面向工業(yè)生物技術(shù)的系統(tǒng)生物學(xué)

鄭小梅，鄭平，孫際賓

面向工業(yè)生物技術(shù)的系統(tǒng)生物學(xué)

鄭小梅1,2,3，鄭平1,2,3，孫際賓1,2,3

1中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308 2中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308 3中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

工業(yè)生物技術(shù)是以微生物細胞工廠利用可再生的生物原料來生產(chǎn)能源、材料與化學(xué)品等的生物技術(shù)，在解決資源、能源與環(huán)境等問題方面起著越來越重要的作用。系統(tǒng)生物學(xué)是全面解析微生物細胞工廠及其發(fā)酵過程從“黑箱”到“白箱”的重要研究方法。系統(tǒng)生物學(xué)借助基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組以及代謝流組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，可解析微生物細胞工廠在RNA、蛋白與代謝物等不同水平上的變化規(guī)律與調(diào)控機制。目前，系統(tǒng)生物學(xué)在微生物細胞工廠的設(shè)計創(chuàng)建與發(fā)酵工藝優(yōu)化中起著越來越重要的指導(dǎo)作用，許多成功應(yīng)用實例不斷涌現(xiàn)，推動著工業(yè)生物技術(shù)的快速發(fā)展。文中重點綜述基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組與代謝流組以及基因組規(guī)模的網(wǎng)絡(luò)模型等各組學(xué)技術(shù)的最新發(fā)展及其在工業(yè)生物技術(shù)尤其是菌株改造與發(fā)酵優(yōu)化中的應(yīng)用，并就工業(yè)生物技術(shù)中系統(tǒng)生物學(xué)的未來發(fā)展方向進行展望。

工業(yè)生物技術(shù)，系統(tǒng)生物學(xué)，多組學(xué)，菌株設(shè)計，發(fā)酵優(yōu)化

工業(yè)生物技術(shù)以微生物細胞工廠利用可再生的生物原料來生產(chǎn)能源、材料與化學(xué)品等，是繼醫(yī)藥生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)之后全球生物技術(shù)的第3次浪潮，在解決資源、能源與環(huán)境問題上起著越來越重要的作用，在建設(shè)綠色、低碳與可持續(xù)的產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟體系上具有重大戰(zhàn)略意義[1]。工業(yè)生物技術(shù)的兩大核心問題即微生物細胞工廠(即工業(yè)菌種) 的設(shè)計構(gòu)建與生物發(fā)酵過程的優(yōu)化放大。對微生物細胞工廠及其發(fā)酵過程的認識與理解是解決這兩大問題的關(guān)鍵，而系統(tǒng)生物學(xué)是解析工業(yè)菌種及發(fā)酵過程從“黑箱”到“白箱”的重要研究方法，是推動工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的重要驅(qū)動力。

系統(tǒng)生物學(xué)通過基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組以及代謝流組等組學(xué)分析技術(shù)，系統(tǒng)解析細胞在RNA、蛋白與代謝物等不同水平上的變化規(guī)律與調(diào)控機制，進而通過數(shù)據(jù)驅(qū)動的方法與數(shù)學(xué)模型化來模擬和認識工業(yè)細胞工廠的生命過程[2]。近年來，DNA測序與質(zhì)譜等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展將對生物細胞與生命過程的認識推入了系統(tǒng)化與數(shù)據(jù)化的時代。系統(tǒng)生物學(xué)在解決工業(yè)生物技術(shù)核心問題中起到越來越重要的指導(dǎo)作用，許多成功的應(yīng)用實例不斷在工業(yè)菌種的設(shè)計改造和發(fā)酵過程的優(yōu)化放大中涌現(xiàn)，具體包括細胞工廠底盤細胞的選擇與設(shè)計、新代謝途徑的設(shè)計與構(gòu)建、基因組規(guī)模的改造靶點鑒定、代謝途徑優(yōu)化、耐受性的提升、碳源利用的優(yōu)化以及工業(yè)發(fā)酵工藝優(yōu)化與放大等方面。本文首先簡述基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組與代謝流組等組學(xué)技術(shù)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫的最新研究，然后系統(tǒng)綜述各組學(xué)技術(shù)或跨多組學(xué)的(Trans- omics) 整合策略在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用，最后就工業(yè)生物技術(shù)中系統(tǒng)生物學(xué)的未來發(fā)展方向進行展望。

1 系統(tǒng)生物學(xué)的組學(xué)技術(shù)

近年來，隨著不同物種在不同條件下的多組學(xué)海量數(shù)據(jù)的井噴式涌現(xiàn)，各組學(xué)數(shù)據(jù)庫與多組學(xué)分析技術(shù)成為揭示生命過程分子機制的重要工具(表1)。本節(jié)中將簡述基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組與代謝流組等相關(guān)技術(shù)及數(shù)據(jù)庫的發(fā)展。

1.1 基因組

基因組(Genome) 是生物體的全部遺傳信息的總和，是研究認識生命過程的基礎(chǔ)?；蚪M測序技術(shù)，尤其是第二代與第三代測序技術(shù)的快速發(fā)展，大大降低了基因組的測序成本，推動了基因組學(xué)的發(fā)展。以Illumina公司的Hiseq為代表的第二代測序技術(shù)[3]具有高通量、高精確度與高覆蓋度等優(yōu)勢，但其測序讀長較短。而第三代單分子測序技術(shù)[4]則具有10–20 kb的測序讀長甚至可以跨越絕大多數(shù)的重復(fù)序列區(qū)域，但其精確度相對較低。第二代測序和第三代測序可互相取長補短，采用兩個測序技術(shù)可得到更加完整和高質(zhì)量的基因組數(shù)據(jù)。

基因組組裝與注釋是挖掘認識基因組信息的重要手段?；蚪M的注釋關(guān)鍵包括基因組結(jié)構(gòu)注釋與功能注釋?；蚪M結(jié)構(gòu)注釋預(yù)測定位各基因的物理圖譜，獲得基因起始密碼子、內(nèi)含子和外顯子、基因的終止密碼子等結(jié)構(gòu)信息，可采用基于機器學(xué)習(xí)的從頭預(yù)測或基于同源序列的比對預(yù)測?；蚬δ茏⑨寗t多采用基于數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源比對的方式。常用的基因組數(shù)據(jù)庫有GenBank[5]、Genome[5]與GOLD[6]等綜合數(shù)據(jù)庫以及物種特異性數(shù)據(jù)庫如包含大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌等細菌基因組的數(shù)據(jù)庫Microbesonline[7]、釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫SGD[8]、真菌基因組數(shù)據(jù)庫FungiDB[9]等(表1)。除基因組的從頭預(yù)測注釋外，比較基因組可通過對比具有不同表型的菌株的基因組，獲得與特定表型相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)、基因的插入與缺失等。

1.2 轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome) 指在特定環(huán)境條件下表達的所有RNA。轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過對不同條件下特定細胞內(nèi)的所有RNA的定量檢測，來分析各基因的表達水平[10]。轉(zhuǎn)錄組定量檢測技術(shù)主要包括基因表達芯片技術(shù)與基于第二代測序的RNA測序技術(shù)(RNA-seq) 等?；蛐酒赗NA的數(shù)量、物種靈活性、定量與序列分析等方面具有一定的局限，而RNA-seq技術(shù)由于具有高準確度、高分辨率、高靈敏度等優(yōu)勢，由于測序成本不斷降低而被廣泛應(yīng)用。

比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過對不同條件下基因表達水平的比對分析，來研究不同條件下的響應(yīng)變化與不同菌株之間的差異。時間序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以動態(tài)地再現(xiàn)細胞內(nèi)基因的表達變化，變化趨勢一致的基因可能會有比較一致的功能。時間序列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可展示不同生命過程中基因的動態(tài)變化，這些變化信息蘊含著豐富的調(diào)控關(guān)系，有助于我們更加深刻地認識微生物內(nèi)部基因的動態(tài)關(guān)系，理解代謝過程。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫收集了不同物種不同條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，如GEO[11]、ArrayExpress[12]與M3D[13]等為轉(zhuǎn)錄組的整合分析提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源(表1)。

表1 各組學(xué)數(shù)據(jù)庫

1.3 蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)組(Proteome) 指在特定環(huán)境條件下表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)對不同環(huán)境條件下表達的所有蛋白質(zhì)進行定性和定量分析，系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的加工、修飾以及蛋白質(zhì)間的相互作用。隨著蛋白質(zhì)組的發(fā)展，有許多不同方法用于蛋白質(zhì)組的研究，如蛋白芯片、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳-質(zhì)譜(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis/Mass spectrometry，2D-PAGE/MS)與液質(zhì)聯(lián)用 (Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)等。近年來，質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，大大促進了蛋白質(zhì)的鑒定與定量分析。一系列定量蛋白質(zhì)組技術(shù)發(fā)展起來，如細胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標記(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)[14]、同位素親和標簽(Isotope coded affinity tag，ICAT)[15]與同位素標記相對和絕對定量標記(Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)[16]等，為全面、系統(tǒng)地定性和定量分析復(fù)雜細胞蛋白質(zhì)組提供了有效的技術(shù)手段。

目前，常用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫主要包括基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫如PRIDE[17]、GPM[18]與PeptideAtlas[19]等，綜合蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫Uniprot[20]與特定蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)如線粒體蛋白質(zhì)組MitoMiner[21]與膜蛋白質(zhì)組Plasma Proteome Database等[22](表1)。這些數(shù)據(jù)庫資源也為蛋白質(zhì)組的鑒定與定量分析提供了有力的支持。

1.4 代謝組與代謝流組

與轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組相似，代謝組也是在特定生理條件下細胞所有代謝物的集合，尤其是相對分子質(zhì)量為1 000 Da以下的小分子代謝物。代謝組學(xué)主要系統(tǒng)研究代謝物的變化，揭示生命過程中細胞代謝調(diào)控變化。由于基因突變或環(huán)境擾動可能不會引起轉(zhuǎn)錄和翻譯的變化，但會導(dǎo)致酶活性和代謝物濃度的變化。因此，與轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組相比，代謝組更能反映出細胞代謝的動態(tài)變化[23]。質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)如液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用(Gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS/MS)與毛細管電泳質(zhì)譜(Capillary electrophoresis-Mass spectrometry，CE-MS/MS) 以及核磁共振技術(shù)(Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)的發(fā)展，大大推動了代謝組研究。

可靠的胞內(nèi)代謝物組數(shù)據(jù)是認識細胞真實代謝狀態(tài)的直接證據(jù)，對于提高菌株代謝改造和工業(yè)發(fā)酵過程優(yōu)化具有重要意義。但與RNA與蛋白質(zhì)相比，許多代謝組的半衰期非常短，代謝組樣品制備會直接影響代謝組數(shù)據(jù)質(zhì)量。由于不同微生物在代謝物譜上差異，針對不同微生物需要進行代謝組樣品制備的優(yōu)化，尤其是針對復(fù)雜的胞內(nèi)代謝組[24-28]。代謝組的樣品制備需對細胞淬滅與代謝物提取等步驟進行優(yōu)化。常用細胞淬滅方法有冷甲醇淬滅、冷乙醇淬滅與液氮速凍等，如冷甲醇或冷乙醇等對細胞造成損傷時，可考慮采用快速取樣與液氮速凍相結(jié)合的方法。代謝物提取有熱乙醇、熱水、冷氯仿-甲醇、冷甲醇、冷乙腈等，由于不同提取劑的提取效率不同，為獲得完整的胞內(nèi)代謝物信息，也往往需要測試不同代謝物提取方法。

代謝組數(shù)據(jù)分析往往包括峰識別與匹配、歸一化處理、小分子代謝物的鑒定與定量分析等。液相質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫Metlin[29]和MassBank、氣相質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫Golm Metabolome Database[30]以及綜合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫MetaboLights[31]和HMDB[32]等可用于小分子代謝物的鑒定(表1)。目前，代謝組分析的挑戰(zhàn)主要在于不同微生物的樣品方法優(yōu)化、非靶向代謝組中的結(jié)構(gòu)鑒定、復(fù)雜未知代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定以及不同代謝物的絕對定量等[33]。

與代謝組相比，代謝流組更側(cè)重胞內(nèi)代謝流量的分析。目前，多采用13C-標記物來分析不同特定條件下細胞內(nèi)的碳流分布，通常包括13C-標記物存在下的菌株培養(yǎng)、胞內(nèi)代謝物的同位素分布檢測、13C-標記輔助下的代謝途徑與代謝流分析等步驟[34]。代謝流分析(13C-Metabolic flux analysis，MFA) 往往需要同位素數(shù)據(jù)處理與相應(yīng)分析軟件，如OpenFLUX2[35]、13CFLUX2[36]與INCA[37]等。目前，代謝流分析數(shù)據(jù)庫CeCaFDB收集了100多個基于13C-標記的代謝流數(shù)據(jù)[38](表1)。在代謝流分析相關(guān)研究方面也已有許多比較優(yōu)秀的綜述，如2009年花強與楊琛[39]系統(tǒng)綜述了代謝流比率分析的研究方法及其在代謝改造中的應(yīng)用。再如Guo等[34]對13C-MFA相關(guān)分析方法及其在不同工業(yè)菌株的應(yīng)用進行了詳細的綜述。

1.5 基因組規(guī)模的生物網(wǎng)絡(luò)模型

各組學(xué)數(shù)據(jù)的不斷豐富為從系統(tǒng)的角度全面解析生命過程奠定了基礎(chǔ)。但如何解析海量多組學(xué)數(shù)據(jù)仍然是系統(tǒng)生物學(xué)面臨的挑戰(zhàn)。全基因組規(guī)模的生物網(wǎng)絡(luò)是解決這一問題的有效策略。目前，多個重要微生物不同層次的生物網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)建立，尤其是基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型、轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等。

目前，許多重要工業(yè)微生物，如大腸桿菌[40]、釀酒酵母[41-43]與黑曲霉[44-45]的基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型已建立。在代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建中，首先可根據(jù)代謝途徑相關(guān)的數(shù)據(jù)庫如KEGG[46]、WikiPathways[47]、MetaCYC[48]、BioCYC[49]、LIGAND[50]與BRENDA[51]等對基因組進行解析，獲得“基因-酶-通路-反應(yīng)”的關(guān)系，進而搭建代謝網(wǎng)絡(luò)框架(表1)。然后，利用代謝流平衡分析(Flux balance analysis，F(xiàn)BA) 方法[52]，結(jié)合自動化和人工校正，獲得計量學(xué)的代謝網(wǎng)絡(luò)模型。后續(xù)，可通過整合如時間序列的多組學(xué)數(shù)據(jù)，進一步建立基于動力學(xué)的代謝網(wǎng)絡(luò)模型[53]?；蚪M規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)模型，可以微分方程等數(shù)學(xué)方程刻畫細胞過程，對細胞遺傳因素與環(huán)境因素的預(yù)測更加可靠，將會成為未來的重要發(fā)展趨勢。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型是全局研究基因表達與調(diào)控的有效方法。利用時間序列的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)或針對不同條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行基因共表達模式的整合分析，是構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型常用策略。比如，Schape等[54]通過對155組不同條件下的黑曲霉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基于斯皮爾曼相關(guān)性分析，構(gòu)建了基因組規(guī)模的基因共表達網(wǎng)絡(luò)以及9 500個基因的共表達子網(wǎng)絡(luò)，為基因組規(guī)模的基因功能研究提供有力的數(shù)據(jù)支撐。

目前大部分工業(yè)微生物還沒有可靠的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。Kludas等[55]利用機器學(xué)習(xí)的算法，以從GOLD數(shù)據(jù)庫中提取的釀酒酵母蛋白互作網(wǎng)絡(luò)為訓(xùn)練集，對里氏木霉的蛋白-蛋白互作關(guān)系進行了預(yù)測分析，獲得了里氏木霉的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，其陽性率可達75%[55]。利用機器學(xué)習(xí)的模擬有希望成為根據(jù)已知網(wǎng)絡(luò)模型獲得未知網(wǎng)絡(luò)模型的重要方法。

1.6 多組學(xué)分析

近年來，基于各組學(xué)的系統(tǒng)生物技術(shù)的快速發(fā)展，為我們認識改造微生物成為細胞工廠提供了強有力的指導(dǎo)。全基因組測序與細胞轉(zhuǎn)錄、翻譯與代謝等各個層次的定量分析是破解其遺傳密碼、進行基因組育種、基因信息挖掘與基因組規(guī)模建模的基礎(chǔ)?；诙嘟M學(xué)的系統(tǒng)分析，使我們可以從全局上理解細胞的代謝與調(diào)控機制，成為系統(tǒng)代謝工程的學(xué)習(xí)-設(shè)計-創(chuàng)建-測試(Learn-Design-Build-Test，LDBT) 研究策略中的重要環(huán)節(jié)(圖1)。

各組學(xué)數(shù)據(jù)是認識細胞代謝與生命過程的重要研究策略，但值得注意的是組學(xué)研究應(yīng)是問題驅(qū)動的。在研究伊始，就需要提出明確的研究目標與擬解決的問題，然后根據(jù)相應(yīng)問題來選擇相應(yīng)的研究方法。比如，轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組都是分析胞內(nèi)基因表達水平的有效策略，但細分來看，轉(zhuǎn)錄組的通量更高、成本相對更低，是分析基因轉(zhuǎn)錄水平差異的首選。但轉(zhuǎn)錄組無法預(yù)測可能在翻譯或翻譯后修飾上存在限制的相關(guān)基因，針對這一問題，蛋白質(zhì)組尤其是修飾蛋白質(zhì)組有成為更為有效的方法。同時，由于蛋白質(zhì)組還與蛋白的穩(wěn)定性相關(guān)，因此不同基因的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組可能并不是一一對應(yīng)的。但也可利用兩者之間的差異，通過轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的整合，可獲得在翻譯或翻譯后修飾等方面的蛋白信息。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組與代謝組分析，往往涉及非靶向與靶向的問題。非靶向分析更傾向于利用如主成分分析(Principal component analysis，PCA) 等發(fā)現(xiàn)新的靶點，從檢測與分析上，就需要求全以獲得更為完整的胞內(nèi)蛋白或代謝物信息。靶向分析則更多地用于已知途徑中不同蛋白或代謝物的分析。

圖1 系統(tǒng)生物學(xué)驅(qū)動的合成生物學(xué)細胞工廠創(chuàng)建優(yōu)化策略[101]

由于細胞是一個復(fù)雜的整體，跨多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析是全面解析細胞不同層面分子機制的重要研究方法。比如，Zhu等[56]利用基因組、比較轉(zhuǎn)錄組與比較蛋白質(zhì)組等多組學(xué)分析，揭示氮源缺乏是導(dǎo)致產(chǎn)油真菌圓紅冬孢酵母油脂積累的重要原因，為系統(tǒng)闡釋該菌株的全局調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，也為該菌株的理性改造提供新的靶點。

2 系統(tǒng)生物學(xué)在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用

工業(yè)生物技術(shù)可利用微生物細胞工廠以可再生的生物原料來生產(chǎn)目標能源、材料與化學(xué)品，是石油化學(xué)品工業(yè)生產(chǎn)的高效替代途徑。理論上，微生物細胞工廠具有生產(chǎn)任一代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝中間物的潛力，但目前絕大部分的天然微生物的生產(chǎn)能力是非常有限的。因此，基于系統(tǒng)生物學(xué)的認識與設(shè)計，利用合成生物學(xué)的手段來最終實現(xiàn)微生物細胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化，不斷提升產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率與生產(chǎn)強度這三大發(fā)酵指標，是目前工業(yè)生物技術(shù)的重要研究策略[58-60]。系統(tǒng)生物學(xué)在微生物細胞工廠的設(shè)計改造以及工業(yè)發(fā)酵優(yōu)化中具有重要的指導(dǎo)作用，許多成功的應(yīng)用實例不斷涌現(xiàn)。本節(jié)將根據(jù)具體實例分析系統(tǒng)生物學(xué)在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用。

2.1 基于系統(tǒng)生物學(xué)的細胞工廠設(shè)計改造

2.1.1 細胞工廠底盤細胞的選擇與設(shè)計

重要模式微生物如大腸桿菌與酵母等由于清晰的遺傳背景與高效的遺傳操作，目前被開發(fā)拓展為可用于許多不同產(chǎn)品生產(chǎn)的工業(yè)底盤細胞[60]。一些傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌株，如高產(chǎn)氨基酸的谷氨酸棒桿菌、高產(chǎn)有機酸的黑曲霉、高產(chǎn)丁醇的梭菌sp、高產(chǎn)脂類物質(zhì)的解脂酵母以及高產(chǎn)多酮類化合物的放線菌等，由于具有強工業(yè)魯棒性、高生產(chǎn)強度與低發(fā)酵成本等優(yōu)勢，也成為非常理想的細胞工廠底盤[2,61]。另外，一些具有獨特生化特性的微生物，如藍藻、微藻和甲烷菌等一碳底物利用菌株[62]，如嗜熱毀絲霉與嗜熱側(cè)孢霉等嗜熱菌[63]，也是底盤細胞的候選菌株。

在底盤細胞的設(shè)計中，通過重塑中心代謝途徑來提高某一關(guān)鍵中間代謝物的合成流量，然后以這一中間代謝物為基礎(chǔ)前體物質(zhì)，用于后續(xù)一系列代謝物的生產(chǎn)。如Jouhten等[64]利用FBA、MiMBl與代謝通量變化分析 (Flux variability analysis，F(xiàn)VA) 3種代謝流分析算法，重新設(shè)計了釀酒酵母的中心代謝流分布，構(gòu)建了乙酰CoA的底盤細胞。而乙酰CoA作為參與34個代謝反應(yīng)的重要中間代謝物，可用于一系列工業(yè)價值產(chǎn)品的生產(chǎn)，如可用于生物柴油與生物醫(yī)藥的脂類物質(zhì)、可用于抗生素與抗癌藥物合成的多酮類化合物以及可用于化妝品與食品添加劑的異戊二烯類物質(zhì)等[64-65](表2)。

2.1.2 新代謝途徑的設(shè)計與構(gòu)建

由于涉及關(guān)鍵酶的篩選與選擇，目標特定化學(xué)品的代謝途徑設(shè)計是一個較為復(fù)雜的問題。傳統(tǒng)途徑設(shè)計多基于文獻分析或基于KEGG、MetaCyc與BRENDA等代謝途徑數(shù)據(jù)庫的已知代謝途徑分析，設(shè)計難度大，設(shè)計能力有限。目前，基于有機化學(xué)和生物化學(xué)的原理，通過計算機輔助設(shè)計，以基因組技術(shù)挖掘催化特定反應(yīng)的酶的編碼基因，實現(xiàn)快速非自然途徑的創(chuàng)建[33]。結(jié)合高效的DNA組裝技術(shù)與基因組編輯技術(shù)，可在底盤細胞異源構(gòu)建涉及多步反應(yīng)的復(fù)雜化合物的合成，如天然代謝產(chǎn)物與微生物的異源合成。

Galanie等[66]借助基因組新酶挖掘，設(shè)計了阿片藥物(Opioid) 的完整合成途徑，通過在釀酒酵母底盤細胞中，整合來源于植物、動物、酵母與細菌的21個二甲基嗎啡(Thebaine) 合成相關(guān)與 23個氫可酮(Hydrocodone) 合成相關(guān)的關(guān)鍵酶，成功獲得阿片藥物細胞工廠，實現(xiàn)二甲基嗎啡與氫可酮的異源合成。Liu等[67]通過對燈盞花基因組的系統(tǒng)挖掘，成功篩選鑒定到燈盞花素合成途徑中的P450酶EbF6H和糖基轉(zhuǎn)移酶EbF7GAT這兩個關(guān)鍵酶，通過在釀酒酵母底盤細胞中異源構(gòu)建燈盞花素合成途徑，成功獲得燈盞花素合成的細胞工廠，燈盞花素含量達到百毫克級。該研究對將傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)變?yōu)橐?guī)?；I(yè)發(fā)酵生產(chǎn)路線，具有非常好的借鑒意義。

另外，F(xiàn)ang等[68]通過系統(tǒng)解析維生素B12好氧合成途徑中鈷螯合與腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的合成機理，將來源于5種不同細菌中的28個基因在大腸桿菌底盤細胞中成功組裝與基因表達調(diào)控，成功在大腸桿菌中實現(xiàn)了維生素B12的從頭合成，轉(zhuǎn)化率達307 mg/g DCW，發(fā)酵周期大大縮短，僅為目前工業(yè)水平的1/10，為復(fù)雜化學(xué)品的從頭合成與傳統(tǒng)發(fā)酵菌株升級換代提供了很好的示范。

表2 系統(tǒng)生物學(xué)在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用實例

2.1.3 基因組規(guī)模的改造靶點鑒定

代謝途徑中限速節(jié)點的發(fā)現(xiàn)是細胞工廠的設(shè)計優(yōu)化的關(guān)鍵。傳統(tǒng)代謝工程中，往往基于先驗知識的試錯或大規(guī)模的文庫篩選來發(fā)現(xiàn)代謝瓶頸。但這種策略在菌株改造靶點的發(fā)現(xiàn)也往往會進入一個瓶頸?；诟鹘M學(xué)及其整合分析則成為從全基因組規(guī)模上發(fā)現(xiàn)代謝瓶頸的有效策略。

比較組學(xué)是發(fā)現(xiàn)代謝瓶頸的有效策略。殷嫻等[69]利用比較基因組與比較轉(zhuǎn)錄組分析了檸檬酸高產(chǎn)黑曲霉菌株與低產(chǎn)的退化菌株之間的差異，發(fā)現(xiàn)檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白的候選基因可能是檸檬酸高產(chǎn)的重要因素。Steiger等[70]通過基因組挖掘的方式也發(fā)現(xiàn)了相同的檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因，利用Tet-on誘導(dǎo)表達系統(tǒng)來過表達該轉(zhuǎn)運蛋白后，可使檸檬酸的產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了5倍。Redding-Johanson等[71]利用選擇反應(yīng)監(jiān)測-質(zhì)譜(Selected-reaction monitoring-Mass spectrometry，SRM-MS) 對倍半萜烯(Amorpha-4,11-diene) 的大腸桿菌工程菌株進行定量蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)來源于釀酒酵母的甲羥戊酸激酶(Mevalonate kinase，MK) 與磷酸甲羥戊酸激酶(Phospho- mevalonate kinase，PMK) 可能是倍半萜烯代謝途徑中的限速節(jié)點。通過對MK與PMK的密碼子優(yōu)化與強啟動子替換，倍半萜烯的產(chǎn)量提高3倍，達到500 mg/L以上。

另外，PCA分析也是發(fā)現(xiàn)代謝節(jié)點的有效方法。Alonso-Gutierrez等[72]對27個具有不同檸檬烯產(chǎn)量的大腸桿菌中的9個甲羥戊酸合成關(guān)鍵酶的靶向定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進行PCA分析，鑒定出高產(chǎn)菌株中的表達強化的關(guān)鍵酶，進一步強化關(guān)鍵酶的表達后，檸檬烯的產(chǎn)量提高40%。

多組學(xué)整合分析可用于發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾等調(diào)控所導(dǎo)致的代謝瓶頸。多酚銀松素具有抗細菌與抗真菌的活性，丙二酰CoA是其重要的前體，需要外源添加淺藍菌素(Cerulenin) 來獲得，但其高水平反而抑制生產(chǎn)。為解析其抑制機制，Xu 等[73]進行蛋白質(zhì)組與代謝組分析，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)高水平的丙二酰CoA與胞內(nèi)蛋白的丙二?；嚓P(guān)聯(lián)。進一步分析發(fā)現(xiàn)4-香豆酸CoA連接酶(4-coumarate- CoA ligase，4CL) 與芪合成酶(Stilbene synthase，STS) 丙二?；蠡钚詥适?，這可能是淺藍菌素抑制銀松素合成的關(guān)鍵。將STS的丙二?；稽cLys113與Lys161突變?yōu)榫彼幔苊馄浔；螅蛔兙昕赡褪芨咚降谋oA，銀松素的產(chǎn)量提高了2.2倍。由此可見，在菌株設(shè)計改造中，如翻譯后修飾等不同調(diào)控水平上的限制因素分析是非常重要的。

2.1.4 代謝途徑優(yōu)化

除在限速代謝節(jié)點的預(yù)測外，各組學(xué)及基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型等在整體代謝途徑的優(yōu)化上也發(fā)揮著越來越大的作用，許多成功的例子不斷被報道。

Meng等[74]通過轉(zhuǎn)錄組與代謝流模型的整合分析，來預(yù)測在6-脫氧赤酮酸內(nèi)酯B (6- deoxyerythronolide B，6dEB) 合成中不同代謝模塊的作用。研究通過弱化磷酸戊糖途徑與核甘酸代謝中的所有25個基因，顯著提高6dEB的生產(chǎn)，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了3倍，達到210 mg/L。值得注意的是，不同組學(xué)分析的預(yù)測結(jié)果可能會存在差異，比如在比較轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因，在代謝流模型可能預(yù)測為下調(diào)。這提示我們轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)反映的是胞內(nèi)基因的表達水平，會影響胞內(nèi)代謝狀態(tài)，但并不能直接代表代謝水平。

代謝組分析可能更有助于設(shè)計優(yōu)化胞內(nèi)的代謝流分布。Ohtake等[75]利用野生大腸桿菌菌株與敲除菌株的比較代謝組分析，發(fā)現(xiàn)當敲除途徑后會引起CoA代謝失衡，而引起其他副產(chǎn)物丙酮酸與丁酸甲酯的生成，進一步分析發(fā)現(xiàn)由乙醇脫氫酶AdhE2所催化的丁酰CoA到正丁醛的合成流量降低可能是限速步驟。通過乙醇脫氫酶AdhE2表達的精細調(diào)控，提高胞內(nèi)CoA水平后，顯著降低副產(chǎn)物的生成，最終實現(xiàn)大腸桿菌中的正丁醇產(chǎn)量提升22%，達到18.3 g/L。

13C-同位素標記的代謝流分析可利用質(zhì)譜與核磁檢測計算各胞內(nèi)代謝物的13C-同位素分布情況，進而定量計算胞內(nèi)各酶催化下的代謝通量，被認為是最能反映胞內(nèi)真實代謝狀態(tài)的組學(xué)分析工具，也不斷應(yīng)用于許多不同的工業(yè)生產(chǎn)菌株的認識與改造中。如Lu等[76]利用同位素標記的代謝組與13C代謝流分析相結(jié)合，比較分析了黑曲霉糖化酶高產(chǎn)菌株DS03043和野生型CBS 513.88的代謝差異。研究發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)菌株中，ATP/AMP的比率更高，高濃度ATP抑制了葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的活性，使碳流更多地流向氧化磷酸化途徑，導(dǎo)致TCA循環(huán)的碳流減少，從而降低了如檸檬酸與草酸等副產(chǎn)物的積累。再如Lange等[77]利用基于GC-MS的13C-代謝流分析了產(chǎn)琥珀酸巴斯夫菌胞內(nèi)從蔗糖到琥珀酸的代謝通量。通過對460種代謝物的同位素分布檢測，準確定量了完整的中心代謝通量，發(fā)現(xiàn)一個新的果糖激酶RbsK參與到蔗糖的分解產(chǎn)物果糖的磷酸化活化。通過對PTS葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中FruA的弱化與果糖激酶RbsK的強化，可有效降低PTS系統(tǒng)造成的碳流損失，從而大大提高了琥珀酸的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率達到2.5 mol/mol，接近3 mol/mol的理論轉(zhuǎn)化率。另外，Yang等[78]發(fā)現(xiàn)甲基磷酸赤蘚糖醇途徑(Methylerythritol phosphate pathway，MEP) 與甲羥戊酸途徑(Mevalonate pathway，MVA) 兩個途徑的同時過表達，相對單獨過表達時，可分別使大腸桿菌的異戊二烯產(chǎn)率提高了 20倍和3倍。進一步利用13C-代謝流分析，發(fā)現(xiàn)兩途徑協(xié)同過表達時，可使MEP途徑與MVA途徑的流量分別增強4.8倍和1.5倍，表明還原力的平衡與ATP供給在兩途徑協(xié)同平衡中起重要作用。兩途徑的協(xié)同作用可使大腸桿菌的異戊二烯的產(chǎn)量達到24 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達到0.267 g/g。

另一個利用代謝流分析的成功例子是谷氨酸棒桿菌以甘露醇為原料生產(chǎn)賴氨酸[79]。甘露醇是新一代非糧原料海草中的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，當以甘露醇為原料時，碳流多流向糖酵解途徑，磷酸戊糖途徑代謝流量較低，使NADPH的供給嚴重不足。研究首次通過在胞內(nèi)引入異源的果糖激酶來重新分配碳流，從而增加磷酸戊糖途徑的代謝流量，但發(fā)現(xiàn)提升效果較低。為另尋他路，通過表達參與糖酵解途徑中的NADP-依賴的甘油醛脫氫酶來提高NADPH還原力的供給，成功解決了還原力供給不足的問題。

2.1.5 細胞工廠耐受性的提升

細胞工廠對發(fā)酵終產(chǎn)物或毒性中間代謝物的耐受性是制約工業(yè)發(fā)酵性能提升的重要因素。如果壓力響應(yīng)機制或毒性機制是清晰的，則可通過相應(yīng)的策略來緩解壓力對細胞的脅迫，提升菌株的耐受性[80]。比如，芳香族或烷烴等疏水化合物可直接插入至細胞膜中，進而影響細胞膜的完整性與流動性引起細胞損傷。針對這一問題可利用細胞膜組分修飾來緩解，如過表達細胞膜脂類順反異構(gòu)酶與去飽和酶等，增加細胞膜中環(huán)丙基脂肪酸或改變脂肪酸鏈長度等。有的壓力脅迫會激活胞內(nèi)的未折疊蛋白應(yīng)激反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR) 而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)的錯誤折疊，因此過表達分子伴侶也是較為常用的方式。比如在大腸桿菌或丙酮丁醇梭菌中過表達分子伴侶GroESL可顯著提高正丁醇等的耐受性[81-82]。再如，Zhu等[83]發(fā)現(xiàn)如5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA) 等氨基酮類物質(zhì)的積累也會產(chǎn)生活性氧等而損失細胞，過表達過氧化氫酶KatG/KatE或超氧化物歧化酶SodA/SodB/SodC等可有效緩解氧化應(yīng)激，提高菌株的耐受性并增強5-ALA的產(chǎn)量。一些毒性化合物的外排蛋白如RND外排泵或壓力調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MetR與SoxS的改造也有助于提高菌株的耐受性。

當耐受性機制尚不清楚時，則可采用定向適應(yīng)性進化的策略，利用連續(xù)傳代富集獲得耐受性顯著提高的菌株。然后，利用比較組學(xué)的手段來發(fā)現(xiàn)引起耐受性提高的分子機制，再通過對底盤菌株的理性設(shè)計改造，獲得耐受性不斷提高的菌株[60]。比如異丙醇對細胞有一定的毒性，會抑制細胞生長并降低產(chǎn)量。Horinouchi等[84]通過在異丙醇壓力條件對大腸桿菌進行適應(yīng)性進化，獲得了耐受性提升的菌株。借助比較基因組，鑒定出、、、與基因上的突變可有助于耐受性的提高，進一步利用比較轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸合成代謝、鐵離子穩(wěn)態(tài)維持以及能量代謝等與耐受性有關(guān)。Wang等[85]利用基因組復(fù)制元件DnaQ突變體輔助的連續(xù)進化技術(shù)(Genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE) 將大腸桿菌在賴氨酸終點發(fā)酵液中了進行了定向進化，獲得了賴氨酸產(chǎn)量顯著提升的菌株RS3，其賴氨酸產(chǎn)量可達到155 g/L，比出發(fā)菌株MU-1提升14.8%。進一步通過比較基因組與比較代謝組的分析，發(fā)現(xiàn)菌株RS3中SpeB、AtpB與SecY等基因的點突變，可能有助于提高細胞完整性與增強賴氨酸合成的碳流。

靶標產(chǎn)品的積累會對細胞產(chǎn)生一定的壓力，從而限制菌株發(fā)酵性能的不斷提升。如谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸時，琥珀酸的不斷積累會反饋抑制葡萄糖的吸收、細胞適應(yīng)性以及琥珀酸生產(chǎn)。Chung等[86]利用基于DNA芯片的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)隨著琥珀酸的積累，轉(zhuǎn)運途徑與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因表達發(fā)生顯著變化。通過過表達一些轉(zhuǎn)錄下調(diào)的基因時可提高葡萄糖利用速率，但過表達中心代謝的關(guān)鍵酶對生產(chǎn)并無促進。然而，過表達轉(zhuǎn)錄因子NCgl0275可提高細胞適應(yīng)性，并使琥珀酸生產(chǎn)大幅提高38%，產(chǎn)量達152 g/L。另外，蛋白質(zhì)組與代謝組的整合也用于通過分析大腸桿菌的靜止細胞(Q-cell，quiescent cell)，來揭示Q-cell獨特的代謝調(diào)控與耐受性[87]。Q-cell由質(zhì)子載體吲哚誘導(dǎo)而生，可使細胞不再生長，但維持較高的代謝活性。通過比對細胞正常生長下與處于Q-cell的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)加入吲哚后，壓力響應(yīng)蛋白的蛋白水平顯著提高。這些壓力蛋白將維持Q-cell耐受胞內(nèi)的代謝失衡。利用這種代謝失衡引起的乙酰CoA與磷酸烯醇式丙酮酸的積累，可驅(qū)動羥基丙酸(3-hydroxypropionate，3HP) 的合成，使3HP的產(chǎn)量提高2倍，達到39 g/L。

2.1.6 細胞工廠碳源利用的優(yōu)化

目前，葡萄糖與蔗糖等是工業(yè)發(fā)酵中的主要碳源。但隨著糧食危機的風(fēng)險，許多替代性的非糧碳源如秸稈纖維素以及甲醇與甲酸等一碳化學(xué)品的利用也成為研究熱點。與菌株耐受性提升的策略相似，替代性碳源利用菌株也可通過適應(yīng)性進化的方式來獲得，然后再借助多組學(xué)技術(shù)來分析在碳源利用中的關(guān)鍵酶。比如Tuyishime等[88]利用適應(yīng)性進化成功獲得甲醇利用率顯著提升的菌株，進一步利用比較基因組的方法發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)NAD+/NADH、甲醇的吸收與耐受等是影響甲醇利用的關(guān)鍵因素。在碳源利用中，底物的轉(zhuǎn)運是重要的影響因素。Bracher等[89]采用比較轉(zhuǎn)錄組分析了產(chǎn)黃青霉在葡萄糖、阿拉伯糖與乙醇3種不同碳源條件下的基因表達差異，預(yù)測出5個潛在的阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白，通過驗證發(fā)現(xiàn)，PcAraT可回補酵母中GAL2的缺失，并可進一步提高阿拉伯糖的吸收與利用。由于該轉(zhuǎn)運蛋白的高親和力與專一性、在復(fù)雜碳源中仍保持較高的活性等特點，有望在生物煉制中具有較好的應(yīng)用。

代謝組分析也在碳源利用的優(yōu)化中發(fā)揮重要作用。Kawaguchi等[90]利用胞內(nèi)代謝組分析了谷氨酸棒桿菌對葡萄糖與阿拉伯糖的代謝利用。與許多微生物一樣，谷氨酸棒桿菌也存在葡萄糖抑制效應(yīng)，會優(yōu)先利用葡萄糖，而抑制阿拉伯糖的利用。代謝組分析發(fā)現(xiàn)磷酸烯醇式丙酮酸與丙酮酸的開關(guān)是優(yōu)化阿拉伯糖利用的關(guān)鍵。過表達丙酮酸激酶后，谷氨酸棒桿菌可同時利用葡萄糖與阿拉伯糖，尤其是當敲除阿拉伯糖抑制轉(zhuǎn)錄因子AraR時，可提高阿拉伯糖的利用。這一研究使谷氨酸棒桿菌可以在PTS系統(tǒng)存在下同時利用已糖與戊糖。

2.2 基于系統(tǒng)生物學(xué)的工業(yè)發(fā)酵優(yōu)化放大

2.2.1 工業(yè)發(fā)酵工藝優(yōu)化

多組學(xué)及基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型除在菌株的設(shè)計改造中發(fā)揮著越來越重要的作用外，在工業(yè)發(fā)酵優(yōu)化中也逐漸得到應(yīng)用。

發(fā)酵條件與工藝如溫度、pH、溶氧與底物補料等都是目標產(chǎn)品發(fā)酵性能的重要影響因素，針對特定的工業(yè)菌株，往往需要優(yōu)化其發(fā)酵工藝以達到最優(yōu)的發(fā)酵性能。由于發(fā)酵過程的復(fù)雜性，許多統(tǒng)計方法與數(shù)學(xué)模型不斷用于發(fā)酵優(yōu)化。Jones等[91]利用數(shù)據(jù)驅(qū)動的高斯模型(Empirically-derived scaled-Gaussian model) 對大腸桿菌共培養(yǎng)下的黃酮發(fā)酵過程進行模擬與優(yōu)化。首先利用最小二乘回歸(Least squares regression) 對21個參數(shù)進行擬合，然后利用該模型優(yōu)化如菌株間的適配度、碳源濃度、溫度、誘導(dǎo)時間以及接種比例等發(fā)酵參數(shù)，以獲得最優(yōu)的黃酮類物質(zhì)黃烷(Flavan-3-ols) 的發(fā)酵條件。利用該模型優(yōu)化的條件，可使黃烷的產(chǎn)量提高65%，達到40.7 mg/L，是單菌發(fā)酵的970倍。另外，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)模型(Artificial neural network models，ANN) 也是發(fā)酵過程動態(tài)仿真與優(yōu)化的重要方法。Pappu等[92]利用ANN模型以339個實驗數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集，來系統(tǒng)評估了發(fā)酵pH、溫度與溶氧等條件對卡森德巴利酵母木糖醇生產(chǎn)的影響。

代謝流分析可反映胞內(nèi)真實代謝狀態(tài)，除在代謝改造中，在發(fā)酵工藝優(yōu)化中也被不斷應(yīng)用。Schwechheimer等[93]利用GC/MS、LC/MS與1D-/2D-NMR等多種質(zhì)譜與核磁的方法系統(tǒng)檢測了棉阿舒囊霉在生長與維生素B2等核黃素生產(chǎn)等不同階段的胞內(nèi)代謝物的13C分布，細致刻畫了核黃素代謝流分析。研究發(fā)現(xiàn)，甲酸的跨膜流量變化可能是核黃素合成初期的代謝瓶頸。通過分段補加少量甲酸與絲氨酸的補料方式則可解決一碳原料瞬時供給不足的問題，最終通過增加胞內(nèi)甘氨酸、絲氨酸與甲酸可使核黃素的產(chǎn)量提高45%。

2.2.2 工業(yè)發(fā)酵工藝放大

在工業(yè)發(fā)酵過程，發(fā)酵過程的逐級放大也是非常重要的環(huán)節(jié)。如何有效從實驗室規(guī)模放大到工業(yè)實際生產(chǎn)規(guī)模，還是較大的挑戰(zhàn)。工業(yè)發(fā)酵的規(guī)模往往較大，充分的攪拌是發(fā)酵的關(guān)鍵。不充分的攪拌可能會導(dǎo)致傳質(zhì)傳氧傳熱的不均一，使微生物細胞所處的微環(huán)境不斷變化，如底物、毒性副產(chǎn)物、溶氧、溫度、pH及CO2等，最終導(dǎo)致生物量、轉(zhuǎn)化率與生產(chǎn)速率的不均一，從而形成復(fù)雜的細胞響應(yīng)與代謝變化。

針對這一問題，發(fā)酵過程的多組學(xué)整合分析以及整合流體力學(xué)與細胞代謝動力學(xué)的分析可能成為有效的解決方法[94]。通過對同一細胞工廠在不同發(fā)酵規(guī)模上的比較組學(xué)分析，可揭示出在逐級放大過程中的宏觀發(fā)酵表型與微觀細胞代謝的變化，有助于解決發(fā)酵放大中的瓶頸問題。另外，針對同一發(fā)酵過程中的各組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析及整合模型建立也有助于加深在發(fā)酵過程中細胞內(nèi)各不同分子水平上的動態(tài)變化。同時，13C-代謝流分析也是檢測不同發(fā)酵規(guī)模中細胞代謝變化的有效手段。de Jonge等[95]利用間歇性葡萄糖補料工藝與13C-代謝流相結(jié)合的方法，分析了產(chǎn)黃青霉的青霉素發(fā)酵過程中的碳源充足與饑餓條件下的變化，發(fā)現(xiàn)不同條件下有的胞內(nèi)代謝物的濃度出現(xiàn)100倍的變化。這表明工業(yè)發(fā)酵放大過程，攪拌所帶來的底物供給非均一化，會引起局部微環(huán)境中細胞代謝的劇烈變化，這可能是導(dǎo)致放大效果難以成線性的重要原因。流體動力學(xué)模型(Computational fluid dynamics，CFD)也是預(yù)測不同發(fā)酵規(guī)模下的發(fā)酵條件變化的有力工具[2]，可通過對發(fā)酵罐內(nèi)的傳熱與傳質(zhì)等不同參數(shù)的動態(tài)模擬來發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵工藝控制與放大中的限速步驟。

3 總結(jié)與展望

隨著以DNA測序技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)為代表的組學(xué)技術(shù)與基因組規(guī)模生物網(wǎng)絡(luò)的快速發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)在工業(yè)生物技術(shù)的菌株改造與發(fā)酵過程優(yōu)化中起著越來越重要的作用。結(jié)合許多工業(yè)菌株中高效基因組編輯工具[96-99]、基因精細調(diào)控技術(shù)[100]以及適應(yīng)性進化，系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展也將不斷加速細胞工廠的改造與發(fā)酵優(yōu)化(圖1)[101]。

在細胞工廠的設(shè)計與優(yōu)化中，各組學(xué)及多組學(xué)的整合分析與基因組規(guī)模的生物網(wǎng)絡(luò)模型將是未來的重要研究方向。利用整合多種不同條件的組學(xué)數(shù)據(jù)的生物網(wǎng)絡(luò)，可不斷推進我們對微生物在基因密碼、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯調(diào)控、翻譯后修飾與代謝調(diào)控等各個不同層次上的認識，使基于數(shù)據(jù)模擬與仿真的細胞工廠設(shè)計成為現(xiàn)實，尤其是在復(fù)雜天然產(chǎn)物的人工合成上具有獨特的優(yōu) 勢[102]。此外，針對不同物種的基因組信息挖掘與新酶從頭設(shè)計改造也是細胞工廠的設(shè)計與優(yōu)化的重要方向。

在工業(yè)發(fā)酵過程優(yōu)化中，利用系統(tǒng)生物學(xué)的研究策略正在不斷加深工業(yè)發(fā)酵過程中工業(yè)菌種的細胞代謝動態(tài)變化。各組學(xué)數(shù)據(jù)與一系列宏觀發(fā)酵表型數(shù)據(jù)以及發(fā)酵罐的流體動力學(xué)數(shù)據(jù)[2]的整合分析，也是未來從微觀到宏觀、從分子水平到發(fā)酵水平系統(tǒng)認識工業(yè)發(fā)酵過程，并實現(xiàn)高效放大優(yōu)化的有效策略。

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Systems biology for industrial biotechnology

Xiaomei Zheng1,2,3, Ping Zheng1,2,3, and Jibin Sun1,2,3

1 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

In industrial biotechnology, microbial cell factories utilize renewable resources to produce energy, materials and chemicals. Industrial biotechnology plays an increasingly important role in solving the resource, energy and environmental problems. Systems biology has shed new light on industrial biotechnology, deepening our understanding of industrialmicrobial cell factories and their bioprocess from “Black-box” to “White-box”. Systems-wide profiling of genome, transcriptome, proteome, metabolome, and fluxome has proven valuable to better unveil network operation and regulation on the genome scale. System biology has been successfully applied to create microbial cell factories for numerous products and derive attractive industrial processes, which has constantly expedited the development of industrial biotechnology. This review focused on the recent advance and applications of omics and trans-omics in industrial biotechnology, including genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics, fluxomics and genome scale modeling, and so on. Furthermore, this review also discussed the potential and promise of systems biology in industrial biotechnology.

industrial biotechnology, system biology, multi-omics, strain design, fermentation optimization

10.13345/j.cjb.190217

孫際賓 博士，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所副所長，中國科學(xué)院“百人計劃”入選者，中國科學(xué)院特聘研究員，中國科學(xué)院科技創(chuàng)新交叉與合作團隊牽頭人，中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會理事。致力于發(fā)展工業(yè)微生物的系統(tǒng)與合成生物技術(shù)，以復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)研究為基礎(chǔ)，整合組學(xué)數(shù)據(jù)，解析工業(yè)微生物的高產(chǎn)抗逆分子基礎(chǔ)和代謝瓶頸，設(shè)計和創(chuàng)造符合工業(yè)化需求的微生物。承擔(dān)了國家自然科學(xué)基金、973計劃、863計劃、中科院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計劃 (STS計劃)、中科院科技創(chuàng)新交叉與合作團隊、天津市首批A類重點領(lǐng)域創(chuàng)新團隊以及多個企業(yè)合作項目。已發(fā)表SCI論文90余篇，申請中國發(fā)明專利30余項，獲中國專利授權(quán)9項，PCT專利2項，曾獲教育部提名國家技術(shù)發(fā)明獎二等獎與中國產(chǎn)學(xué)研合作創(chuàng)新成果獎等。

鄭平 博士，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員，天津市濱海新區(qū)“131”人才工程第二層次人才，天津市三八紅旗手，天津市濱海新區(qū)第三屆人大代表。長期從事細菌的代謝工程改造和系統(tǒng)生物學(xué)研究，致力于創(chuàng)建綠色、高效、低成本的生物制造體系，創(chuàng)新現(xiàn)代生物技術(shù)，提升推動傳統(tǒng)生物及化工企業(yè)轉(zhuǎn)型升級，承擔(dān)國家自然科學(xué)基金面上項目、863計劃、中科院知識創(chuàng)新工程重要方向項目、天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃項目，并參與973項目與中科院知識創(chuàng)新工程項目等，已發(fā)表SCI論文20余篇，申請中國發(fā)明專利20余項，PCT專利2項，已獲中國專利授權(quán)9項。

鄭小梅, 鄭平, 孫際賓. 面向工業(yè)生物技術(shù)的系統(tǒng)生物學(xué). 生物工程學(xué)報, 2019, 35(10): 1955–1973.

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May 28, 2019;

August 5, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31700085, 31370113).

Jibin Sun. Tel: +86-22-84861949; Fax: +86-22-84861943; E-mail: sun_jb@tib.cas.cn

Ping Zheng. Tel: +86-22-84861945; Fax: +86-22-84861943; E-mail: zheng_p@tib.cas.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31700085, 31370113) 資助。

2019-08-23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190823.1520.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)