麻黃堿對腦缺血大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)的影響及分子機(jī)制研究

李倩

摘要：為研究麻黃堿對腦缺血大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)的影響及相關(guān)的分子機(jī)制，選取體重為220～250 g的56只雄性SD大鼠，并隨機(jī)將其分為麻黃堿治療組、自然恢復(fù)組和假手術(shù)組，應(yīng)用Koizumi線栓法建立單側(cè)大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。應(yīng)用橫木行走試驗(yàn)在術(shù)后1、2、3、4周對其運(yùn)動功能改善情況進(jìn)行評定，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對缺血周圍區(qū)突觸素（SYP）、生長相關(guān)蛋白（GAP-43）表達(dá)的變化進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在各時間點(diǎn)，假手術(shù)組大鼠運(yùn)動功能無明顯改變（P>0.05）;在術(shù)后1周，運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組，但隨著時間的推移，自然恢復(fù)組的運(yùn)動功能不斷改善;相對于自然恢復(fù)組而言，麻黃堿治療組運(yùn)動功能恢復(fù)速度明顯更快，且在術(shù)后1、2、3周，麻黃堿治療組均明顯快于自然恢復(fù)組（P<0.05）;4周之后，3組之間無顯著差異（P>0.05）。在1、2、3周時，免疫組化光密度定量測定結(jié)果顯示麻黃堿治療組GAP-43和SYP的表達(dá)水平均明顯高于自然恢復(fù)組。說明麻黃堿可對腦缺血后動物的運(yùn)動功能恢復(fù)速度進(jìn)行加速，且麻黃堿的加速機(jī)制與促進(jìn)腦內(nèi)結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)重塑的分子表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：麻黃堿;腦缺血;大鼠;運(yùn)動功能;分子機(jī)制

中圖分類號：R49? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2019）09-0005-02

麻黃一直被中醫(yī)認(rèn)為有著活血通絡(luò)的功效。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示，在對腦缺血所致的中風(fēng)后遺癥進(jìn)行治療時，麻黃與其他中藥配伍使用，對神經(jīng)功能缺損癥狀有明顯的改善。然而，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)康復(fù)的作用及機(jī)理方面，單味的麻黃卻沒有明確的定論，但相關(guān)人士普遍認(rèn)為與麻黃的主要藥用成分麻黃堿有關(guān)?；诖?，本次研究選取了56只雄性SD大鼠，應(yīng)用Koizumi線栓法建立單側(cè)大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，以此來研究麻黃堿對腦缺血大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 分組動物

選取體重為220～250 g的56只雄性SD大鼠，隨機(jī)將其分為麻黃堿治療組（24只）、自然恢復(fù)組（24只）和假手術(shù)組（8只）。術(shù)后1、2、3、4周為各組的4個時間點(diǎn)，且在各時間點(diǎn)取不同數(shù)量的大鼠（麻黃堿治療組6只，自然恢復(fù)組6只和假手術(shù)組2只）進(jìn)行各項(xiàng)目的檢測。

1.2? 模型的制備

應(yīng)用Koizumi線栓法建立單側(cè)MCAO模型。首先麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺上時取仰臥位，頸前正中行縱行切口，對頸內(nèi)動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）、右側(cè)頸總動脈（CCA）進(jìn)行分離暴露，并結(jié)扎CCA近端和ECA根部，剝離迷走神經(jīng)。由頸外動脈插入栓線，經(jīng)頸內(nèi)動脈到大腦前動脈，機(jī)械性阻斷大腦中動脈發(fā)出處的血供來建立大腦中動脈缺血模型。如果需要再灌注，只需拔出栓線結(jié)扎傷口，即可恢復(fù)大腦血供。本試驗(yàn)缺血2 h后取出栓線實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組步驟與手術(shù)組相同，只是不插入栓線。

1.3? 給藥方法

大鼠手術(shù)后，麻黃堿治療組大鼠使用麻黃堿腹腔注射（3 mg/kg體重），每3 d注射一次，其余兩組給予同劑量的生理鹽水進(jìn)行注射。

1.4? 對運(yùn)動功能進(jìn)行評定

應(yīng)用橫木行走試驗(yàn)在術(shù)后1、2、3、4周對大鼠運(yùn)動功能改善情況進(jìn)行評定。橫木放置于距地面70 mm的高度，直徑25 mm，長1 200 mm。按照0～6分法來劃分等級。6分：無腳滑現(xiàn)象，能到達(dá)終點(diǎn);5分：少量腳滑現(xiàn)象，能到達(dá)終點(diǎn);4分：在一半以上的路程中出現(xiàn)腳滑現(xiàn)象，能到達(dá)終點(diǎn);3分：肢體在前進(jìn)時不起作用，能到達(dá)終點(diǎn);2分：在前進(jìn)時掉下;1分：可以站在橫木上，不能前進(jìn);0分：掉下。

1.5? 免疫組織化學(xué)檢測

應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對缺血周圍區(qū)突觸素（SYP）、生長相關(guān)蛋白（GAP-43）表達(dá)的變化進(jìn)行檢測。SYP及GAP-43均為Sigma公司產(chǎn)品。整個操作過程均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和圖像分析

用積分光密度值反映SYP和GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物的強(qiáng)度和面積。要得出積分光密度值，首先要求出各陽性區(qū)光密度的積分和（∑∫ OD）。被檢各區(qū)在每例標(biāo)本中均對3張切片進(jìn)行檢測，并取其均值。用x±s表示所得結(jié)果。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 各試驗(yàn)組在不同時間的運(yùn)動功能評分

由表1可見，假手術(shù)組大鼠運(yùn)動功能在各時間點(diǎn)均無明顯改變（P>0.05）;在術(shù)后1周，運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組，但隨著時間的推移，自然恢復(fù)組大鼠的運(yùn)動功能不斷改善;相對于自然恢復(fù)組，麻黃堿治療組大鼠恢復(fù)速度明顯更快，且在術(shù)后1、2、3周均明顯快于自然恢復(fù)組（P<0.05）;4周之后，3組之間無顯著差異（P>0.05）。

2.2? GAP-43免疫組化染色結(jié)果

神經(jīng)氈位置為GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物的主要存在區(qū)，其染色也隨著免疫產(chǎn)物和免疫反應(yīng)的增強(qiáng)而加深。

假手術(shù)組：少量著色位于神經(jīng)氈位置，免疫產(chǎn)物在兩半球?qū)ΨQ分布。不同的時間點(diǎn)之間無顯著差異（P>0.05）。

自然恢復(fù)組：在梗死中心區(qū)未見到GAP-43的表達(dá)。在1周時GAP-43在梗死周圍區(qū)的免疫活性達(dá)到高峰，在2周時開始降低，4周之后與假手術(shù)組之間無明顯差異（P>0.05）。

麻黃堿治療組：與自然恢復(fù)組有相同的GAP-43表達(dá)變化趨勢。相較于自然恢復(fù)組，在前3個時間點(diǎn)其表達(dá)水平均明顯偏高（P<0.05）（表2）。

顆粒狀沉積或棕黃色點(diǎn)狀為SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物，神經(jīng)氈內(nèi)為SYP免疫反應(yīng)產(chǎn)物的分布位置。免疫反應(yīng)強(qiáng)弱與突觸類型、顆粒的大小有關(guān)。

假手術(shù)組：神經(jīng)氈內(nèi)免疫產(chǎn)物在兩半球?qū)ΨQ分布。不同的時間點(diǎn)之間無明顯差異（P>0.05）。

自然恢復(fù)組：未在梗死中心區(qū)見到SYP表達(dá)。在1周時SYP在梗死周圍區(qū)的免疫活性開始增高，在2周時達(dá)到高峰，在3周時則開始降低，4周之后，3組之間無顯著差異（P>0.05）。

麻黃堿治療組：與自然恢復(fù)組具有相同的SYP表達(dá)變化趨勢，相較于自然恢復(fù)組，其在前3個時間點(diǎn)的表達(dá)水平均明顯偏高（P<0.05）（表2）。

3? 討論

麻黃具有利尿消腫、宣肺平喘、發(fā)汗散寒等功能，入肺、膀胱，性味辛苦溫，是我國寶貴的藥用植物。在對神經(jīng)可塑性的影響方面，麻黃對神經(jīng)可塑性的正性影響通過本研究得到證實(shí)。動物整體恢復(fù)狀況可以通過對側(cè)前肢感覺運(yùn)動整合功能的改善情況反映出來[1]。對動物感覺運(yùn)動整合功能恢復(fù)情況進(jìn)行評價(jià)的方法就是橫木行走試驗(yàn)。本次研究結(jié)果顯示，在各時間點(diǎn)，假手術(shù)組運(yùn)動功能無明顯改變（P>0.05）;在術(shù)后1周，運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組，但隨著時間的推移，自然恢復(fù)組的運(yùn)動功能不斷改善;相較于自然恢復(fù)組，麻黃堿治療組運(yùn)動功能恢復(fù)速度明顯更快，且在術(shù)后1、2、3周均明顯快于自然恢復(fù)組（P<0.05）;3組的運(yùn)動功能在術(shù)后4周時均無明顯差異（P>0.05）。這說明麻黃堿有促進(jìn)神經(jīng)康復(fù)的作用。

軸突生長錐質(zhì)膜面是GAP-43表達(dá)產(chǎn)物的主要位置，且GAP-43作為一種快速轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸蛋白，與突觸重建、軸突再生以及神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)，該產(chǎn)物于20世紀(jì)80年代初被發(fā)現(xiàn)[2]。GAP-43在腦皮層中的表達(dá)水平在成年時較低，在損傷時則顯著增強(qiáng)，突觸重建、軸突芽生的狀態(tài)也與其表達(dá)強(qiáng)度相一致。因此GAP-43的表達(dá)可以作為常用的腦缺血損傷后的神經(jīng)生長及再生的量化指標(biāo)。本次研究結(jié)果顯示，GAP-43表達(dá)在腦梗死后明顯增加，在缺血再灌注后1周時GAP-43在梗死周圍區(qū)的免疫活性達(dá)到高峰，在2周時開始降低。麻黃堿治療組與自然恢復(fù)組具有相同的GAP-43表達(dá)變化趨勢，且麻黃堿治療組的GAP-43表達(dá)水平在前3個時間點(diǎn)均明顯高于自然恢復(fù)組（P<0.05）。

SYP是一種位于突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合蛋白，其新生突觸的形成可由突觸數(shù)量的增加來提示。其主要作用在鈣依賴性神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中，是蛋白酪氨酸激酶的底物[3]。本次研究中，SYP在梗死周圍區(qū)的免疫活性在1周時開始增高，2周時達(dá)到高峰，3周時開始降低。麻黃堿治療組與自然恢復(fù)組有相同的SYP表達(dá)變化趨勢，且麻黃堿治療組SYP表達(dá)水平在前3個時間點(diǎn)均明顯高于自然恢復(fù)組（P<0.05）。

4? 小結(jié)

本次研究結(jié)果顯示，SYP和GAP-43的表達(dá)強(qiáng)度在麻黃堿治療組中明顯增強(qiáng)，說明對于腦結(jié)構(gòu)再塑而言，麻黃堿有著積極作用。麻黃堿可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)如5-羥色胺、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

本次研究結(jié)果顯示，在各時間點(diǎn)，假手術(shù)組大鼠運(yùn)動功能無明顯改變（P>0.05）;在術(shù)后1周，運(yùn)動功能評分最低的為自然恢復(fù)組，但隨著時間的推移，自然恢復(fù)組的運(yùn)動功能不斷改善;相較于自然恢復(fù)組，麻黃堿治療組運(yùn)動功能恢復(fù)速度明顯更快，且在術(shù)后1、2、3周均明顯快于自然恢復(fù)組（P<0.05）;3組的運(yùn)動功能在術(shù)后4周時均無明顯差異（P>0.05）。在1、2、3周時，免疫組化光密度定量測定結(jié)果顯示麻黃堿治療組GAP-43和SYP的表達(dá)水平均明顯高于自然恢復(fù)組。上述結(jié)論表明，麻黃堿可對腦缺血后動物的運(yùn)動功能恢復(fù)速度進(jìn)行加速，且麻黃堿的加速機(jī)制與促進(jìn)腦內(nèi)結(jié)構(gòu)重建和神經(jīng)重塑的分子表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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