guó)Coring公司;MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;DAPI染料購(gòu)自Invitrogen公司;Annexin-FITC/PI流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;免疫印跡所用抗體均購(gòu)自CST公司，抗人Caspase-3抗體（貨號(hào)9662，稀釋比1∶1000），cleaved Caspase-3抗體（貨號(hào)9664，稀釋比1∶1000），PARP抗體（貨號(hào)9542，稀釋比1∶1000），以及cleaved-PARP抗體（貨號(hào)9541，稀釋比1∶1000），p38 MAPK抗體（貨號(hào)8690，稀釋比1∶1000），GAPDH（貨號(hào)AB-P-R001，稀釋比1∶1000）及HRP偶聯(lián)的羊抗兔/鼠IgG等抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，稀釋比例為1∶1000（二抗1∶3000），流式檢測(cè)周期與凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

采用MTT比色法檢測(cè)毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響。將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加毛蘭素（以加等量不含藥培養(yǎng)基為對(duì)照組），孵育48 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）15 μL，孵育4 h后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測(cè)波長(zhǎng)562 nm，參比波長(zhǎng)630 nm，測(cè)定吸光值，以不加藥的培養(yǎng)基作為對(duì)照，計(jì)算毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的抑制率。

1.3 細(xì)胞核形態(tài)檢測(cè)（DAPI染色）

C918和MUM-2B細(xì)胞鋪板到10 cm，dish中，事先已放入入已滅菌的干凈的蓋玻片，做細(xì)胞爬片，用毛蘭素處理24 h后，分別取出蓋玻片置于6 cm dish中，PBS洗滌1～2遍，加入1 mL甲醇固定30 s，棄掉甲醇后，加入DAPI染液使其工作濃度為1 μg/mL，染色2～3 min，棄去DAPI染色液，加入適量PBS，洗3遍，立即置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，激發(fā)波長(zhǎng)為360～400 nm。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin-FITC/PI流式檢測(cè)試劑盒檢測(cè)毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響。將MUM-2B和C918細(xì)胞分組加毛蘭素處理24 h后，胰酶消化，計(jì)數(shù)，取5×106 cells于1.5 mLEP管中，2000 rpm離心5 min，棄上清后加入預(yù)冷的PBS，2000 rpm離心5 min，棄上清，加入300 μL 1×BD Buffer重懸細(xì)胞，避光加入5 μL FITC，室溫避光15 min，后加入5 μL PI，室溫避光8 min，最后加入200 μL 1×BD Buffer混勻，上流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。

1.5 Western-blotting分析

收集毛蘭素及陰性對(duì)照組處理24 h 后的C918和MUM-2B細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌2遍，加入150 μL 2×loading buffer裂解細(xì)胞至細(xì)胞呈黏稠狀，1 mL注射器吹打使DNA斷裂，隨后于100℃處理10 min?？偟鞍捉?jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入一抗，4℃ 孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜 3 次后，通過 ECL 試劑盒進(jìn)行顯影檢測(cè)。Image J分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間差異采用One-way ANOVA和Newman-Keuls-test多重比較t檢驗(yàn)分析。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響

選擇2株不同的葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞，分別在3.125、6.250、12.500、25.000 μmol/L毛蘭素作用48 h后，進(jìn)行MTT測(cè)試，考察毛蘭素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，見表1。毛蘭素對(duì)2株葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞有不同程度的抑制，25 μmol/L毛蘭素作用下MUM-2B抑制率達(dá)到（79.92±2.79）%，相同濃度下C918的抑制率（84.60±0.81）%。在一定濃度范圍內(nèi)，毛蘭素對(duì)2株葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的抑制率隨濃度增加而提高，兩組抑制率比較發(fā)現(xiàn)，毛蘭素濃度在0、0.390、1.560、12.500以及25.000 μM時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞核形態(tài)的影響

根據(jù)DAPI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加毛蘭素處理的對(duì)照組細(xì)胞核較完整，未見明顯凋亡形態(tài)。毛蘭素處理后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且細(xì)胞數(shù)量隨濃度增加而逐漸減少，同時(shí)高倍鏡下可見部分細(xì)胞呈典型凋亡形態(tài)，提示毛蘭素中存在可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的組分，且隨著濃度的增加，凋亡的細(xì)胞增多。見封三圖1。

2.3 毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞周期的影響

MUM-2B和C918細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，在毛蘭素作用下，兩株細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例均有明顯增加，且隨著毛蘭素作用濃度的增加，G2/M期的細(xì)胞比例逐漸增加，同時(shí)S期和G0/G1期的細(xì)胞比例降低，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明毛蘭素可能通過將細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（封三圖2A）。當(dāng)毛蘭素作用濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，MUM-2B細(xì)胞G2/M期比例由對(duì)照組時(shí)的19.03%增加至25.46%，C918細(xì)胞G2/M期比例由22.51%增加至29.83%（封三圖2B）。

2.4 毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響

毛蘭素處理24 h后，MUM-2B和C918細(xì)胞進(jìn)行Annexin V/PI雙染色，結(jié)果顯示早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例均隨毛蘭素作用的濃度增加而逐漸增加，體現(xiàn)為R3和R5區(qū)域細(xì)胞比例的逐漸增加（封三圖3）。毛蘭素作用濃度達(dá)到20 μmol/L，MUM-2B早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例均達(dá)到最大，分別為（37.01±3.52）%和（18.53±2.01）%，C918早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞比例分別為（32.91±3.12）%和（19.04±2.31）%。說明毛蘭素能夠誘導(dǎo)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡，與上述實(shí)驗(yàn)得出的推論一致。見表2。

2.5 毛蘭素對(duì)增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響

MUM-2B和C918細(xì)胞經(jīng)毛蘭素處理24 h后，提取總蛋白，進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果表明隨著毛蘭素作用濃度的增加，PARP總蛋白水平有顯著下調(diào)，p38 MAPK總蛋白有一定程度的下調(diào)，而p21、PARP活化形式（cl-PARP）和Caspase-3的活化形式（cl-Caspase3）顯著上調(diào)。見圖1。

3 討論

葡萄膜黑色素瘤為成人眼內(nèi)常見惡性腫瘤，5年生存率在17%～50%，主要死因?yàn)楦无D(zhuǎn)移，目前尚無有效治療手段[9]。開發(fā)抗葡萄膜黑色素瘤的藥物為目前的當(dāng)務(wù)之急。中藥是我國(guó)最寶貴的傳統(tǒng)文化之一，從中藥入手分離出具有生物活性的中藥單體對(duì)于抗癌藥物開發(fā)具有重要意義，天然單體中有很多難以合成的結(jié)構(gòu)，不少具有廣泛的生物學(xué)活性。毛蘭素作為石斛中分離出單體中的一種，已被證實(shí)具有較顯著的抗腫瘤藥理活性[10]，但是毛蘭素對(duì)葡萄膜黑色素細(xì)胞的作用未被報(bào)道過。

本研究顯示，毛蘭素可顯著抑制2株葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞株的增殖，且有濃度依賴性，既往研究顯示，毛蘭素對(duì)多種腫瘤均有顯著的抑制效果，如膀胱癌[11]、肝癌[12]、腸癌[13]、乳腺癌[14]、胃癌[15，16]等，作用濃度在納摩爾和微摩爾之間，提示不同的癌細(xì)胞類型對(duì)毛蘭素的敏感性不同。為進(jìn)一步探討毛蘭素抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制，本文檢測(cè)了毛蘭素作用后細(xì)胞周期的變化，MUM-2B和C918細(xì)胞在毛蘭素作用后均存在較為顯著的G2/M期阻滯，表現(xiàn)為隨毛蘭素濃度增加，G2/M期比例逐漸增加，這一結(jié)果也與其他研究報(bào)道相符[7，17]。對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。MAPK信號(hào)通路是維持細(xì)胞存活的重要通路[18]，被活化后可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等多種底物，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖，也被認(rèn)為是細(xì)胞非控制性分裂的主要信號(hào)通路，在黑色素瘤細(xì)胞增殖過程中通過傳遞胞外信號(hào)發(fā)揮重要作用。研究顯示，UM中存在MAPK通路的異常活化[19]，并與皮膚中的黑色素瘤活化情況有所不同，對(duì)UM的侵襲和轉(zhuǎn)移均有影響。p38 MAPK是MAPK通路的其中一個(gè)亞型，其功能與細(xì)胞增殖、分化、存活、遷移密切相關(guān)，因而被用于研究癌細(xì)胞成因，且已被證明其在癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)失控。本研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素作用MUM-2B和C918細(xì)胞后，p38 MAPK表達(dá)量均顯著下調(diào)，提示毛蘭素能抑制MAPK信號(hào)通路活化。

隨后通過Annexin V/PI染色進(jìn)一步證實(shí)，毛蘭素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，體現(xiàn)為晚期和早期凋亡水平隨毛蘭素濃度增加而比例增加，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和PARP的活化形式檢測(cè)，表現(xiàn)為隨毛蘭素濃度增加而上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)毛蘭素可誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，與之前在膀胱癌中的研究相符[11]，但也有研究報(bào)道毛蘭素作用后未見有Caspase-3的活化[20]。Caspase-3 為細(xì)胞實(shí)現(xiàn)凋亡通路的主要功能蛋白，不論是外源性或者內(nèi)源性通路最終匯總信號(hào)，通過活化Caspase-3啟動(dòng)凋亡。由此可以推斷，毛蘭素可能還存在其他誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的通路。

綜上所述，毛蘭素能夠有效抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞C918、MUM-2B增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞凋亡，且其作用效果呈現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的劑量依賴性。其作用機(jī)制為毛蘭素能抑制p38 MAPK表達(dá)，阻斷MAPK信號(hào)通路，活化細(xì)胞凋亡途徑關(guān)鍵蛋白Caspase-3和PARP。后期我們將考慮進(jìn)一步的體內(nèi)研究，以明確其對(duì)葡萄膜黑色素瘤的抑制效果。

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（收稿日期：2019-04-11）