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    H1 亞型豬流感病毒微滴數(shù)字RT-PCR定量檢測(cè)方法的建立

    2019-11-04 03:32:36譚建錫禹思宇唐連飛胡憶文侯義宏
    中國動(dòng)物檢疫 2019年11期
    關(guān)鍵詞:微滴亞型核酸

    譚建錫,禹思宇,唐連飛,胡憶文,白 雪,侯義宏

    (1.長(zhǎng)沙海關(guān)技術(shù)中心,湖南長(zhǎng)沙 410004;2.岳陽海關(guān),湖南岳陽 414000;3.常德海關(guān),湖南常德 415000)

    豬流感(swine influenza,SI)是一種嚴(yán)重的呼吸道傳染病,由豬流感病毒(swine influenza virus,SIV)引起,具有急性、高度接觸性、群發(fā)性等特點(diǎn),臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱,不同年齡、性別和品種的豬均能感染,是普遍存在于規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)中的群發(fā)性疾病[1]。豬體內(nèi)混合有禽流感病毒和人流感病毒的受體,較易產(chǎn)生新型的重配病毒。SIV 在豬群中以H1 和H3 為主要流行亞型,因此如何快速有效檢測(cè)H1亞型SIV 越來越受到關(guān)注。目前,流感病毒的快速檢測(cè)主要利用基于分子技術(shù)的普通RT-PCR 和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 等方法[2]。熒光定量RT-PCR法具有較高特異性和靈敏度,應(yīng)用較為廣泛,但其定量測(cè)定需要用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,因而操作耗時(shí)費(fèi)力。

    微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)作為一種新興起的核酸絕對(duì)定量技術(shù),可從溶液中直接獲得樣本拷貝數(shù),而不需要依賴于標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線。其原理是通過極度稀釋,在一定數(shù)目的微滴中分布1 個(gè)或0 個(gè)拷貝,進(jìn)行PCR 單分子擴(kuò)增后,讀取樣本熒光信號(hào),再通過泊松(poisson)分布和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來計(jì)算核酸拷貝數(shù)。由于不依賴建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,且對(duì)低濃度核酸樣品也可進(jìn)行高靈敏度的絕對(duì)定量,使得ddPCR 技術(shù)在核酸絕對(duì)定量領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景[4]。已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道,將該技術(shù)應(yīng)用于偽狂犬病病毒[5]和H7N9 流感病毒的定量研究,但未對(duì)ddPCR 退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,也未見將ddPCR 技術(shù)應(yīng)用于H1 亞型SIV 絕對(duì)定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

    本研究將ddPCR 技術(shù)應(yīng)用于H1 亞型SIV 檢測(cè),并對(duì)其最佳退火溫度、檢出限以及檢測(cè)準(zhǔn)確度等方面進(jìn)行研究,建立了H1 亞型SIV ddRT-PCR絕對(duì)定量檢測(cè)方法,為我國H1 亞型SIV 的實(shí)時(shí)監(jiān)控提供了技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    H1、H3、H5、H7 亞型SIV,以及豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)均為滅活病毒,由長(zhǎng)沙海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 試劑和儀器

    One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes、ddPCR droplet generation oil for Probes、Droplet Reader Oil:購自美國伯樂公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit:購自QIAGEN 公司;一步法qRTPCR 試劑(EvoScript RNA Probes Master):購自瑞士羅氏公司;PX1 熱封儀、微滴式數(shù)字PCR 儀:QX200伯樂;梯度PCR擴(kuò)增儀:LabCycler 96,德國;熒光PCR 儀:LC480 羅氏。

    1.3 引物設(shè)計(jì)

    將GenBank 數(shù)據(jù)庫中的H1 亞型SIV HA 基因序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析,選出高度保守且特異的區(qū)域(1 536~1 692 bp),利用Oligo 及Primer Premier 軟件,設(shè)計(jì)并合成特異性引物和TaqMan熒光探針。試驗(yàn)中用到的引物及探針序列見表1,所有引物及探針均由Invitrogen 公司合成。

    表1 H1 亞型SIV ddRT-PCR 引物和探針序列

    1.4 RNA 提取

    按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒說明書,提取H1、H3、H5 和H7 亞型流感病毒以及PRRSV、CSFV 等病毒的基因組RNA,并將提取好的RNA 保存于-80 ℃冰箱中備用。

    1.5 ddPCR 反應(yīng)方法構(gòu)建

    反應(yīng)體系(20 μL):4×Supermix 5 μL,上、下游引物終濃度均為900 nmol/L,探針終濃度為250 nmol/L,以及300 nmol/L DTT 1 μL、RNA 模板2 μL,用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。

    微滴生成:將20 μL 反應(yīng)液和70 μL 微滴生成油,分別加入到微滴生成卡DG8 的中間和最后一排的各孔中,用專用膠墊覆蓋后,放置于微滴生成儀上,自動(dòng)生成微滴于第1 排;吸取40 μL 油滴加入96 孔板內(nèi)。

    封膜及擴(kuò)增:將96 孔板放置于PX1 熱封儀上,設(shè)置程序180 ℃ 10 s 進(jìn)行封膜;之后,將封好膜的96 孔板放入梯度PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min;95 ℃15 s,最佳退火溫度1 min,40 個(gè)循環(huán)。

    數(shù)據(jù)讀取及分析:將96 孔板放入QX200 微滴式數(shù)字PCR 儀中讀取信號(hào),獲得試驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析。陰性對(duì)照中的模板用水代替。

    1.6 退火溫度條件優(yōu)化

    在PCR 儀上設(shè)置擴(kuò)增溫度梯度,退火梯度范圍為55~61 ℃,溫度間隔1 ℃,共7 個(gè)溫度梯度。按照1.5 中的操作,對(duì)應(yīng)設(shè)置PCR 擴(kuò)增溫度后進(jìn)行反應(yīng),并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;用RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn),重復(fù)3 次,求平均值,確定最佳退火溫度。

    1.7 靈敏性及重復(fù)性試驗(yàn)

    將H1 亞型SIV 核酸進(jìn)行10 倍梯度稀釋,并以此為模板,取2 μL 用已建立的ddRT-PCR 方法,測(cè)定最低檢出限,并繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照1.5 和1.6 篩選出的最佳條件設(shè)置。試驗(yàn)操作重復(fù)3 次,計(jì)算變異系數(shù),進(jìn)行重復(fù)性評(píng)估。

    1.8 特異性試驗(yàn)

    以H1、H3、H5 和H7 亞型SIV,以及PRRSV、CSFV 核酸為模板進(jìn)行特異性檢測(cè)。

    1.9 臨床應(yīng)用

    將從湖南省規(guī)?;i場(chǎng)收集到的30 份豬鼻拭子樣品提取核酸后,分別用本試驗(yàn)建立的ddRTPCR 方法和qRT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè),對(duì)比檢測(cè)結(jié)果的一致性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ddRT-PCR 方法建立

    根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)和試驗(yàn)指南,制備ddPCR 反應(yīng)體系,對(duì)體系退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化,建立了H1亞型SIV ddRT-PCR 檢測(cè)方法。結(jié)果(圖1)顯示,退火溫度55~61 ℃范圍內(nèi)均有熒光信號(hào)被檢出,陰陽性微滴有明顯分界,且在57~58 ℃時(shí)出現(xiàn)最大擴(kuò)增振幅;當(dāng)溫度為55 ℃時(shí),陰陽性微滴中間略微存在彌散;當(dāng)退火溫度為56~61℃時(shí),陰陽性微滴中間彌散較少,可能因溫度太低引起的擴(kuò)增特異性略有降低。綜合考慮,選擇58 ℃作為反應(yīng)最佳退火溫度。

    圖1 H1 亞型SIV ddPCR 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

    隨著樣本核酸濃度依次降低,由左到右(A03—H03),反應(yīng)體系中陽性微滴數(shù)量(藍(lán)色點(diǎn))逐漸減少;相對(duì)應(yīng)的,同體系中陰性反應(yīng)的微滴數(shù)目(黑色點(diǎn))則逐漸增加,顏色不斷變深(圖2)。直方圖(圖3)顯示,陽性微滴峰的熒光強(qiáng)度普遍較高,而陰性微滴峰的熒光強(qiáng)度較低,且兩者之間存在明顯區(qū)分,無雜峰。以上結(jié)果說明,建立的H1 亞型SIV ddRT-PCR 方法有較高的可靠性。

    圖2 不同濃度下的H1 亞型SIV ddRT-PCR 散點(diǎn)圖

    圖3 不同濃度下的H1 亞型SIV ddRT-PCR 直方圖

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測(cè)限

    分別用核酸稀釋度和陽性拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4),發(fā)現(xiàn)線性方程為y=-1.068 2x+5.855 6,線性關(guān)系R2值為0.994,最低檢測(cè)限為4.7 copies/μL,表明此方法具有較好的線性關(guān)系。

    圖4 H1 亞型SIV ddRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2.3 ddPCR 重復(fù)性分析

    利用建立的ddPCR 方法,對(duì)同一核酸模板進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)均〈5%,證明所建立的ddPCR 檢測(cè)方法重復(fù)性良好,檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、可靠(表2)。

    表2 微滴式ddRT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

    2.4 ddPCR 特異性試驗(yàn)

    以H1、H3、H5 和H7 亞型SIV 以及PRRSV和CSFV 的基因組RNA 為模板進(jìn)行ddRT-PCR 擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)各孔微滴的生成量比較均衡,能夠滿足試驗(yàn)成立條件。由圖5 可知,僅H1 亞型SIV 檢測(cè)孔出現(xiàn)陽性微滴,H3、H5、H7 亞型SIV,以及PRRSV、CSFV 和陰性對(duì)照孔中,均未檢測(cè)到陽性微滴信號(hào),即與其他病毒均無交叉反應(yīng),表明該方法檢測(cè)H1 亞型SIV 核酸具有良好的特異性。

    圖5 H1 亞型SIV ddPCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

    2.5 臨床樣品驗(yàn)證

    將30 份豬鼻拭子樣品提取RNA 后,分別用本試驗(yàn)建立的ddRT-PCR 方法以及qRT-PCR 方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)2 份樣品均檢測(cè)為陽性,其余28份樣品均檢測(cè)為陰性,表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致,符合率為100%。

    3 討論

    H1 亞型動(dòng)物流感一直威脅著畜禽業(yè)的發(fā)展,同時(shí)也威脅著人類健康[7]。傳統(tǒng)的熒光RT-PCR 方法被廣泛用于流感病毒的定性檢測(cè),但其定量檢測(cè)需要依賴外標(biāo)對(duì)樣品初始拷貝數(shù)定量后再進(jìn)行測(cè)定,操作過程耗時(shí)費(fèi)力[8]。隨著新技術(shù)的發(fā)展,也有其他新方法被用于流感病毒的定量檢測(cè)。王瀟等[9]利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RT-RPA)對(duì)H1 亞型動(dòng)物流感進(jìn)行檢測(cè),最低可檢測(cè)到的病毒核酸濃度為0.96×10-2g/mL。劉文俊等[10]建立動(dòng)物H1 亞型流感病毒(IV)的重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條(RPA-LFD)檢測(cè)方法,可檢測(cè)到最低濃度為10 copies/μL 的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。ddPCR 的最高檢測(cè)拷貝數(shù)約為2×104copies/μL,初始濃度過高時(shí),不符合泊松分布,無法實(shí)現(xiàn)對(duì)陽性微滴數(shù)的檢測(cè)[5]。

    數(shù)字微滴PCR 技術(shù)具有對(duì)反應(yīng)條件要求較低、抑制劑對(duì)反應(yīng)影響較小[11]、可檢測(cè)到單個(gè)拷貝、不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線等優(yōu)點(diǎn),使其在病毒定量檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。本研究通過ddPCR 技術(shù),建立了H1 亞型SIV 絕對(duì)定量方法,確定了最佳退火溫度、核酸濃度范圍及最低檢出限,實(shí)現(xiàn)了直接得出樣品中病毒核酸拷貝數(shù)的絕對(duì)定量和高靈敏度檢測(cè),為病毒的定量檢測(cè)提供了一種新思路。ddRTPCR 也有其不足之處,目前微流控微滴芯片單次生成量較低,大量樣品需多次操作,大多數(shù)儀器僅配置1~2 重?zé)晒庑盘?hào)通道,因此多重?zé)晒鈾z測(cè)方面還需加強(qiáng)。隨著未來技術(shù)的進(jìn)步,高通量微流控微滴生成芯片的研制及高重?zé)晒庑盘?hào)通道的出現(xiàn),會(huì)大大提高ddPCR 技術(shù)的檢測(cè)效率,將會(huì)推動(dòng)其在更大領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

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