術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色在肺癌浸潤程度診斷中的成效分析

陳惠玉 林潔 陳小巖

作者單位：福建省立醫(yī)院病理科，福建 福州 350001

肺癌是常見的胸部惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率逐年上升[1-2]。2009年，國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布第7版腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（Tumor Node Metastasis），著重強(qiáng)調(diào)肺癌胸膜侵犯在TNM分期中的作用，不論腫瘤大小，將侵犯臟層胸膜的腫瘤歸為T2期[3-4]。彈力纖維（elastic fibers, EFs）是肺內(nèi)支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)的主要骨架[5]，當(dāng)肺部發(fā)生病變時(shí)，EFs也會(huì)發(fā)生一定的改變[6]。病理上應(yīng)用胸膜的EFs染色，能直觀地觀察腫瘤細(xì)胞是否到達(dá)或突破胸膜層，對(duì)肺癌臨床分期及在肺癌治療策略的制定和預(yù)后判斷中起重要作用[7-8]。彈力纖維Gomori醛復(fù)紅染色法完整過程約需時(shí)45～60分鐘，較長時(shí)間的制片染色過程在與冰凍診斷及制片技術(shù)的緊急原則權(quán)衡下，各大醫(yī)院常規(guī)病理工作中，肺組織的彈力纖維染色多于術(shù)后制作并診斷[9]?；诖耍疚闹荚谔接憙?yōu)化彈力纖維染色技術(shù)是否適宜在術(shù)中冰凍進(jìn)行，并為術(shù)中醫(yī)師的手術(shù)決策及時(shí)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

組織標(biāo)本所來源患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：于2018年全年臨床入院診斷為肺癌可疑（ICD-10編碼C34.9001）、收治于我院胸外科、臨床醫(yī)師為其開具術(shù)中冰凍申請(qǐng)、病理肉眼取材時(shí)可見可疑肺結(jié)節(jié)≤2 cm；（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：冰凍肉眼取材時(shí)明確未取到肺被膜、冰凍切片HE染色后鏡下觀察明確診斷為浸潤性肺癌或?yàn)檠仔圆∽兊摹?018年全年收集標(biāo)本117例。男53例，女64例。年齡26～78歲，中位數(shù)為57歲。所有資料經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

采用自身前后配對(duì)設(shè)計(jì)方法，對(duì)符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的組織在術(shù)中冰凍時(shí)采用優(yōu)化彈力纖維染色法進(jìn)行制片和病理讀片診斷，術(shù)后相同組織待石蠟切片后進(jìn)行彈力纖維Gomori醛復(fù)紅染色制片及病理診斷。

1.2.1 取材制片過程 首先，對(duì)新鮮肺組織將其進(jìn)行取材，大小1.5 cm×1.5 cm左右，厚度為3 mm，注意取材時(shí)要保證同時(shí)取到可疑肺結(jié)節(jié)于鄰近肺被膜，然后使用OCT包埋劑（Optimal Cutting Temperature Compound）對(duì)其進(jìn)行包埋，將其放置在LEICA CM 1950冰凍切片機(jī)中，待包埋劑稍凝固即可進(jìn)行冰凍切片，切忌凍過頭，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片2張，厚度約在6 μm。將切片迅速放入裝有AAF液（95%乙醇：40%甲醛：冰醋酸=17：2：1）的立式染缸中，固定數(shù)秒。隨后將已經(jīng)固定的切片使用自來水速洗，取其中一張切片滴染蘇木素液1 min，接著使用濃度為1%的鹽酸乙醇迅速分化。進(jìn)行溫水藍(lán)化和伊紅染色，使用酒精脫水、二甲苯透明化，中性樹膠行封片；另外一張切片進(jìn)行改良后Gomori醛復(fù)紅染色。同一病例待病理醫(yī)師常規(guī)全面取材鏡檢后挑選適宜蠟塊進(jìn)行術(shù)后彈力纖維染色。

1.2.2 染色過程 見表1。

1.2.3 研究中應(yīng)用的試劑 彈力纖維染色試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：MST-8047/8048，批號(hào)1802068048，規(guī)格15 mL）。

1.2.4 觀察指標(biāo) 所有組織切片遵循三級(jí)診斷制度，由住院病理醫(yī)師讀片并下初步診斷，主治病理醫(yī)師復(fù)片，如有疑問再由上級(jí)病理醫(yī)師（副高及以上）審核。本研究中陽性指相應(yīng)染色方法制片后診斷結(jié)果為浸潤性，陰性指診斷結(jié)果為微浸潤或原位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將數(shù)據(jù)結(jié)果用“陽性”或“陰性”二分變量呈現(xiàn)，采用McNemar檢驗(yàn)分析配對(duì)資料結(jié)果是否有差異，用Kappa值來度量測(cè)量結(jié)果的一致性。所有結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察病理特點(diǎn)

切片中富含彈力纖維的組織如血管、肺被膜等呈深紫色波浪狀，背景呈不同程度的淡黃色，二者鏡下呈像無明顯分別，見圖1、圖2。

2.2 診斷結(jié)果

經(jīng)病理學(xué)觀察顯示，使用術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色，陽性患者23例，陰性94例，陽性率為19.66%。對(duì)相同組織進(jìn)行術(shù)后石蠟切片彈力纖維Gomori醛復(fù)紅染色，陽性患者28例，陰性患者89例，陽性率為23.93%。采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)，McNemar檢驗(yàn)結(jié)果為P=0.063，兩法診斷結(jié)果無顯著差異。兩種方法的診斷吻合系數(shù)Kappa=0.875，P=0.000，說明兩種方法的吻合度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且較強(qiáng)。見表2。

3 討論

圖1 術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色顯微鏡下裁圖

圖2 術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色顯微鏡下裁圖

表1 術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色與術(shù)后石蠟切片彈力纖維Gomori 醛復(fù)紅染色方法比較

表2 應(yīng)用兩種彈力纖維染色技術(shù)診斷肺癌浸潤程度的結(jié)果描述

冰凍切片技術(shù)是一種較為常用的術(shù)中病理診斷方法，由于其檢測(cè)迅速，因而能為手術(shù)操作提供較為可靠的依據(jù)，對(duì)于提高手術(shù)效果具有重要的作用[10]。冰凍切片作為一項(xiàng)條件因素要求嚴(yán)格的技術(shù)，臨床和病理醫(yī)師考慮術(shù)中冰凍切片診斷與術(shù)后石蠟切片診斷存在一定漏診率，故對(duì)于肺癌患者的彈力纖維染色常規(guī)采用術(shù)后石蠟切片Gomori醛復(fù)紅染色。如若將肺組織彈力纖維染色診斷結(jié)果提前至術(shù)中，將對(duì)術(shù)中醫(yī)師的手術(shù)決策及患者預(yù)后產(chǎn)生較大臨床意義。本次研究中，采用術(shù)后石蠟切片彈力纖維染色作為對(duì)比，研究結(jié)果顯示同一塊組織術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色診斷結(jié)果與其無顯著差異，可見術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色診斷準(zhǔn)確性較高。并且，從診斷結(jié)果絕對(duì)值差異上看，二者的差異存在于術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色診斷結(jié)果為陰性，而術(shù)后石蠟切片彈力纖維染色診斷為陽性，可能與取材數(shù)量范圍等原因有關(guān)。但這種漏診情況并不影響加做術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色對(duì)臨床術(shù)中醫(yī)師手術(shù)范圍抉擇的指導(dǎo)價(jià)值。

與對(duì)照組的術(shù)后石蠟切片彈力纖維Gomori醛復(fù)紅染色比較，試驗(yàn)組的術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色方法部分步驟時(shí)間縮減，同時(shí)鏡下觀察舒適，顏色清晰，界限分明，將組織彈力纖維染色成深紫色，從而判定彈力纖維的完整性、是否斷裂，進(jìn)而推斷肺癌有無浸潤[11]。二者鏡下呈像無明顯分別，術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色達(dá)到理想的制片效果。我院病理科常規(guī)要求一例術(shù)中冰凍報(bào)告時(shí)限為30 min，開展肺癌術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色能夠在規(guī)定時(shí)限內(nèi)報(bào)送診斷結(jié)果，在最為恰當(dāng)時(shí)刻為手術(shù)醫(yī)師提供診斷和手術(shù)參考依據(jù)，具有一定臨床意義。

在術(shù)中冰凍切片檢測(cè)中，除上述的制片質(zhì)量、工作時(shí)間外，診斷結(jié)果還受檢測(cè)組織、取樣質(zhì)量等因素影響[12]。因此，為保證術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須強(qiáng)調(diào)術(shù)中肺癌組織取樣的規(guī)范性，同時(shí)還要求病理醫(yī)生取材、讀片的質(zhì)量。

綜上所述，針對(duì)肺癌手術(shù)患者，保證病理切片和診斷質(zhì)量前提下，采用術(shù)中冰凍優(yōu)化彈力纖維染色，其準(zhǔn)確率高，為臨床醫(yī)生的手術(shù)方式提供有力依據(jù)，增加手術(shù)醫(yī)生信心，避免患者二次手術(shù)，提高患者預(yù)后。