山羊痘病毒與小反芻獸疫病毒雙重PCR 檢測(cè)方法的建立

王璐瑤，宮英闌，郝雪飄，王建昌，張若曦，袁萬(wàn)哲，4

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001；2.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊 050051；3.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050035；4.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001）

羊痘又名“羊天花”，是由羊痘病毒屬病毒引起的一種熱性、急性、接觸性羊傳染病，被我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物疫病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病。山羊痘病毒（goat pox virus，GTPV）是羊痘病毒屬中的一種。羊痘的典型癥狀為發(fā)熱、呼吸急促、鼻腔流黏液性鼻涕、在無(wú)毛或少毛部位皮膚發(fā)生丘疹和皰疹。易感羊群的羊痘病死率在10%～100%之間，羔羊病死率可高達(dá)100%，懷孕母羊會(huì)極易發(fā)生流產(chǎn)情況，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致羊群生產(chǎn)力和羊毛品質(zhì)大幅降低。因此，羊痘給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)國(guó)際貿(mào)易和養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展也有嚴(yán)重影響[1]。

小反芻獸疫又名“偽牛瘟”，是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性（亞急性）、熱性、傳染性小反芻動(dòng)物疾病。其典型癥狀為發(fā)熱、眼睛和鼻腔分泌物增多、腹瀉、呼吸異常、口腔內(nèi)出現(xiàn)壞死性病灶等，發(fā)病率在80%～90%之間，死亡率在50%～80%之間，有時(shí)可高達(dá)100%[2]。小反芻獸疫病程急，主要感染綿羊和山羊，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展。因此，我國(guó)將小反芻獸疫也列為一類(lèi)動(dòng)物疫病，OIE 同樣將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[2]。

當(dāng)羊群感染羊痘或小反芻獸疫時(shí)，均有發(fā)熱、眼鼻分泌物增多、皮膚發(fā)生疤疹和潰瘍等相似特征性癥狀，單從臨床癥狀上難以將其區(qū)分與確診。這兩種疫病一旦發(fā)生，無(wú)論哪一種都會(huì)對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重影響。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)方法，對(duì)羊痘和小反芻獸疫的診斷與防控非常重要。目前，常規(guī)PCR 方法無(wú)法對(duì)這兩種病原在同一體系內(nèi)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。本研究通過(guò)對(duì)PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了山羊痘和小反芻獸疫雙重PCR 檢測(cè)方法，為山羊痘和小反芻獸疫的臨床診斷、疫情監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)研究提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 GTPV：從山羊痘活疫苗（痘必應(yīng)）中獲得，購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；PPRV：從小反芻獸疫活疫苗中獲得，購(gòu)自天康生物股份有限公司；羊口瘡病毒（ORFV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）：由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 儀器設(shè)備與主要試劑 TGL-16 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：購(gòu)自湖南塞特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PCR 儀：購(gòu)自北京鼎昊源科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：購(gòu)自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)GB0X-F3：購(gòu)自美國(guó)基因有限公司；DNA/RNA 柱提法提取試劑盒：購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司；EasyScript? RT、Ribonuclease Inhibitor：由全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供。其他試劑還包括，10×Buffer、rTaq酶、DL 2 000 bp DNA Maker。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 上登錄的PPRV、GTPV 兩種病毒的基因序列，由上海生工生物工程有限公司擴(kuò)增PPRV 和GTPV 的PCR 引物，所有序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)度

1.2.2 病毒核酸提取 根據(jù)DNA/RNA 柱提法提取試劑盒（哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司）說(shuō)明書(shū)，提取羊痘疫苗總DNA 與小反芻獸疫疫苗株的總RNA，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒RNA 反轉(zhuǎn)錄 對(duì)小反芻獸疫疫苗株總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20 μL 體系如下：RNA 10.5 μL、下游引物 2.0 μL、5×ES Buffer 4.0 μL、dNTPs 2.0 μL、ESRT 1.0 μL、RRI 0.5 μL。按 以上順序，用移液槍將其加入1.5 mL 離心管內(nèi)，然后放入42 ℃水浴鍋內(nèi)反轉(zhuǎn)錄1 h，得到的產(chǎn)物為PPRV 的cDNA。

1.2.4 常規(guī)PCR 檢測(cè) 對(duì)提取的GTPV DNA和PPRV cDNA 分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 體系（20 μL）為：上下游引物各0.5 μL，dNTPs 1.6 μL、10×Buffer 2 μL、rTaq酶0.1 μL、模 板2 μL，ddH2O 13.3 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。兩個(gè)基因所用PCR 程序相同，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 雙重PCR 條件優(yōu)化 使用超微量分光光度計(jì)，對(duì)GTPV DNA 與PPRV cDNA 濃度分別進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GTPV DNA 濃度為28.3 ng/μL，PPRV cDNA 濃度為645.9 ng/μL。由于核酸濃度差距較大，將模板與引物比例進(jìn)行了優(yōu)化，具體見(jiàn)表2。將提取出的GTPV DNA 和PPRV cDNA 進(jìn)行雙重PCR，在20 μL 體系中，按表2 中的引物比例，加入4 條引物以及dNTPs 1.6 μL、10×Buffer 2 μL、rTaq酶0.1 μL；模 板GTPV DNA 與PPRV cDNA按照表2 中比例加入，用ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。按上述PCR 程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.6 特異性檢測(cè) 通過(guò)對(duì)GTPV 的DNA、PPRV 的cDNA、ORFV 的DNA、BVDV 的cDNA，按照上述方法進(jìn)行雙重PCR，檢測(cè)該方法的特異性。

1.2.7 敏感性檢測(cè) 將提取的GTPV DNA 和PPRV cDNA 混合后進(jìn)行10 倍系列稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述雙重PCR 優(yōu)化好的體系與程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳。

表2 體系中模版與引物的用量 單位：μL

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR 鑒定

使用常規(guī)PCR 方法，對(duì)PPRV 和GTPV 進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PPRV 陽(yáng)性樣本擴(kuò)增條帶大小為385 bp，GTPV 陽(yáng)性樣本擴(kuò)增條帶為969 bp，均與預(yù)期條帶大小相符（圖1）。

圖1 常規(guī)PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 雙重PCR 模板與引物比例優(yōu)化

將模板與引物，按照不同比例進(jìn)行PCR 反應(yīng)，并在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。由圖2 可知，模板GTPV 與PPRV 之間最適比例為4:1，引物最適比例為17:3。

2.3 雙重PCR 特異性檢測(cè)

按照雙重PCR 優(yōu)化條件，將含有GTPV 和PPRV 核酸樣品的混合物以及GTPV、PPRV、ORFV、BVDV 進(jìn)行特異性檢測(cè)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出與預(yù)期目標(biāo)相符的969 bp 和385 bp目的片段，而其他病原未出現(xiàn)條帶（圖3）。

圖2 模板與引物條件優(yōu)化結(jié)果

圖3 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.4 雙重PCR 敏感性檢測(cè)

用超微量分光光度計(jì)測(cè)得的GTPV DNA 濃度為28.3 ng/μL，PPRV cDNA 濃度為645.9 ng/μL。條件優(yōu)化后，對(duì)GTPV DNA 與PPRV 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合后，作10 倍系列稀釋?zhuān)Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，GTPV 的最低檢出量為0.283 ng/μL，PPRV 的最低檢出量為6.459 ng/μL（圖4）。

3 討論

羊痘初期可能只是個(gè)別發(fā)病，但其流行非?？欤笃跁?huì)很快誘發(fā)全群感染[3]。我國(guó)山羊痘和綿羊痘疫情主要發(fā)生于新疆、甘肅、寧夏、青海、陜西、福建、貴州等地，對(duì)我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展影響嚴(yán)重。伴隨著國(guó)際貿(mào)易日益頻繁，該病在近年來(lái)流行范圍有逐步擴(kuò)大的趨勢(shì)[4]。為降低羊痘帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生安全問(wèn)題，建立一種快速、高效、準(zhǔn)確、操作方便、成本低的檢測(cè)方法具有重要意義。

近年來(lái)，小反芻獸疫發(fā)生也呈上升趨勢(shì)，在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)不斷蔓延。2007 年小反芻獸疫首次傳入我國(guó)西藏地區(qū)。此后，國(guó)內(nèi)其他地方陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病。因此，掌握 PPRV 快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)了解該病的國(guó)內(nèi)流行狀態(tài)和對(duì)該病的防治工作有重大意義[5]。

圖4 敏感性檢測(cè)結(jié)果

目前，對(duì)于臨床癥狀相似的病毒性疾病，如羊痘和小反芻獸疫，僅通過(guò)簡(jiǎn)單的臨床檢查很難作出準(zhǔn)確判斷，有可能導(dǎo)致誤診，從而影響最佳防治時(shí)間。因此，在這種情況下，通過(guò)PCR 技術(shù)可以準(zhǔn)確確診疫情。多重PCR 技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)的一種新技術(shù)，比傳統(tǒng)PCR 技術(shù)具有更高效、更經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)多重PCR 反應(yīng)體系中，影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素是不同基因的引物濃度、退火溫度、底物濃度是否達(dá)到平衡。在建立多重PCR 反應(yīng)體系時(shí)，需要不斷優(yōu)化多重PCR 不同基因的引物濃度，因?yàn)椴煌蛞锏臐舛却钆鋾?huì)影響相應(yīng)基因的擴(kuò)增量。調(diào)整體系中各種引物比例，可增加難擴(kuò)增基因的引物量，減少易擴(kuò)增基因的引物量[6]。本研究中就遇到了類(lèi)似問(wèn)題，需要對(duì)引物濃度和核酸模板濃度比例進(jìn)行優(yōu)化。因此，在研究中合理設(shè)計(jì)引物、優(yōu)化最佳多重PCR 體系及反應(yīng)條件，可增加其靈敏度和特異性，減少出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增、假陰性、假陽(yáng)性概率[7]。研究人員可以在每次試驗(yàn)中設(shè)立嚴(yán)格的陰陽(yáng)性對(duì)照，防止非特異性擴(kuò)增，減少假陰性、假陽(yáng)性對(duì)結(jié)果的影響。

在以后的試驗(yàn)中，將進(jìn)一步開(kāi)展所建立方法對(duì)臨床樣品檢測(cè)應(yīng)用研究，提高該方法的實(shí)用性。

4 結(jié)論

本研究在GTPV 和PPRV 常規(guī)PCR 的基礎(chǔ)上，建立了雙重PCR 的方法。通過(guò)敏感性和特異性試驗(yàn)，證實(shí)該方法可同時(shí)完成PPRV、GTPV 兩種病原的檢測(cè)，可用于疫病的臨床鑒別與診斷。本研究建立的雙重PCR 方法對(duì)于這兩種疫病的臨床檢測(cè)與防控提供了有力技術(shù)支撐。