工業(yè)微生物遺傳和環(huán)境擾動(dòng)的調(diào)控和適應(yīng)進(jìn)化

藺玉萍，王欽宏

工業(yè)微生物遺傳和環(huán)境擾動(dòng)的調(diào)控和適應(yīng)進(jìn)化

藺玉萍，王欽宏

中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

開發(fā)工業(yè)微生物，使其利用可再生的原料生產(chǎn)生物燃料、大宗化學(xué)品、食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)品、藥物以及工業(yè)酶等，是發(fā)展生物產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。工業(yè)微生物高產(chǎn)和脅迫抗性等魯棒性狀受復(fù)雜遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，其改造需要從全基因組尺度進(jìn)行系統(tǒng)的全局的多位點(diǎn)的擾動(dòng)，以達(dá)到快速積累多樣性基因型突變并產(chǎn)生所期望的表型。文中對(duì)工業(yè)微生物魯棒性狀的遺傳調(diào)控與脅迫響應(yīng)機(jī)制、基因組全局?jǐn)_動(dòng)與多位點(diǎn)快速進(jìn)化以及細(xì)胞水平氧還平衡的全局?jǐn)_動(dòng)進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述，未來(lái)需要繼續(xù)借助系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)手段，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)工業(yè)環(huán)境下工業(yè)微生物魯棒性狀調(diào)控機(jī)理的解析與建模預(yù)測(cè)以及系統(tǒng)的工程改造。

遺傳調(diào)控，環(huán)境脅迫，基因組全局?jǐn)_動(dòng)，多位點(diǎn)快速進(jìn)化

在自然環(huán)境條件下，地球的生命經(jīng)歷了上億年的進(jìn)化，擁有了精細(xì)而復(fù)雜的遺傳調(diào)控系統(tǒng)，以支撐其適者生存和繁殖的性狀。然后在人類上千年的馴化過(guò)程中，一些天然動(dòng)植物和微生物被自覺與不自覺地改造，演化出積累特定產(chǎn)物以滿足人類需要的性狀，彼時(shí)人類對(duì)性狀與遺傳之間的關(guān)系還知之甚少，這個(gè)過(guò)程主要借助于自然環(huán)境的篩選壓力[1]。生物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，獲得特有的生物魯棒性，從而具備在特定環(huán)境下的生存能力和競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。生物魯棒性是指生物系統(tǒng)在受到環(huán)境變化、隨機(jī)事件 (或細(xì)胞內(nèi)噪聲) 和遺傳變異等不確定干擾時(shí)保持其表型穩(wěn)定性的一種特性，是所有生物系統(tǒng)所進(jìn)化出來(lái)的固有特性[2-3]。伴隨百年工業(yè)發(fā)展史和生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，工業(yè)微生物需要暴露在更為復(fù)雜更為嚴(yán)苛的工業(yè)環(huán)境條件下完成高產(chǎn)高效的生產(chǎn)任務(wù)。工業(yè)微生物的魯棒性狀體現(xiàn)在能夠應(yīng)對(duì)復(fù)雜多樣的惡劣工業(yè)環(huán)境，并且具有與正常環(huán)境下可比擬的生產(chǎn)性能[4-5]。現(xiàn)代生物產(chǎn)業(yè)不僅要求工業(yè)微生物具有高產(chǎn)高效的魯棒性狀，還能夠兼容擴(kuò)展底物譜和產(chǎn)物譜，以滿足人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的需求[2]。解析工業(yè)微生物魯棒性狀和適配性的遺傳調(diào)控規(guī)律，是構(gòu)建高性能工業(yè)微生物以滿足現(xiàn)代生物制造需求的基礎(chǔ)?，F(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展正從認(rèn)知生命邁向創(chuàng)造生命，不僅為解析工業(yè)環(huán)境條件下的生物遺傳和適應(yīng)機(jī)制提供了強(qiáng)有力工具，而且為人工創(chuàng)制工業(yè)微生物的新性狀提供依據(jù)。

雖然針對(duì)生物復(fù)雜性狀的遺傳調(diào)控機(jī)制已經(jīng)開展了大量的研究，但是由于細(xì)胞代謝、基因調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等網(wǎng)絡(luò)及其之間相互關(guān)系的復(fù)雜性，加之工業(yè)環(huán)境條件下細(xì)胞暴露在各種脅迫壓力下，對(duì)于工業(yè)環(huán)境下細(xì)胞的響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制，我們的理解尚有限。常規(guī)的育種手段耗時(shí)、耗成本、耗勞動(dòng)力，想要克服這些問(wèn)題，需要從系統(tǒng)全局的角度出發(fā)，整合最先進(jìn)的系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)和進(jìn)化工程工具并不斷迭代來(lái)克服[7-8]，不斷加深對(duì)工業(yè)微生物遺傳調(diào)控機(jī)制的理解，從而開發(fā)遺傳穩(wěn)定的、魯棒的、適配的工業(yè)微生物。本文從基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用兩個(gè)角度總結(jié)了工業(yè)微生物遺傳調(diào)控和脅迫響應(yīng)機(jī)制以及系統(tǒng)全局改造的研究進(jìn)展，進(jìn)而探討未來(lái)工業(yè)微生物學(xué)在性狀的遺傳解析和改造方面所面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展方向。

1 工業(yè)微生物魯棒性狀的遺傳調(diào)控與脅迫響應(yīng)機(jī)制

伴隨系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的發(fā)展，我們所能駕馭的工業(yè)微生物已經(jīng)開始突破原有的局限，不僅僅局限于傳統(tǒng)發(fā)酵所使用的天然生產(chǎn)者和常規(guī)代謝工程的底盤細(xì)胞[9-11]，比如大腸桿菌[12]、釀酒酵母[13]、放線菌[14]、枯草芽孢桿菌[15]等，還包括近年來(lái)廣受重視的非常規(guī)工業(yè)微生物，比如解脂耶氏酵母[16]、假單胞菌[17]、需鈉弧菌[18]等，從而大大擴(kuò)展了工業(yè)微生物技術(shù)的底物譜和產(chǎn)品譜。常規(guī)底盤細(xì)胞具有相對(duì)成熟的工業(yè)應(yīng)用和長(zhǎng)期的工程改造研究。與之相比，非常規(guī)工業(yè)微生物的應(yīng)用潛力近年來(lái)才逐漸被鑒定、認(rèn)識(shí)和開發(fā)。以研發(fā)用于生產(chǎn)生物燃料的工業(yè)微生物為例，通過(guò)利用和改造微生物的脂肪酸生物合成來(lái)生產(chǎn)高級(jí)生物燃料已經(jīng)有大量的研究。這些研究主要是以大腸桿菌和釀酒酵母為宿主菌，通過(guò)引入外源或強(qiáng)化內(nèi)源脂肪酸合成途徑、抑制競(jìng)爭(zhēng)途徑以及體內(nèi)群體質(zhì)量控制系統(tǒng) (PopQC) 持續(xù)篩選高性能菌株等手段，提高工程菌株積累各種高級(jí)生物燃料的生產(chǎn)性能[19-22]。然而，目前這些菌株的生產(chǎn)性能尚不能完全滿足產(chǎn)業(yè)化的要求。近幾年來(lái)，研究人員把目光投向產(chǎn)油微生物的開發(fā)，其中最具代表性的是解脂耶氏酵母[23]和不透明紅球菌[24]。解脂耶氏酵母被認(rèn)為是非致病性的安全菌種。圍繞解脂耶氏酵母的改造，其合成生物學(xué)工具已經(jīng)日益成熟，包括DNA組裝技術(shù)、構(gòu)建表達(dá)盒的DNA元件、基因組編輯技術(shù)以及基因組尺度代謝模型的構(gòu)建等，使得該菌也可以作為生產(chǎn)醫(yī)藥化合物和食品添加劑的良好底盤細(xì)胞[25]。最近，韓國(guó)KAIST研究所的研究人員采用系統(tǒng)代謝工程的策略，將不透明紅球菌改造為高級(jí)生物燃料的高產(chǎn)菌，從而為化學(xué)品和燃料的可持續(xù)生產(chǎn)提供了新的可能性[24]。此外，非常規(guī)微生物還可以作為新型功能元件的來(lái)源。木糖發(fā)酵真菌的比較基因組學(xué)研究挖掘了一些與木糖代謝有關(guān)的基因，能夠顯著提高釀酒酵母工程菌的木糖利用，從而促進(jìn)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物燃料過(guò)程中菌株的研發(fā)[26]。高度多樣化的子囊菌酵母能夠?qū)⒍喾N底物轉(zhuǎn)化成乙醇、脂類、維生素等具有工業(yè)應(yīng)用潛力的產(chǎn)物，并且能夠在極端的溫度、高鹽和pH條件下生長(zhǎng)。對(duì)這些酵母的比較基因組學(xué)研究揭示了與有用的代謝性狀所關(guān)聯(lián)的基因和遺傳基礎(chǔ)，不僅有助于相關(guān)生物合成途徑的工程改造，而且為篩選有應(yīng)用潛力的工業(yè)細(xì)胞底盤提供依據(jù)[27]。因此，非常規(guī)微生物相關(guān)系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的研發(fā)，對(duì)于拓展工業(yè)微生物的應(yīng)用以及揭示其魯棒性狀的遺傳基礎(chǔ)都將是不可或缺的。

總的來(lái)講，對(duì)于天然生產(chǎn)者而言，比如用于食品和飲料發(fā)酵的微生物，通常在特定的人為環(huán)境下不斷馴化，獲得了與之相適應(yīng)的魯棒性能，包括高效利用特定底物、應(yīng)對(duì)特定工業(yè)壓力以及積累理想的化合物。而且不同工業(yè)環(huán)境來(lái)源的同一物種的不同譜系，呈現(xiàn)基因型和表型多樣性?；诖笠?guī)模的基因組測(cè)序，逐漸揭示這些多樣性產(chǎn)生的遺傳調(diào)控方式包括：種間雜交、基因水平轉(zhuǎn)移、拷貝數(shù)變異、基因組衰退、染色體重排等[1]。以被人類長(zhǎng)期馴養(yǎng)的、用來(lái)生產(chǎn)啤酒和葡萄酒的酵母為例，用于生產(chǎn)拉格 (Lager) 啤酒的工業(yè)菌株巴氏酵母，是釀酒酵母和貝酵母的雜交種，融合了前者強(qiáng)勁的發(fā)酵能力和后者的耐寒性狀，從而能夠進(jìn)行低溫發(fā)酵[28]。在許多用于生產(chǎn)葡萄酒的釀酒酵母菌株的基因組中，有一段約158 kb的區(qū)域是通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移來(lái)自于另外一種酵母菌小捕有胞圓酵母，該區(qū)域含有編碼寡聚肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，能使菌株利用寡聚肽為氮源，從而可以在氮源受限的葡萄酒發(fā)酵環(huán)境中依然具有發(fā)酵活力[29]。此外，葡萄酒酵母耐受亞硫酸鹽性能與馴養(yǎng)過(guò)程中染色體間發(fā)生重排有關(guān)，和基因上游5′區(qū)域非常短的序列之間發(fā)生微同源末端重組介導(dǎo)的不等交換，導(dǎo)致8號(hào)和16號(hào)染色體之間發(fā)生易位，從而使的表達(dá)水平提高。基因編碼亞硫酸鹽泵，進(jìn)而賦予菌株更高的亞硫酸鹽抗性[30]。葡萄酒酵母的銅脅迫抗性和啤酒酵母高效發(fā)酵麥芽糖和麥芽三糖的性能則分別是由于其基因組中存在高拷貝的基因 (編碼銅結(jié)合蛋白)[31]和基因 (編碼麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和水解酶)[32]。用于乳制品生產(chǎn)的乳酸乳球菌，其在牛奶環(huán)境的馴化過(guò)程同樣也伴隨著基因組衰退以及通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得特異利用蛋白質(zhì)和乳糖的基因[33]。對(duì)于用于工程改造的底盤細(xì)胞而言，所引入的外源代謝途徑往往需要遵循宿主本身的遺傳調(diào)控規(guī)律，包括遺傳操作系統(tǒng)、啟動(dòng)子和終止子、編碼區(qū)的密碼子偏好性、轉(zhuǎn)錄翻譯及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，或者通過(guò)引入合成的調(diào)控系統(tǒng)，最終與細(xì)胞內(nèi)源的代謝相平衡[5,34-36]。

與自然界環(huán)境相比，工業(yè)微生物所面臨的脅迫壓力更復(fù)雜更嚴(yán)苛，主要總結(jié)為以下幾個(gè)方面 (圖1)[37-38]：1) 外源代謝途徑的引入，可能會(huì)造成合成外源蛋白的翻譯負(fù)擔(dān)、非折疊蛋白反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡、蛋白分泌系統(tǒng)壓力、代謝通量負(fù)擔(dān)、破壞氧化還原平衡等；2) 與底物相關(guān)的脅迫，包括高濃度底物造成的高滲壓力、抑制物等[39]；3) 中間代謝產(chǎn)物和/或終產(chǎn)物積累帶來(lái)的壓力和毒性；4) 環(huán)境壓力：異常溫度、異常pH、有機(jī)無(wú)機(jī)酸、抑制化合物、營(yíng)養(yǎng)缺乏、靜壓、氧化脅迫、其他生物競(jìng)爭(zhēng)等。一方面，作為系統(tǒng)生物學(xué)的一項(xiàng)技術(shù)，組學(xué)分析被廣泛應(yīng)用于從系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)的層面解析細(xì)胞應(yīng)對(duì)不同水平脅迫壓力的響應(yīng)機(jī)制；另一方面，反向代謝工程獲得的突變菌株，經(jīng)過(guò)組學(xué)分析，揭示突變表型背后的遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定和挖掘與提高脅迫抗性和生產(chǎn)性能相關(guān)的候選目標(biāo)。相關(guān)的脅迫響應(yīng)機(jī)制包括 (圖1)[40-41]：1) 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的屏障作用：細(xì)胞壁重構(gòu)、細(xì)胞膜流動(dòng)性降低、海藻糖聚集等；2) 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)清理有毒物質(zhì)；3) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的激活和級(jí)聯(lián)調(diào)控作用，例如MAPK、TOR等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯；4) DNA遺傳水平發(fā)生損傷修復(fù)突變；5) 特定的轉(zhuǎn)錄因子被激活或失活，進(jìn)而影響更多功能基因的表達(dá)；6) 非折疊蛋白應(yīng)激，比如熱激蛋白分子伴侶促進(jìn)蛋白折疊；7) 線粒體脅迫響應(yīng)；8) 代謝水平的調(diào)控，比如平衡氧化還原穩(wěn)態(tài)。

圖1 工業(yè)微生物魯棒性與脅迫響應(yīng)(參考文獻(xiàn)[5]修改)

另外，這些脅迫在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，可能是組合或者順序發(fā)生，因此細(xì)胞應(yīng)對(duì)多重脅迫響應(yīng)的機(jī)制可能涉及上述細(xì)胞不同層面的重塑和調(diào)控[42]。為了從多個(gè)層面解析工業(yè)釀酒酵母菌株進(jìn)行高溫濃醪乙醇發(fā)酵時(shí)的脅迫響應(yīng)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)開展了一些研究。通過(guò)對(duì)高溫發(fā)酵條件下的酵母細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)工業(yè)酵母的長(zhǎng)時(shí)高溫脅迫響應(yīng)不同于實(shí)驗(yàn)室菌株的熱激響應(yīng)，在高溫條件下，工業(yè)酵母的磷酸戊糖途徑蛋白表達(dá)量降低，而糖酵解途徑蛋白表達(dá)量提高，這意味著工業(yè)酵母進(jìn)行高溫發(fā)酵時(shí)發(fā)生了代謝調(diào)控，同時(shí)鑒定了一些特異響應(yīng)長(zhǎng)時(shí)高溫脅迫的蛋白和轉(zhuǎn)錄因子[43-44]。通過(guò)對(duì)耐熱特異響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的敲除菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，解析了與耐熱相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平上的層級(jí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) (未發(fā)表)。另外，基于孢子池全基因組測(cè)序和數(shù)量性狀基因座定位策略高效挖掘了與工業(yè)酵母高溫發(fā)酵性能相關(guān)的遺傳變異，揭示了海藻糖積累和膜流動(dòng)性降低有利于工業(yè)酵母的高溫發(fā)酵性能的分子基礎(chǔ)[45]。這些結(jié)果為改造和選育適用于高溫濃醪發(fā)酵的工業(yè)酵母菌種提供了理論依據(jù)。

2 工業(yè)微生物基因組全局?jǐn)_動(dòng)與多位點(diǎn)快速進(jìn)化

目前，絕大多數(shù)重要的工業(yè)微生物是通過(guò)長(zhǎng)期的人工馴化和誘變篩選獲得?；谖锢砗突瘜W(xué)誘變的育種技術(shù)，盡管在一定程度上有效，但存在改造周期長(zhǎng)、非定向、遺傳機(jī)制不清晰和不能突破代謝網(wǎng)絡(luò)剛性的特點(diǎn)，在創(chuàng)造具有卓越生產(chǎn)性能的工業(yè)微生物方面，正面臨著許多無(wú)法逾越的障礙。伴隨分子生物學(xué)的發(fā)展，針對(duì)單基因的基因工程或針對(duì)單一代謝途徑的代謝工程的學(xué)術(shù)研究已經(jīng)很多，但對(duì)生產(chǎn)性能的提升效果有限，較難在工業(yè)生產(chǎn)上推廣使用。由于工業(yè)微生物的高產(chǎn)性狀通常對(duì)應(yīng)著復(fù)雜的基因型，傳統(tǒng)育種手段對(duì)涉及到十幾個(gè)、甚至是數(shù)十個(gè)基因的表達(dá)優(yōu)化無(wú)能為力。隨著基因組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、合成生物學(xué)的發(fā)展和高通量分析技術(shù)的進(jìn)步，以全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程 (Global transcription machinery engineering，gTME)、多位點(diǎn)自動(dòng)基因組工程 (Multiplex automated genome engineering, MAGE)、可跟蹤多輪重組工程 (Trackable multiplex recombineering, TRMR) 和核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯為代表的基因組工程技術(shù)日益成熟，可以在單一宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同性狀的同時(shí)改造，大幅度縮短了改造時(shí)間。基因組尺度的理性設(shè)計(jì)、途徑重建、網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)、全局?jǐn)_動(dòng)、多位點(diǎn)快速進(jìn)化和基因組刪減技術(shù)可以對(duì)工業(yè)微生物基因組進(jìn)行多位點(diǎn)、高通量、高效率修飾。從而賦予工業(yè)微生物粗原料利用、新產(chǎn)品合成等新型生產(chǎn)功能，優(yōu)化工業(yè)微生物的發(fā)酵生產(chǎn)能力，極大加快工業(yè)微生物的改造進(jìn)程，顯著提高改進(jìn)效果。這些技術(shù)已經(jīng)在氨基酸、大宗化學(xué)品、天然化合物藥物、蛋白質(zhì)/工業(yè)酶等生產(chǎn)領(lǐng)域取得了一系列標(biāo)志性成果，為系統(tǒng)改造工業(yè)微生物的生產(chǎn)性狀提供了全新手段。

2.1 轉(zhuǎn)錄因子全局?jǐn)_動(dòng)

針對(duì)細(xì)胞非特定生化途徑所關(guān)聯(lián)的復(fù)雜性狀，比如高產(chǎn)和脅迫抗性，其改造提升往往需要對(duì)細(xì)胞內(nèi)在的代謝進(jìn)行徹底的重編程，這就需要同時(shí)改變很多基因的表達(dá)水平，難以通過(guò)連續(xù)的多基因修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程 (gTME) 是通過(guò)改造和進(jìn)化全局轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄機(jī)器等關(guān)鍵蛋白，構(gòu)建高度多樣、復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控突變文庫(kù)，在轉(zhuǎn)錄水平上產(chǎn)生新型的豐富多樣性，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞代謝重編程，并以定向進(jìn)化方式加以迭代，從而使細(xì)胞獲得所期望的表型[46]。gTME是一種從轉(zhuǎn)錄全局角度工程改造復(fù)雜性狀的普適性方法。自2006年開發(fā)以來(lái)[47]，該方法已成功地應(yīng)用于原核生物和真核生物系統(tǒng)，比如釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、大腸桿菌、植物乳桿菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等，從而改善細(xì)胞的環(huán)境脅迫耐受性、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和底物利用效率 (表1)。

2.2 基因組進(jìn)化動(dòng)力擾動(dòng)

在自然界沒(méi)有人工參與的情況下，生物體受自然誘變劑的作用或在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)時(shí)以一定頻率 (約10–9–10–6) 自然發(fā)生突變，產(chǎn)生遺傳和表型多樣性，推進(jìn)生物進(jìn)化。但這個(gè)過(guò)程非常緩慢，通過(guò)人工模擬自然進(jìn)化過(guò)程，改造和突變基因組的進(jìn)化動(dòng)力，可以建立加快進(jìn)化速率的基因組全局?jǐn)_動(dòng)新技術(shù)[62]。該技術(shù)會(huì)讓上百種或上千種變異同時(shí)進(jìn)行，從而制造出十億種不同的DNA序列。利用細(xì)胞自身的進(jìn)化機(jī)制，經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次的變異，使得細(xì)胞在短期內(nèi)被賦予所期望的特性，使其生產(chǎn)特定產(chǎn)物具有更為低廉的成本和更短的研發(fā)周期。

多位點(diǎn)自動(dòng)基因組工程 (MAGE) 是近年來(lái)發(fā)展的針對(duì)基因組中多條相關(guān)代謝途徑進(jìn)行快速改造的重要方法[63-64]。MAGE基于λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)，針對(duì)與某條特定的代謝途徑或局部的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，人工合成的多個(gè)兼并寡核苷酸靶向基因組上的特定序列，通過(guò)同源重組的方式靶向序列，將許多已知具有最為優(yōu)良功能的基因整合在一起，從而獲得具有最優(yōu)工業(yè)性能的工業(yè)微生物。例如，現(xiàn)已知至少有20種基因影響番茄紅素的生產(chǎn)，一次改寫一個(gè)或一部分基因的常規(guī)基因工程技術(shù)顯然不能滿足需求。為了解決這一問(wèn)題，哈佛大學(xué)的研究人員利用MAGE改造大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素[63]。此外，為了進(jìn)一步提高M(jìn)AGE進(jìn)行基因組進(jìn)化的效率，通過(guò)引入co-marks建立改進(jìn)后的共選擇Co-selection MAGE，可以修飾大腸桿菌基因組80個(gè)位點(diǎn)。通過(guò)破壞復(fù)制體中引發(fā)酶和解旋酶之間的相互作用，提高ssDNA在復(fù)制叉處的豐度，進(jìn)一步提高了每輪操作的修飾效率[65-66]。MAGE技術(shù)應(yīng)用于釀酒酵母中，建立的eMAGE技術(shù)獨(dú)立于Rad51介導(dǎo)的同源重組，避免了DNA雙鏈斷裂造成的意外突變，一次可以同時(shí)轉(zhuǎn)化具有60個(gè)靶向突變的12個(gè)寡核苷酸，迭代轉(zhuǎn)化寡核苷酸混合庫(kù)，能夠快速產(chǎn)生大于105個(gè)的基因組組合突變。該技術(shù)在異源胡蘿卜素生物合成途徑基因的啟動(dòng)子、基因和終止子引入精確突變，產(chǎn)生遺傳多樣性，從而調(diào)控類胡蘿卜素的產(chǎn)物水平[67]。為了同時(shí)鑒定MAGE基因組進(jìn)化過(guò)程中與性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳基礎(chǔ)，進(jìn)而發(fā)展了可跟蹤多輪重組工程 (TRMR) 技術(shù)，通過(guò)合成帶有條形碼的突變序列，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后利用分子條碼和微陣列技術(shù)追蹤相關(guān)突變，量化突變率，并對(duì)遺傳性狀進(jìn)行定位。該技術(shù)能在一天之內(nèi)修飾大腸桿菌95%的基因，并在一周內(nèi)完成影響細(xì)胞不同培養(yǎng)基 (豐富、基礎(chǔ)和纖維素水解液) 和抑制物 (β-糖苷、D-巖藻糖、纈氨酸和丙酮醛) 條件下生長(zhǎng)的近4 000個(gè)基因的遺傳定位[68]。

表1 轉(zhuǎn)錄因子全局?jǐn)_動(dòng)

基因組復(fù)制工程輔助的連續(xù)進(jìn)化 (Genome replication engineering assisted continuous evolution, GREACE技術(shù))[69]是將保真性下降的DNA聚合酶元件引入到大腸桿菌中，誘發(fā)細(xì)胞進(jìn)入高突變態(tài)，從而在復(fù)制過(guò)程中不斷產(chǎn)生基因組突變，在環(huán)境壓力下，積累有益突變的子代細(xì)胞被篩選出來(lái)。不斷提高環(huán)境壓力就可以使大腸桿菌不斷地適應(yīng)新的壓力，達(dá)到連續(xù)進(jìn)化的目的。利用該技術(shù)可以提高大腸桿菌的耐熱性和甲醇利用能力[69-70]。

基于合成染色體和Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組機(jī)制，最近開發(fā)的基因組重排系統(tǒng) (Synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP-mediated evolution，SCRaMbLE) 可以產(chǎn)生全基因組尺度的、大片段的DNA缺失、重復(fù)、易位、倒位和復(fù)雜的基因組重排事件，實(shí)現(xiàn)釀酒酵母基因組的快速進(jìn)化[71-72]。利用該技術(shù)可以提高底盤細(xì)胞與外源路徑間的適配性，實(shí)現(xiàn)代謝通路的優(yōu)化，提高了釀酒酵母細(xì)胞工廠類胡蘿卜素、紫羅蘭素、紫色桿菌素、青霉素的生產(chǎn)能力[73-75]以及耐受環(huán)境脅迫的能力[76-77]。另外，通過(guò)對(duì)基因組序列結(jié)構(gòu)變化的解析可以鑒定與表型相關(guān)的基因型。

2.3 基因組刪減優(yōu)化

模式生物基因組測(cè)序和分析揭示了大量的生存非必需的序列，以及大量未知功能的基因。為了理解基因組的功能，構(gòu)建最小基因組的細(xì)胞工廠，在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、裂殖酵母等模式微生物和有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物 (如谷氨酸棒桿菌) 中已經(jīng)開展了基因組刪減優(yōu)化的工作[78-81]。所采用的DNA敲除技術(shù)從早期的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)整合/缺失、轉(zhuǎn)座子協(xié)同Cre/loxP切除，到最近發(fā)展的Red介導(dǎo)/雙鏈斷裂促進(jìn)的重組、無(wú)疤痕缺失等。如Cre/loxP系統(tǒng)可以用于染色體間的基因重排，為研究多種最小基因組的可能性提供了一個(gè)很好的技術(shù)手段[82]。新的技術(shù)能夠做到高效、精確和連續(xù)的DNA片段的敲除，目前最多的已敲除了約30%的基因組序列。隨著基因組計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件的開發(fā)，大片段DNA拼接合成技術(shù)的發(fā)展，可以在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行基因組的刪減優(yōu)化，包括刪除轉(zhuǎn)座子、去除冗余DNA片段以及重新安置易造成基因組不穩(wěn)定的tRNA基因等方式，之后采取大片段DNA從頭合成并轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞逐步置換的方法，創(chuàng)建數(shù)字化基因組刪減與逐步置換合成相結(jié)合的基因組改造創(chuàng)新技術(shù)體系[83]。Ikeda研究小組將一株原來(lái)不產(chǎn)鏈霉素、頭霉素和普拉地內(nèi)酯的鏈霉菌，分別改造為高產(chǎn)這3種抗生素的工業(yè)菌株，并使其基因組縮小至原野生菌株的83.12%–81.46%，不僅極大地提高了菌株的生長(zhǎng)速度，而且困擾這些抗生素多年的無(wú)效、有毒副產(chǎn)物均未檢測(cè)到[84]。

2.4 基因組多位點(diǎn)編輯進(jìn)化

近年來(lái)，基于核酸酶的基因組編輯技術(shù)，特別是CRISPR技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)、基因治療等領(lǐng)域[85]?；蚪M多位點(diǎn)編輯進(jìn)化，包括在全基因組尺度上搜索有利于目標(biāo)產(chǎn)物合成的基因表達(dá)或基因敲除，并通過(guò)循環(huán)篩選得到優(yōu)化的基因表達(dá)和敲除組合；快速實(shí)現(xiàn)在基因組上多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行突變、缺失或插入短序列等修飾。根據(jù)是否引入DNA損傷以及細(xì)胞內(nèi)源組分的參與情況，核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用歸納為以下4個(gè)方面 (圖2)。

1) 同源重組介導(dǎo)的途徑構(gòu)建與改造 (圖2A)：編輯系統(tǒng)的核酸酶切割靶向DNA位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂 (DSB)，在有與靶向位點(diǎn)同源臂的外源DNA片段供體存在的情況下，DSB經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)源同源重組系統(tǒng) (HDR) 進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)同源片段的整合、敲除、突變、失活或者替換，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)生物合成途徑的構(gòu)建與改造[86]。

2) 基于失活核酸酶的基因表達(dá)調(diào)控 (圖2B)：利用失活的核酸酶，融合細(xì)胞內(nèi)源激活子或抑制子，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)外源生物合成途徑以及與之適配的底盤細(xì)胞的優(yōu)化。最近，哈佛大學(xué)Church實(shí)驗(yàn)室通過(guò)CRISPRi確定了需鈉弧菌快速生長(zhǎng)所需的最小基因集[87]。

圖2 核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用(參考文獻(xiàn)[85]修改)

3) 非同源末端重組介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控 (圖2C)：在沒(méi)有外源同源重組DNA片段存在的情況下，核酸酶切割產(chǎn)生的DSB主要經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)源非同源末端重組 (NHEJ) 系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，引入插入或缺失隨機(jī)突變，當(dāng)靶向基因啟動(dòng)子區(qū)時(shí)，能夠引起編輯基因的差異表達(dá)，形成多性狀突變庫(kù)，從而為工業(yè)微生物突變育種提供了新策略。本實(shí)驗(yàn)室基于TALENs特異性識(shí)別修飾真核啟動(dòng)子區(qū)保守序列TATA框與GC框之間的關(guān)鍵區(qū)域，引起不同基因的差異表達(dá)，形成多性狀菌體庫(kù)，在釀酒酵母中建立了TALENs介導(dǎo)的多位點(diǎn)基因組編輯技術(shù)，并輔助酵母脅迫抗性進(jìn)化育種，提高了工業(yè)菌株耐受高溫和高滲的性能[88-89]。

4) 堿基編輯 (圖2D)：將CRISPR/Cas9 (或Cpf1) 系統(tǒng)中的核酸酶失活或突變?yōu)榍锌诿?，并融合胞嘧啶或腺苷酸脫氨酶，利用CRISPR系統(tǒng)的定位功能與脫氨酶的堿基編輯功能，可在染色體靶位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C到T或A到G的編輯，實(shí)現(xiàn)堿基突變，當(dāng)堿基位于基因編碼區(qū)時(shí)則有可能造成氨基酸突變，當(dāng)靶向基因編碼區(qū)中編碼精氨酸的CGA、編碼谷氨酰胺的CAG和CAA中的C突變?yōu)門時(shí)，分別會(huì)產(chǎn)生TGA、TAG和TAA終止密碼子，從而造成基因失活。最近，在重要工業(yè)平臺(tái)微生物谷氨酸棒桿菌中開發(fā)的多元自動(dòng)化基因組編輯方法MACBETH (Multiplex automated corynebacterium glutamicum base editing method)[90]，結(jié)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)的定位功能與胞嘧啶脫氨酶 (AID) 的堿基編輯功能，可在染色體靶位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C到T的編輯，效率高達(dá)90%。MACBETH可同時(shí)在多個(gè)基因中生成提前的終止密碼子，以失活靶基因。同時(shí)借助自動(dòng)化平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)從質(zhì)粒構(gòu)建、基因組編輯、獲取正確突變株和表型驗(yàn)證的全流程自動(dòng)化操作，編輯能力可達(dá)到每月數(shù)千突變株，為將谷氨酸棒桿菌改造為通用的微生物底盤提供強(qiáng)大的技術(shù)支持。

2.5 基因組適應(yīng)性進(jìn)化

對(duì)于遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜難以確定的性狀改造，基因組適應(yīng)性進(jìn)化也是一種行之有效的方法，同時(shí)通過(guò)蛋白、轉(zhuǎn)錄和基因組學(xué)技術(shù)解析在適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生的響應(yīng)與調(diào)控機(jī)制，再通過(guò)反向代謝工程等手段，進(jìn)一步穩(wěn)定或增強(qiáng)這種特性以達(dá)到獲得優(yōu)良性狀的目的。借助于基因組適應(yīng)性進(jìn)化，一些大腸桿菌、釀酒酵母、谷氨酸棒桿菌、腸膜明串珠菌等細(xì)胞工廠的工業(yè)生產(chǎn)效率和脅迫耐受性都得到了很大的提升[91-92]。系列傳代和連續(xù)培養(yǎng)是適應(yīng)性進(jìn)化的兩種經(jīng)典設(shè)計(jì)，針對(duì)特定的工業(yè)性狀育種目標(biāo)，施加單一的或多重的或變化的環(huán)境篩選壓力，使得突變?cè)谌蚪M尺度上廣泛積累，然后通過(guò)特定的生理指標(biāo)檢測(cè)篩選目標(biāo)突變體[93]。值得一提的是，相關(guān)自動(dòng)化設(shè)備以及高通量的突變體分離和篩選方法已被大量開發(fā)和應(yīng)用，從而節(jié)省適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn)的人力成本并提高篩選效率[91, 93]。本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一款自動(dòng)化程序控制、培養(yǎng)體積小且可并行運(yùn)行多種篩選培養(yǎng)條件的微生物適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng)設(shè)備[94]。該設(shè)備包括中央控制系統(tǒng)與若干執(zhí)行單元 (培養(yǎng)條件控制單元、培養(yǎng)瓶單元、原料儲(chǔ)罐及培養(yǎng)物收集罐單元)，具有程序編輯與控制模塊以及若干個(gè)蠕動(dòng)泵。培養(yǎng)條件控制單元由一個(gè)培養(yǎng)溫度控制的循環(huán)水槽和一組磁力攪拌器組成；培養(yǎng)瓶單元包括帶刻度的瓶體、瓶蓋及與之相連的管線及監(jiān)測(cè)部件，培養(yǎng)瓶單元放置于循環(huán)水槽中，磁力攪拌器轉(zhuǎn)子置于所述培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶通過(guò)其管路與蠕動(dòng)泵連接；原料儲(chǔ)罐與培養(yǎng)物收集罐單元具有若干個(gè)培養(yǎng)基原料儲(chǔ)罐及培養(yǎng)物排出液收集罐，培養(yǎng)瓶通過(guò)其管路與培養(yǎng)基原料儲(chǔ)罐及培養(yǎng)物排出液收集罐相連接。該設(shè)備能夠用來(lái)進(jìn)行細(xì)菌、酵母、真菌等微生物及可懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的系列傳代培養(yǎng)工作，適用于生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等科研或工廠實(shí)驗(yàn)室中，并用來(lái)替代目前常用的傳統(tǒng)的適應(yīng)性進(jìn)化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)工作，節(jié)省人力成本并實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化高效運(yùn)行。利用該設(shè)備，我們通過(guò)耐高溫馴化和/或模擬工業(yè)發(fā)酵條件對(duì)工業(yè)釀酒酵母菌株進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，獲得一系列適應(yīng)性進(jìn)化菌株，同時(shí)利用基因組重測(cè)序揭示了進(jìn)化菌株中積累的非同義突變和大片段缺失[95]。相較于普通產(chǎn)乙醇工業(yè)酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，進(jìn)化菌株的乙醇產(chǎn)量均明顯提高，能夠耐受高溫、高濃醪和抑制物等多重脅迫，解決高溫濃醪發(fā)酵淀粉生產(chǎn)酒精中酵母細(xì)胞多重脅迫耐性不足的缺陷。在高溫下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，可大幅度降低工業(yè)用水的用量，從而減少能量消耗，降低乙醇生產(chǎn)成本，而且進(jìn)化菌株能夠利用工業(yè)用水進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，進(jìn)一步降低了乙醇的生產(chǎn)成本，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中具有很大的潛力。

3 工業(yè)微生物細(xì)胞水平氧還平衡的全局?jǐn)_動(dòng)

輔因子對(duì)NADH/NAD+和NADPH/NADP+在所有生物有機(jī)體中起著重要的電子供體或受體的作用，驅(qū)動(dòng)大量的分解和合成代謝反應(yīng)，參與細(xì)胞的一系列生理功能，包括調(diào)節(jié)能量代謝、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、控制碳流量、提高線粒體的功能和活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞生命周期和細(xì)胞毒力等。工業(yè)微生物工程改造所改變或引入的代謝途徑，特別是涉及消耗、生成或轉(zhuǎn)化輔因子的代謝途徑，往往會(huì)引起氧化還原狀態(tài)的波動(dòng)，從而嚴(yán)重阻礙細(xì)胞代謝，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和生物合成能力的下降。因此，除了途徑改造外，氧化還原平衡也是工程改造細(xì)胞利用特定底物生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的重要考慮因素。通過(guò)輔因子工程，維持胞內(nèi)氧化還原平衡，增加目標(biāo)產(chǎn)物生物合成途徑的代謝通量，提高生產(chǎn)效率，是較早發(fā)展起來(lái)的系統(tǒng)改造手段之一，廣泛應(yīng)用于提高酶、藥物、生物燃料、大宗化學(xué)品等細(xì)胞工廠的生產(chǎn)性能。一些綜述文獻(xiàn)總結(jié)了輔因子工程的相關(guān)策略和應(yīng)用[96-101]，4種基本策略包括 (圖3)：

1) 調(diào)節(jié)內(nèi)源輔因子系統(tǒng)，改善自平衡，比如輔因子競(jìng)爭(zhēng)途徑的消除或阻斷，輔因子生成途徑的加強(qiáng)，以及微調(diào)氧化還原相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等。例如，NADPH是一些高附加值化學(xué)品生物合成途徑所需的重要輔因子。細(xì)胞能否有足夠的NADPH是構(gòu)建這類細(xì)胞工廠的限制因素之一。大腸桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HdfR，其功能缺失能夠提高細(xì)胞內(nèi)NADPH的含量，從而提高3-羥基丙酸的產(chǎn)量[102]。

2) 在宿主中增補(bǔ)異源的輔因子再生系統(tǒng)，比如增加NAD與NADP之間轉(zhuǎn)化的酶或途徑，增強(qiáng)NAD合成等，反之亦然。Ng 等基于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的Entner-Doudoroff (ED) 途徑，對(duì)其進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，并引入到大腸桿菌中，將NADPH產(chǎn)生效率提高了25倍[103]。

3) 替換具有特定輔因子特異性的酶或改造酶的輔因子特異性。最近，Arnold實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一個(gè)將酶對(duì)NADP依賴性逆轉(zhuǎn)為NAD依賴性的在線工具 (Cofactor specificity reversal-structural analysis and library design，CSR-SALAD)，基于蛋白結(jié)構(gòu)分析和半理性設(shè)計(jì)，成功將4種結(jié)構(gòu)不同的NADP依賴酶 (乙醛酸還原酶、肉桂醇脫氫酶、木糖還原酶和含鐵醇脫氫酶) 的輔因子特異性逆轉(zhuǎn)為NAD依賴[104]。

4) 創(chuàng)建合成的輔因子系統(tǒng)，比如利用人工的輔因子類似物?；谘趸€原反應(yīng)的生物轉(zhuǎn)化對(duì)于工業(yè)生物制造具有潛在的吸引力，但需要依賴于不穩(wěn)定且昂貴的輔因子。Knaus等鑒定了一些人工合成的輔因子類似物，其催化活性甚至比NAD(P)H還好[105]。另外，這些策略的組合也具有可行性和有效性。

圖3 細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的改造示意圖(參考文獻(xiàn)[97]修改)

4 展望

開發(fā)和改進(jìn)工業(yè)微生物的魯棒性和適配性，比如高產(chǎn)和脅迫抗性，是發(fā)展生物產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。然而這些性狀是由多層次的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，僅僅基于對(duì)模式生物和非工業(yè)環(huán)境所開展的研究尚不能全面解析相關(guān)的遺傳調(diào)控機(jī)理。未來(lái)依然需要借助于系統(tǒng)生物學(xué)的分析手段，加大對(duì)工業(yè)微生物的基因組學(xué)和功能基因組學(xué)分析，揭示重要工業(yè)微生物遺傳操作的限制修飾系統(tǒng)，分析工業(yè)環(huán)境下高產(chǎn)性狀的分子機(jī)制，挖掘高產(chǎn)性狀相關(guān)的特殊遺傳標(biāo)記與基因，構(gòu)建基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，最終為實(shí)現(xiàn)可預(yù)測(cè)、可控制的工業(yè)微生物提出更為全面可靠的理性設(shè)計(jì)改造方案。同時(shí)，由于傳統(tǒng)單一基因、單一途徑、單一策略的代謝工程改造對(duì)于復(fù)雜性狀提升的空間有限，需要借助合成生物學(xué)的工程改造手段，對(duì)工業(yè)微生物開展全基因組水平的、系統(tǒng)的、全局的工程改造擾動(dòng)，同時(shí)結(jié)合自動(dòng)化和高通量分析手段，多次迭代，從而縮短育種周期，獲得工業(yè)生產(chǎn)所需的優(yōu)良工業(yè)微生物。另外，人工創(chuàng)制生物在工業(yè)應(yīng)用時(shí)涉及到轉(zhuǎn)基因的問(wèn)題，如何加強(qiáng)人工創(chuàng)制生物的安全性管控和策略以及提高民眾對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的認(rèn)知也至關(guān)重要。

[1] Steensels J, Gallone B, Voordeckers K, et al. Domestication of industrial microbes. Curr Biol, 2019, 29(10): R381–R393.

[2] Kitano H. Biological robustness. Nat Rev Genet, 2004, 5(11): 826–837.

[3] Stelling J, Sauer U, Szallasi Z, et al. Robustness of cellular functions. Cell, 2004, 118(6): 675–685.

[4] Zhu LJ, Zhu Y, Zhang YP, et al. Engineering the robustness of industrial microbes through synthetic biology. Trends Microbiol, 2012, 20(2): 94–101.

[5] Gong ZW, Nielsen J, Zhou YJ. Engineering robustness of microbial cell factories. Biotechnol J, 2017, 12(10): 1700014.

[6] Adrio JL, Demain AL. Recombinant organisms for production of industrial products. Bioeng Bugs, 2010, 1(2): 116–131.

[7] Lee SY, Kim HU. Systems strategies for developing industrial microbial strains. Nat Biotechnol, 2015, 33(10): 1061–1072.

[8] Gustavsson M, Lee SY. Prospects of microbial cell factories developed through systems metabolic engineering. Microb Biotechnol, 2016, 9(5): 610–617.

[9] Friedman DC, Ellington AD. Industrialization of biology. ACS Synth Biol, 2015, 4(10): 1053–1055.

[10] Calero P, Nikel PI. Chasing bacterial chassis for metabolic engineering: a perspective review from classical to non-traditional microorganisms. Microb Biotechnol, 2019, 12(1): 98–124.

[11] Steensels J, Snoek T, Meersman E, et al. Improving industrial yeast strains: exploiting natural and artificial diversity. FEMS Microbiol Rev, 2014, 38(5): 947–995.

[12] Casti?eiras TS, Williams SG, Hitchcock AG, et al.strain engineering for the production of advanced biopharmaceutical products. FEMS Microbiol Lett, 2018, 365(15): fny162, doi: 10.1093/femsle/fny162.

[13] Nielsen J, Larsson C, van Maris A, et al. Metabolic engineering of yeast for production of fuels and chemicals. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(3): 398–404.

[14] Palazzotto E, Tong YJ, Lee SY, et al. Synthetic biology and metabolic engineering of actinomycetes for natural product discovery. Biotechnol Adv, 2019, 37(6): 107366.

[15] Liu YF, Liu L, Li JH, et al. Synthetic biology toolbox and chassis development in. Trends Biotechnol, 2019, 37(5): 548–562.

[16] Zhu Q, Jackson EN. Metabolic engineering offor industrial applications. Curr Opin Biotechnol, 2015, 36: 65–72.

[17] Nikel PI, Martínez-García E, de Lorenzo V. Biotechnological domestication of pseudomonads using synthetic biology. Nat Rev Microbiol, 2014, 12(5): 368–379.

[18] Weinstock MT, Hesek ED, Wilson CM, et al.as a fast-growing host for molecular biology. Nat Methods, 2016, 13(10): 849–851.

[19] Peralta-Yahya PP, Keasling JD. Advanced biofuel production in microbes. Biotechnol J, 2010, 5(2): 147–62.

[20] Meadows CW, Kang A, Lee TS. Metabolic engineering for advanced biofuels production and recent advances toward commercialization. Biotechnol J, 2018, 13(1), doi: 10.1002/biot.201600433.

[21] Zhou YJ, Buijs NA, Zhu ZW, et al. Production of fatty acid-derived oleochemicals and biofuels by synthetic yeast cell factories. Nat Commun, 2016, 7: 11709, doi: 10.1038/ncomms11709.

[22] Xiao Y, Bowen CH, Liu D, et al. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nat Chem Biol, 2016, 12(5): 339–344.

[23] Ekas H, Deaner M, Alper HS. Recent advancements in fungal-derived fuel and chemical production and commercialization. Curr Opin Biotechnol, 2019, 57: 1–9.

[24] Kim HM, Chae TU, Choi SY, et al. Engineering of an oleaginous bacterium for the production of fatty acids and fuels. Nat Chem Biol, 2019, 15(7): 721–729.

[25] Larroude M, Rossignol T, Nicaud JM, et al. Synthetic biology tools for engineering. Biotechnol Adv, 2018, 36(8): 2150–2164.

[26] Wohlbach DJ, Kuo A, Sato TK, et al. Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(32): 13212–13217.

[27] Riley R, Haridas S, Wolfe KH, et al. Comparative genomics of biotechnologically important yeasts. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(35): 9882–9887.

[28] Dunn B, Sherlock G. Reconstruction of the genome origins and evolution of the hybrid lager yeast. Genome Res, 2008, 18(10): 1610–1623.

[29] Marsit S, Mena A, Bigey F, et al. Evolutionary advantage conferred by an eukaryote-to-eukaryote gene transfer event in wine yeasts. Mol Biol Evol, 2015, 32(7): 1695–1707.

[30] Pérez-Ortín JE, Querol A, Puig S, et al. Molecular characterization of a chromosomal rearrangement involved in the adaptive evolution of yeast strains. Genome Res, 2002, 12(10): 1533–1539.

[31] Strope PK, Skelly DA, Kozmin SG, et al. The 100-genomes strains, anresource that illuminates its natural phenotypic and genotypic variation and emergence as an opportunistic pathogen. Genome Res, 2015, 25(5): 762–774.

[32] Gallone B, Steensels J, Prahl T, et al. Domestication and divergence ofbeer yeasts. Cell, 2016, 166(6): 1397–1410.e16.

[33] Cavanagh D, Fitzgerald GF, McAuliffe O. From field to fermentation: the origins ofand its domestication to the dairy environment. Food Microbiol, 2015, 47: 45–61.

[34] Keasling JD. Manufacturing molecules through metabolic engineering. Science, 2010, 330(6009): 1355–1358.

[35] Woolston BM, Edgar S, Stephanopoulos G. Metabolic engineering: past and future. Annu Rev Chem Biomol Eng, 2013, 4: 259–288.

[36] Nielsen J, Keasling JD. Engineering cellular metabolism. Cell, 2016, 164(6): 1185–1197.

[37] Guan NZ, Li JH, Shin HD, et al. Microbial response to environmental stresses: from fundamental mechanisms to practical applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2017, 101(10): 3991–4008.

[38] Takagi H, Kitagaki H. Stress Biology of Yeasts and Fungi: Applications for Industrial Brewing and Fermentation. New York: Springer, 2015: 1–218.

[39] Wendisch VF, Brito LF, Gil Lopez M, et al. The flexible feedstock concept in industrial biotechnology: Metabolic engineering of,,,and yeast strains for access to alternative carbon sources. J Biotechnol, 2016, 234: 139–157.

[40] Fu Y, Chen L, Zhang W. Regulatory mechanisms related to biofuel tolerance in producing microbes. J Appl Microbiol, 2016, 121(2): 320–332.

[41] Teixeira MC, Mira NP, Sá-Correia I. A genome-wide perspective on the response and tolerance to food-relevant stresses in. Curr Opin Biotechnol, 2011, 22(2): 150–156.

[42] Kitichantaropas Y, Boonchird C, Sugiyama M, et al. Cellular mechanisms contributing to multiple stress tolerance instrains with potential use in high-temperature ethanol fermentation. AMB Express, 2016, 6: 107, doi: 10.1186/s13568-016-0285-x.

[43] Shui WQ, Xiong Y, Xiao WD, et al. Understanding the mechanism of thermotolerance distinct from heat shock response through proteomic analysis of industrial strains of. Mol Cell Proteom, 2015, 14(7): 1885–1897.

[44] Xiao WD, Duan XX, Lin YP, et al. Distinct proteome remodeling of industrialin response to prolonged thermal stress or transient heat shock. J Proteome Res, 2018, 17(5): 1812–1825.

[45] Wang Z, Qi Q, Lin YP, et al. QTL analysis reveals genomic variants linked to high-temperature fermentation performance in the industrial yeast. Biotechnol Biofuels, 2019, 12: 59, doi: 10.1186/s13068-019-1398-7.

[46] Lanza AM, Alper HS. Using transcription machinery engineering to elicit complex cellular phenotypes//Weber W, Fussenegger M, Eds. Synthetic Gene Networks. New York: Humana Press, 2012, 813: 229–248.

[47] Alper H, Moxley J, Nevoigt E, et al. Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Science, 2006, 314(5805): 1565–1568.

[48] El-Rotail AAMM, Zhang L, Li YR, et al. A novel constructedmutagenesis library ofby using gTME technique for enhanced ethanol production. AMB Express, 2017, 7: 111, doi: 10.1186/s13568-017-0400-7.

[49] Liu HM, Yan M, Lai CG, et al. gTME for improved xylose fermentation of. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 160(2): 574–582.

[50] Liu HM, Liu K, Yan M, et al. gTME for improved adaptation ofto corn cob acid hydrolysate. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 164(7): 1150–1159.

[51] Qiu ZL, Jiang RR. Improvingethanol production and tolerance via RNA polymerase II subunit Rpb7. Biotechnol Biofuels, 2017, 10: 125, doi: 10.1186/s13068-017-0806-0.

[52] Li PS, Fu XF, Li SZ, et al. Engineering TATA-binding protein Spt15 to improve ethanol tolerance and production in. Biotechnol Biofuels, 2018, 11: 207, doi: 10.1186/s13068-018-1206-9.

[53] Alper H, Stephanopoulos G. Global transcription machinery engineering: a new approach for improving cellular phenotype. Metab Eng, 2007, 9(3): 258–267.

[54] Huang L, Pu Y, Yang XL, et al. Engineering of global regulator cAMP receptor protein (CRP) infor improved lycopene production. J Biotechnol, 2015, 199: 55–61.

[55] Chong HQ, Geng HF, Zhang HF, et al. Enhancingisobutanol tolerance through engineering its global transcription factor cAMP receptor protein (CRP). Biotechnol Bioeng, 2014, 111(4): 700–708.

[56] Wei LN, Zhu LW, Tang YJ. Succinate production positively correlates with the affinity of the global transcription factor Cra for its effector FBP in. Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 264, doi: 10.1186/s13068-016-0679-7.

[57] Zhu LW, Xia ST, Wei LN, et al. Enhancing succinic acid biosynthesis inby engineering its global transcription factor, catabolite repressor/activator (Cra). Sci Rep, 2016, 6: 36526, doi: 10.1038/srep36526.

[58] Zhang F, Qian XH, Si HM, et al. Significantly improved solvent tolerance ofby global transcription machinery engineering. Microb Cell Fact, 2015, 14: 175, doi: 10.1186/s12934-015-0368-4.

[59] Gao XX, Yang XF, Li JH, et al. Engineered global regulator H-NS improves the acid tolerance of. Microb Cell Fact, 2018, 17: 118, doi: 10.1186/s12934-018-0966-z.

[60] Klein-Marcuschamer D, Stephanopoulos G. Assessing the potential of mutational strategies to elicit new phenotypes in industrial strains. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(7): 2319–2324.

[61] Tan FR, Wu B, Dai LC, et al. Using global transcription machinery engineering (gTME) to improve ethanol tolerance of. Microb Cell Fact, 2016, 15: 4, doi: 10.1186/s12934-015-0398-y.

[62] Yang J, Kim B, Kim GY, et al. Synthetic biology for evolutionary engineering: from perturbation of genotype to acquisition of desired phenotype. Biotechnol Biofuels, 2019, 12: 113, doi: 10.1186/s13068-019-1460-5.

[63] Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature, 2009, 460(7257): 894–898.

[64] Singh V, Braddick D. Recent advances and versatility of MAGE towards industrial applications. Syst Synth Biol, 2015, 9(S1): 1–9.

[65] Carr PA, Wang HH, Sterling B, et al. Enhanced multiplex genome engineering through co-operative oligonucleotide co-selection. Nucleic Acids Res, 2012, 40(17): e132, doi: 10.1093/nar/gks455.

[66] Lajoie MJ, Gregg CJ, Mosberg JA, et al. Manipulating replisome dynamics to enhance lambda Red-mediated multiplex genome engineering. Nucleic Acids Res, 2012, 40(22): e170.

[67] Barbieri EM, Muir P, Akhuetie-Oni BO, et al. Precise editing at DNA replication forks enables multiplex genome engineering in eukaryotes. Cell, 2017, 171(6): 1453–1467.e13.

[68] Warner JR, Reeder PJ, Karimpour-Fard A, et al. Rapid profiling of a microbial genome using mixtures of barcoded oligonucleotides. Nat Biotechnol, 2010, 28(8): 856–862.

[69] Luan GD, Cai Z, Li Y, et al. Genome replication engineering assisted continuous evolution (GREACE) to improve microbial tolerance for biofuels production. Biotechnol Biofuels, 2013, 6: 137, doi: 10.1186/1754-6834-6-137.

[70] Wang XL, Wang Y, Liu J, et al. Enhanced methanol utilization in genetically engineeredby directed evolution. Biotech Bull, 2017, 33(9): 101–109 (in Chinese). 王曉璐, 王鈺, 劉嬌, 等. 利用定向進(jìn)化提高基因工程大腸桿菌的甲醇利用能力. 生物技術(shù)通報(bào), 2017, 33(9): 101–109.

[71] Chai MZ, Jia B, Li BZ, et al. Advances in synthetic genome and genome rearrangement. Chin Bull Life Sci, 2019, 31(4): 364–371 (in Chinese). 柴夢(mèng)哲, 賈斌, 李炳志, 等. 人工基因組合成與重排研究進(jìn)展. 生命科學(xué), 2019, 31(4): 364–371.

[72] Huang YQ, Liu D, Jia B, et al. SCRaMbLE of synthetic yeast chromosomes and applications. Biotech Bus, 2019, (1): 62–66 (in Chinese). 黃耀慶, 劉奪, 賈斌, 等. 合成型釀酒酵母染色體重排技術(shù)及應(yīng)用. 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù), 2019, (1): 62–66.

[73] Liu W, Luo ZQ, Wang Y, et al. Rapid pathway prototyping and engineering usingandsynthetic genome SCRaMbLE-in methods. Nat Commun, 2018, 9: 1936, doi: 10.1038/s41467-018-04254-0.

[74] Jia B, Wu Y, Li BZ, et al. Precise control of SCRaMbLE in synthetic haploid and diploid yeast. Nat Commun, 2018, 9: 1933, doi: 10.1038/s41467-018-03084-4.

[75] Blount BA, Gowers GF, Ho JCH, et al. Rapid host strain improvement byrearrangement of a synthetic yeast chromosome. Nat Commun, 2018, 9: 1932, doi: 10.1038/s41467-018-03143-w.

[76] Shen MJ, Wu Y, Yang K, et al. Heterozygous diploid and interspecies SCRaMbLEing. Nat Commun, 2018, 9: 1934, doi: 10.1038/s41467-018-04157-0.

[77] Luo ZQ, Wang LH, Wang Y, et al. Identifying and characterizing SCRaMbLEd synthetic yeast using ReSCuES. Nat Commun, 2018, 9: 1930, doi: 10.1038/s41467-017-00806-y.

[78] Choi JW, Yim SS, Kim MJ, et al. Enhanced production of recombinant proteins withby deletion of insertion sequences (IS elements). Microb Cell Fact, 2015, 14: 207, doi: 10.1186/s12934-015-0401-7.

[79] Annaluru N, Ramalingam S, Chandrasegaran S. Rewriting the blueprint of life by synthetic genomics and genome engineering. Genome Biol, 2015, 16: 125, doi: 10.1186/s13059-015-0689-y.

[80] Juhas M, Reu? DR, Zhu BY, et al.andessential genes and minimal cell factories after one decade of genome engineering. Microbiology, 2014, 160(11): 2341–2351.

[81] Sasaki M, Kumagai H, Takegawa K, et al. Characterization of genome-reduced fission yeast strains. Nucleic Acids Res, 2013, 41(10): 5382–5399.

[82] Yu BJ, Kang KH, Lee JH, et al. Rapid and efficient construction of markerless deletions in thegenome. Nucleic Acids Res, 2008, 36(14): e84, doi: 10.1093/nar/gkn359.

[83] Wang L, Maranas CD. MinGenome: antop-down approach for the synthesis of minimized genomes. ACS Synth Biol, 2018, 7(2): 462–473.

[84] Komatsu M, Uchiyama T, ōmura S, et al. Genome-minimizedhost for the heterologous expression of secondary metabolism. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(6): 2646–2651.

[85] Komor AC, Badran AH, Liu DR. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell, 2017, 168(1/2): 20–36.

[86] Lian JZ, Bao ZH, Hu SM, et al. Engineered CRISPR/Cas9 system for multiplex genome engineering of polyploid industrial yeast strains. Biotechnol Bioeng, 2018, 115(6): 1630–1635.

[87] Lee HH, Ostrov N, Wong BG, et al. Functional genomics of the rapidly replicating bacteriumby CRISPRi. Nat Microbiol, 2019, 4(7): 1105–1113.

[88] Zhang GQ, Lin YP, Qi XN, et al. TALENs-assisted multiplex editing for accelerated genome evolution to improve yeast phenotypes. ACS Synth Biol, 2015, 4(10): 1101–1111.

[89] Gan YM, Lin YP, Guo YF, et al. Metabolic and genomic characterisation of stress-tolerant industrialstrains from TALENs-assisted multiplex editing. FEMS Yeast Res, 2018, 18(5): foy045, doi: 10.1093/femsyr/foy045.

[90] Wang Y, Liu Y, Liu J, et al. MACBETH: Multiplex automatedbase editing method. Metab Eng, 2018, 47: 200–210.

[91] Zhu ZM, Zhang J, Ji XM, et al. Evolutionary engineering of industrial microorganisms-strategies and applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2018, 102(11): 4615–4627.

[92] Dragosits M, Mattanovich D. Adaptive laboratory evolution-principles and applications for biotechnology. Microb Cell Fact, 2013, 12: 64, doi: 10.1186/1475-2859-12-64.

[93] van den Bergh B, Swings T, Fauvart M, et al. Experimental design, population dynamics, and diversity in microbial experimental evolution. Microbiol Mol Biol Rev, 2018, 82(3): e00008–18, doi: 10.1128/MMBR. 00008-18.

[94] Wang QH, Wang BW, Ma YH. A programmed control equipment for adaptation, screening and cultivation: CN, 203373351U. 2014-01-01 (in Chinese).王欽宏, 汪保衛(wèi), 馬延和. 一種程序化控制的馴化篩選培養(yǎng)設(shè)備: CN, 203373351U. 2014-01-01.

[95] Wang QH, Lin YP, Qi XN, et al.and its breeding methods and applications in ethanol production by industrial fermentation: CN, 107603898A. 2018-01-19 (in Chinese).王欽宏, 藺玉萍, 齊顯尼, 等. 釀酒酵母及其育種方式及工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的應(yīng)用: CN, 107603898A. 2018-01-19.

[96] Liu JH, Li HL, Zhao GR, et al. Redox cofactor engineering in industrial microorganisms: strategies, recent applications and future directions. J Ind Microbiol Biotechnol, 2018, 45(5): 313–327.

[97] Wang M, Chen BQ, Fang YM, et al. Cofactor engineering for more efficient production of chemicals and biofuels. Biotechnol Adv, 2017, 35(8): 1032–1039.

[98] Chen XL, Li SB, Liu LM. Engineering redox balance through cofactor systems. Trends Biotechnol, 2014, 32(6): 337–343.

[99] Zhao CH, Zhao QW, Li Y, et al. Engineering redox homeostasis to develop efficient alcohol-producing microbial cell factories. Microb Cell Fact, 2017, 16(1): 115, doi: 10.1186/s12934-017-0728-3.

[100] Akhtar MK, Jones PR. Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways. Front Bioeng Biotechnol, 2014, 2: 30, doi: 10.3389/fbioe.2014.00030.

[101] Wang YP, San KY, Bennett GN. Cofactor engineering for advancing chemical biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(6): 994–999.

[102] Reynolds TS, Courtney CM, Erickson KE, et al. ROS mediated selection for increased NADPH availability in. Biotechnol Bioeng, 2017, 114(11): 2685–2689.

[103] Ng CY, Farasat I, Maranas CD, et al. Rational design of a synthetic Entner-Doudoroff pathway for improved and controllable NADPH regeneration. Metab Eng, 2015, 29: 86–96.

[104] Cahn JK, Werlang CA, Baumschlager A, et al. A general tool for engineering the NAD/NADP cofactor preference of oxidoreductases. ACS Synth Biol, 2017, 6(2): 326–333.

[105] Knaus T, Paul CE, Levy CW, et al. Better than nature: nicotinamide biomimetics that outperform natural coenzymes. J Am Chem Soc, 2016, 138(3): 1033–1039.

Regulation and adaptive evolution of industrial microorganisms towards genetic and environmental disturbances

Yuping Lin, and Qinhong Wang

CAS Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Harnessing industrial microorganisms to utilize renewable feedstocks and meanwhile produce biofuels, bulk chemicals, food ingredients, nutraceuticals, pharmaceuticals, industrial enzymes, etc. is the basis for successful biological industries. Robust traits of industrial microorganisms including high yield and productivity as well as stress tolerance are controlled by sophisticated genetic regulatory networks. Engineering robustness of industrial microorganisms requires systematic and global perturbations at the genome-wide scale to accelerate the accumulation of diversified genotypic mutations, thus generating desirable phenotypes. We review heve the mechanisms of genetic regulation and stress response in robust industrial organisms, the global perturbations and multiplex accelerated evolution at the genome-wide scale, as well as the global perturbation of cellular redox balance. In the future, based on system biology and synthetic biology, more efforts should be further devoted to understanding the mechanisms behind robust traits in industrial microorganisms under industrial niches for modeling and prediction as well as systematic engineering.

genetic regulation, environmental stress, global genome perturbation, multiplex accelerated evolution

10.13345/j.cjb.190247

藺玉萍 博士，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所副研究員，碩士生導(dǎo)師。2010年畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。2011年至2015年，加州大學(xué)伯克利分校從事博士后研究。2016年，入選天津市濱海新區(qū)“131”創(chuàng)新型人才培養(yǎng)工程第二層次人才。2017年，入選天津市創(chuàng)新人才推進(jìn)計(jì)劃重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“工業(yè)合成生物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”核心成員。2019年，瑞典查爾姆斯理工大學(xué)The division of Systems and Synthetic Biology公派訪問(wèn)學(xué)者。主要從事酵母組學(xué)與基因組工程等研究工作。已在、、、等相關(guān)領(lǐng)域期刊發(fā)表SCI論文21篇，國(guó)內(nèi)授權(quán)專利1項(xiàng)。

藺玉萍, 王欽宏. 工業(yè)微生物遺傳和環(huán)境擾動(dòng)的調(diào)控和適應(yīng)進(jìn)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 1925–1941.

Lin YP, Wang QH. Regulation and adaptive evolution of industrial microorganisms towards genetic and environmental disturbances. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1925–1941.

June 12, 2019;

August 30, 2019

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31700077), Natural Science Foundation of Tianjin, China (No. 16JCYBJC43100), the Scientific Instrument Developing Project of the Chinese Academy of Sciences (No. YJKYYQ20170023).

Yuping Lin. Tel: +86-22-24828705; Fax: +86-22-84861950; E-mail: lin_yp@tib.cas.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31700077)，天津市自然科學(xué)基金 (No. 16JCYBJC43100), 中國(guó)科學(xué)院科研儀器設(shè)備研制項(xiàng)目 (No. YJKYYQ20170023)資助。

2019-09-17

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190917.0947.002.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)