HBV相關性腎炎腎組織AIM2水平及其與炎性因子和腎臟炎癥程度的相關性分析

張席軍 李紅莉 趙筱娟

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的肝硬化、肝衰竭或肝癌等疾患對人類健康造成極大危害[1]。HBV感染可引起HBV相關性腎炎(HBV-associated glomerulonephritis，HBV-GN)等多種肝外相關疾病的發(fā)生[2]。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)是HIN-200蛋白家族的重要成員之一，其主要分布于細胞漿中，并且可為胞漿內(nèi)的雙鏈DNA所識別而激活，使得半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)途徑激活，進而可促使多種炎性因子的成熟及釋放，如白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等，可進一步引發(fā)炎癥反應，因此其在機體固有免疫反應而引起的炎癥中發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究通過分析HBV-GN患者腎組織中AIM2水平及其與炎性因子和腎臟炎癥程度的相關性，旨在探討AIM2的激活在HBV-GN中的可能致病機制，進而為加深該病發(fā)病機制的認識及治療提供臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

收集本院2016年1月至2018年8月62例HBV-GN患者(HBV-GN組)和46例慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)患者(CGN組)的臨床資料。其中，HBV-GN組男39例，女23例；年齡22～68歲，平均(37.06±8.86)歲。CGN組男28例，女18例；年齡24～70歲，平均為(38.98±9.84)歲。兩組患者性別和年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

二、腎組織標本的獲取及免疫組織化學檢測

在10%中性甲醛固定液中取出活檢標本，采用石蠟進行包埋，制備組織塊。用乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明30 min，浸蠟60 min。蠟塊包埋后連續(xù)切片，每張切片厚度均為3 μm，將其切片放置在45 ℃溫水中攤片，采用防脫載玻片進行處理，每張載玻片均撈取3塊組織，控干水分，于70 ℃烤片1～2 h后置于切片盒中，于4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。脫蠟，用乙醇進行梯度水化；采用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min；抗原熱修復后，將切片放置在3%過氧化氫溶液中并在室溫下孵育10 min，再用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min；將切片的磷酸鹽緩沖液擦干，各切片上滴加山羊血清50 μL，于室溫下封閉5 min，將多余液體甩去。各切片上滴加一抗50 μL，于37 ℃環(huán)境下孵育60 min；用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min，之后將切片的磷酸鹽緩沖液擦干。在各切片上滴加二步法免疫組織化學檢測試劑50 μL，于37 ℃環(huán)境下孵育20 min；用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。各切片滴加新鮮配制的DAB溶液，于顯微鏡下觀察，用蘇木精復染切片，采用乙醇進行梯度脫水后，中性樹膠封片，最后進行鏡檢。

三、免疫組織化學檢測結(jié)果判讀[5]

陽性表達定義為于顯微鏡下可見棕黃色顆粒，可根據(jù)棕黃色顆粒顯色強度及密度進行表達程度的劃分。隨機選取腎組織中10個高倍鏡的觀察視野，對其陽性細胞數(shù)進行計數(shù)，取其平均值。按照陽性細胞在總細胞數(shù)中的比例進行評分，分為0分：陽性細胞數(shù)的比例≤5%，記為陰性(-)；1分：陽性細胞數(shù)的比例為6%～25%，記為弱陽性(+)；2分：陽性細胞數(shù)的比例為26%～49%，記為陽性(++)；3分：陽性細胞數(shù)的比例≥50%，記為強陽性(+++)。根據(jù)陽性細胞的著色程度進行評分，分為0分：無著色，記為陰性(-)；1分：淡棕黃色，記為弱陽性(+)；2分：棕黃色，記為陽性(+)；3分：深棕黃色，記為強陽性(+++)。將上述陽性細胞數(shù)的評分與著色程度的評分相加，0～1分記為陰性表達(-)，2分記為弱陽性(+)，3～4分記為陽性(++)，5～6分記為強陽性(+++)。其中，陽性表達率=(弱陽性例數(shù)+陽性例數(shù)+強陽性例數(shù))/例數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、免疫組織化學檢測結(jié)果

在HBV-GN患者的腎組織中，AIM2主要分布于腎小球細胞漿中的內(nèi)皮細胞和系膜細胞，且部分可見于腎小管及間質(zhì)內(nèi)。見圖1。二、兩組患者腎組織中AIM2表達水平的比較

HBV-GN組AIM2的陽性表達率為79.03%，較CGN組的32.61%明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者腎組織中AIM2表達水平的比較

三、HBV-GN患者腎組織中AIM2的表達與IL-1β、caspase-1均表達的相關性

采用Spearman相關性分析可發(fā)現(xiàn)，HBV-GN患者腎組織中AIM2的水平與IL-1β、caspase-1均存在正相關關系(r=0.58、0.68，均P<0.01)。見表2。

表2 HBV-GN患者腎組織中AIM2的表達與IL-1β、caspase-1均表達的相關性(例)

討 論

HBV感染程度的不同可導致肝臟出現(xiàn)不同程度的病變，且可導致多種不同程度的肝外表現(xiàn)，而HBV-GN是其中的一種常見病，也是繼發(fā)性腎小球腎炎的常見病因。既往研究報道，在我國各種GN患者中，HBV-GN發(fā)病率為16.6%～32%[6]。目前，有關HBV-GN的具體發(fā)病機制仍未完全定論，但普遍觀點認為該病與免疫反應密切相關[7]。因HBV感染后，抗原成分與抗體產(chǎn)生免疫復合物，并沉積于腎小球血管壁，可進一步引發(fā)機體Ⅲ型變態(tài)免疫反應，使腎小球基底膜受損，紅細胞和蛋白漏出，導致腎臟損傷，最終誘發(fā)HBV-GN的發(fā)生[8]。IL-1β是重要的炎性因子之一，其在CGN的發(fā)生及發(fā)展的病理過程中起到重要作用[9]。作為模式識別受體之一，AIM2具有特異性識別抗原信號的作用，可通過感受細菌或病毒感染時釋放至細胞漿的雙鏈DNA，并通過結(jié)合接頭蛋白ASC，生成炎性復合體——AIM2炎性小體，可進一步促使caspase-1活化，使之裂解IL-18、IL-1β等多種炎癥因子[10]。HBV-GN患者中腎組織的固有細胞內(nèi)存在乙型肝炎病毒樣顆粒和HBV DNA復制，而作為胞漿內(nèi)DNA識別受體之一，AIM2可能在肝細胞中通過識別HBV DNA，促使caspase-1途徑激活，并進一步促進IL-1β等炎性因子釋放，最終導致肝炎的發(fā)生[11]。另有研究認為，DNA識別受體具有識別pg RNA或HBV DNA的作用并可誘導固有免疫反應，這可能是HBV引起肝臟炎癥的一種重要機制，而AIM2與HBV引起肝炎發(fā)生和發(fā)展機制過程中的重要DNA識別受體[12]。

圖1 AIM2在HBV-GN患者腎組織中的表達(HE染色，×400)A：陰性(-)，B：弱陽性(+)，C：陽性(++)，D：強陽性(+++)

本研究發(fā)現(xiàn)，HBV-GN組AIM2的陽性表達率為79.03%，較CGN組的32.61%明顯升高。提示胞漿內(nèi)HBV DNA的發(fā)生可能促使AIM2的表達激活，繼而促使下游炎性復合體激活，引發(fā)固有免疫反應，因此在HBV-GN的炎性過程中發(fā)揮重要作用。并且，本研究經(jīng)Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)，HBV-GN患者腎組織中AIM2水平與IL-1β、caspase-1均存在正相關關系(r=0.58、0.68，P<0.01)。提示AIM2的表達水平可能與HBV-GN患者炎癥進展程度存在一定關系。由此推斷，AIM2可能通過識別且結(jié)合HBV DNA后被激活，使caspase-1活化而產(chǎn)生炎性復合體，促進IL-1β等致前炎性因子成熟、釋放及排泄，從而導致HBV-GN患者腎損傷加重，提示AIM2在HBV-GN腎小球細胞炎性損傷的過程中可能起到重要作用。另外，本研究62例HBV-GN患者中，13例患者出現(xiàn)AIM2表達陰性的原因可能與以下幾點密切相關：①腎臟細胞質(zhì)內(nèi)并無完整的HBV DNA；②腎臟細胞質(zhì)內(nèi)其他雙鏈DNA可感應蛋白質(zhì)，可通過感知HBV DNA而導致炎性損傷；DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物可直接結(jié)合胞質(zhì)內(nèi)雙鏈DNA，促使干擾素調(diào)節(jié)因子3轉(zhuǎn)錄因子的激活，增強TANK2結(jié)合激酶1的活性，可進一步引發(fā)固有免疫反應而造成炎癥的發(fā)生；③通過結(jié)合干擾素誘導蛋白16等其他HIN-200家族蛋白，誘導免疫損傷。

綜上所述，HBV-GN患者腎組織AIM2表達水平明顯升高，且與IL-1β、caspase-1等多種炎性因子水平和腎臟炎癥程度存在密切關系。