雷帕霉素抑制肝纖維化病理進(jìn)程的療效及其機(jī)制

肖瀟

我國(guó)為慢性乙型及丙型肝炎高發(fā)病率國(guó)家，易發(fā)生肝纖維化[1]。近年來(lái)，有報(bào)道稱(chēng)成熟肝細(xì)胞上皮間質(zhì)化與肝纖維化有關(guān)；而雷帕霉素體外可抑制肝星狀細(xì)胞增殖，體內(nèi)可抑制四氯化碳致大鼠肝纖維化[2]。本研究探討雷帕霉素對(duì)肝纖維化病理進(jìn)程的抑制作用及其機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性清潔級(jí)SD大鼠80只，鼠齡3～4個(gè)月，體質(zhì)量230～270 g，由西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(陜)2012-003。

二、 主要儀器與試劑

主要儀器包括Kendro低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sorvall公司)、DYNEX MRXⅡ型酶標(biāo)儀(日本Dynex公司)、Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、RM6240B多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)、YP100型壓力換能器(成都儀器廠)、SHHWZICY420型電熱恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)、DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)(上海精宏公司)、DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特)、Kadok DCs-120凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Life Technologies公司)等。主要試劑包括雷帕霉素(華北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20100079)，E-cadherin、Connexin43、Vimentin、α-SMA等抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，四氯化碳油溶液、組織細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光增強(qiáng)劑、兔二抗工作液、DAB顯色劑等均購(gòu)自美國(guó)PIERCE公司。

三、 實(shí)驗(yàn)方法

(一)纖維化動(dòng)物模型制作及用藥 取健康雄性清潔級(jí)SD大鼠32只，依據(jù)3 mL/kg體質(zhì)量皮下注射四氯化碳油溶液40 ml/L，2次/周，持續(xù)8周，制備四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。其中，雷帕霉素干預(yù)組于第6周同時(shí)按2 mg/kg體質(zhì)量行雷帕霉素灌胃處理，1次/d，維持2周。另取16只大鼠納為正常組。所有大鼠均于第8周處死。

(二)標(biāo)本獲取及保存 (1)肝臟組織標(biāo)本：既定時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，開(kāi)腹后于腹主動(dòng)脈取血，完整切離肝臟，分別于各肝葉處取一塊肝臟(厚約4 mm)，甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋處理后將剩余肝臟組織切塊，置入凍存管中，于液氮條件下保存；(2)肝細(xì)胞提?。阂栽患芋w外循環(huán)膠原酶灌注percoll密度梯度離心法，行大鼠肝細(xì)胞分離。大鼠腹腔打開(kāi)后經(jīng)門(mén)靜脈插管，注入肝素鈉抗凝，50 mL注射劑緩慢灌注無(wú)鈣D-HANKS液。沖洗肝臟，干凈后0.05%膠原酶液行肝臟原位灌注，速度10 mL/min，2 min后行肝上下腔靜脈結(jié)扎，將肝臟取出，行膠原酶液灌注至肝組織變軟、蒼白。肝臟抖動(dòng)并鈍性分離細(xì)胞，200鉑不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾后洗滌，離心處理后獲取肝細(xì)胞，置入凍存管，于液氮罐凍存?zhèn)溆谩?/p>

(三)肝臟組織HE染色 (1)肝臟組織切片：切片前將包埋好的標(biāo)本置入-20 ℃冰箱冷凍30 min。切片厚度3～5 μm，于普通載玻片上粘附后于60 ℃條件下烘烤，60 min后取出裝盒；(2)HE染色：石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)PBS沖洗、蘇木青染色、鹽酸酒精分化、PBS漂洗等處理后晾干后中性樹(shù)膠封片，鏡檢。

(四)肝臟組織中α-SMA表達(dá)檢測(cè) (1)載玻片及蓋玻片處理、切片：載玻片洗凈后置入多聚賴(lài)氨酸溶液(經(jīng)1∶10去離子水稀釋)中，浸泡5 min后烘烤裝盒。切片于載玻片上粘附后烘烤裝盒；(2)免疫組化：石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)PBS沖洗、浸泡、滴加二抗工作液、蘇木素復(fù)染等處理后中性樹(shù)膠封片，鏡檢。采用免疫組化檢測(cè)肝組織中α-SMA表達(dá)。

(五)蛋白表達(dá)檢測(cè) 將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用細(xì)胞刷刮下后，經(jīng)勻漿、S-PAGE膠制備、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、結(jié)合一抗、洗滌、曝光顯影、定影HRP-ECL發(fā)光處理后，運(yùn)用Epson彩色圖像掃描儀獲取蛋白質(zhì)信號(hào)條帶圖像。采用Western blot測(cè)定蛋白表達(dá)。

四、觀察指標(biāo)

分析三組肝臟組織α-SMA染色、HE染色結(jié)果，對(duì)比三組E-cadeherin、connexin43、Vimentin、α-SMA表達(dá)，并觀察三組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達(dá)，探討雷帕霉素抑制肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、大鼠肝纖維化模型建立及雷帕霉素干預(yù)效果分析

成功建立四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，模型對(duì)照組和雷帕霉素干預(yù)組在8周時(shí)各有1只死亡，均經(jīng)α-SMA組化、HE染色證實(shí)。經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)雷帕霉素干預(yù)組肝纖維化顯著減輕，經(jīng)免疫組化行經(jīng)α-SMA再次驗(yàn)證。見(jiàn)圖1～2。

正常組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞(黃褐色)表達(dá)少，匯管區(qū)(圖P示處)附近門(mén)靜脈、肝功靜脈、膽管周?chē)w維組織可見(jiàn)；模型對(duì)照組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)高于正常組，結(jié)構(gòu)紊亂，于血管周?chē)梢?jiàn)，且假小葉之間和內(nèi)部出現(xiàn)α-SMA高表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞；雷帕霉素干預(yù)組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞較模型對(duì)照組減少，接近正常組，多見(jiàn)于血管、膽管周?chē)?，肉眼分析其總體陽(yáng)性率接近于正常組陽(yáng)性率。

圖1三組肝臟組織α-SMA染色

正常組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈條索狀自正常中央靜脈(圖V中示處)向四周放射，肝細(xì)胞形呈六邊形，可見(jiàn)清晰肝竇，匯管區(qū)(圖P示處)由膽管、門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈構(gòu)成，結(jié)構(gòu)清楚；模型對(duì)照組肝組織中結(jié)構(gòu)紊亂，假小葉形成明顯，且小葉間與小葉內(nèi)均可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞(圖F示處)，匯管區(qū)及中央靜脈被破壞；雷帕霉素干預(yù)組肝組織中成纖維細(xì)胞較模型對(duì)照組減少，于中央靜脈(圖V示處)處可見(jiàn)，結(jié)構(gòu)不正常，較對(duì)模型對(duì)照組好轉(zhuǎn)。

圖2三組肝臟組織HE染色

二、 雷帕霉素抑制肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制分析

模型對(duì)照組肝臟中肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原表達(dá)較正常組明顯增高(P<0.05)，上皮標(biāo)志物E-cadeherin、connexin43表達(dá)較正常組明顯減少(P<0.05)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin、α-SMA表達(dá)較正常組明顯增高(P<0.05)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4較正常組明顯增高(P<0.05)。雷帕霉素干預(yù)組肝臟內(nèi)肝細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)及Vimentin、α-SMA表達(dá)較模型對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，肝細(xì)胞E-cadeherin、connexin43表達(dá)較模型對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達(dá)較模型對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3～5。

Western blot示與正常組相比，模型對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原表達(dá)明顯升高；與模型對(duì)照組相比，雷帕霉素干預(yù)組Ⅰ型膠原表達(dá)明顯下降(甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)較一致，證實(shí)總蛋白即上樣量基本相同，重復(fù)3次結(jié)果一致)。

圖3三組肝細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原表達(dá)變化

與正常組相比，模型對(duì)照組上皮標(biāo)記明顯減少，間質(zhì)標(biāo)記物明顯增多，即E-cadeherin、connexin43表達(dá)明顯減少，Vimentin、α-SMA表達(dá)明顯增高；與模型對(duì)照組相比，雷帕霉素干預(yù)組上皮標(biāo)記物明顯增多，間質(zhì)標(biāo)記物明顯減少，即E-cadeherin、connexin43表達(dá)明顯增高，Vimentin、α-SMA表達(dá)明顯降低(甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，調(diào)整上樣量差異，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果基本一致)。

圖4三組肝細(xì)胞上皮和間質(zhì)標(biāo)記物變化

與正常組相比，模型對(duì)照組上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達(dá)明顯增多；與模型對(duì)照組相比，雷帕霉素干預(yù)組p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達(dá)明顯下降(甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，調(diào)整上樣量差異，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果基本一致)。

圖5三組肝細(xì)胞內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路重要蛋白表達(dá)變化

討 論

近年來(lái)有研究表明，肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肝纖維化有關(guān)[3]。Nishikawa等[4]采用TGF-β1處理體外培養(yǎng)所致大鼠成熟肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞經(jīng)TGF-β1處理后白蛋白表達(dá)明顯下降，Ⅰ型膠原表達(dá)上升；而TGF-β1處理后尚存活肝細(xì)胞伴上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，推測(cè)肝纖維化中肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化起著重要作用。王川林[5]等發(fā)現(xiàn)，肝纖維化中纖維組織母細(xì)胞部分源于成熟肝細(xì)胞。四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型屬接近肝炎肝纖維化模型。本研究經(jīng)建立該模型發(fā)現(xiàn)，大鼠肝纖維化過(guò)程中成熟肝細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，E-cadeherin、connexin43表達(dá)明顯減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志Vimentin、α-SMA表達(dá)明顯增高，且發(fā)現(xiàn)這類(lèi)肝細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原增多，預(yù)示肝纖維化過(guò)程中肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路重要蛋白p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4明顯增高，進(jìn)一步證實(shí)肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與肝纖維化過(guò)程。

雷帕霉素屬新型免疫抑制劑，其結(jié)合FK結(jié)合蛋白，使細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻，誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖受抑；其中，磷酸酰肌醇激酶相關(guān)激酶調(diào)控諸多翻譯元件蛋白合成，在細(xì)胞大小、增殖中起著調(diào)節(jié)作用，多因雷帕霉素靶蛋白(TOR)對(duì)mRNA翻譯起始具有調(diào)控功能。雷帕霉素作用靶點(diǎn)磷酸酰肌醇激酶相關(guān)激酶屬AKT下游重要基因，而AKT已被證實(shí)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。AKT-mTOR通路調(diào)控細(xì)胞體積、侵襲性，而上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化后其侵襲性增強(qiáng)、體積增大。臨床證實(shí)，雷帕霉素能抑制上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。雷帕霉素提前干預(yù)可使細(xì)胞體積、侵襲性下降，而此種情況在上皮間質(zhì)化過(guò)程中也存在。目前雷帕霉素被廣泛應(yīng)用于移植領(lǐng)域，而腎移植術(shù)后移植腎臟纖維化屬腎移植術(shù)后腎臟慢性失功機(jī)制，細(xì)胞因子(包括TGF-β1等)引起腎臟近端小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終誘發(fā)肝纖維化。Xiang等[6]通過(guò)研究各種免疫抑制劑對(duì)TGF-β1所致腎臟近端小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受抑。而李文文等[7]報(bào)道，雷帕霉素體外、體內(nèi)分別可抑制肝星狀細(xì)胞增殖、四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化。Bridle等[8]發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可抑制TGF-β1、CTGF、PDGF表達(dá)，上調(diào)p27、p21，抑制p70s6k磷酸化，抑制肝纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素干預(yù)組肝細(xì)胞較模型對(duì)照組更接近正常組織中肝細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)，提示阻斷肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是雷帕霉素抑制肝纖維化重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，雷帕霉素干預(yù)組肝臟內(nèi)肝細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)及Vimentin、α-SMA、p-smad2、p-smad3、smad2/3、smad4表達(dá)較模型對(duì)照組明顯下降，肝細(xì)胞E-cadeherin、connexin43表達(dá)較模型對(duì)照組明顯增高，提示雷帕霉素可下調(diào)smad蛋白，而這類(lèi)蛋白在肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中被激活，證實(shí)雷帕霉素可能經(jīng)下調(diào)這類(lèi)蛋白抑制肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而減輕肝纖維化。