典型工業(yè)發(fā)酵過程環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為與系統(tǒng)優(yōu)化

丁健，羅洪鎮(zhèn)，史仲平

典型工業(yè)發(fā)酵過程環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為與系統(tǒng)優(yōu)化

丁健1，羅洪鎮(zhèn)2，史仲平1

1 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122 2 淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003

工業(yè)發(fā)酵過程中，當(dāng)細(xì)胞遭受到極端環(huán)境脅迫或劇烈環(huán)境變化時(shí)，細(xì)胞必須要作出必要的舉動(dòng)來適應(yīng)環(huán)境的劇烈變化。細(xì)胞的自適應(yīng)行為有可能不能應(yīng)對(duì)劇烈的環(huán)境變化，導(dǎo)致發(fā)酵失敗；但也有可能產(chǎn)生意想不到的效果，改善發(fā)酵性能。文中以畢赤酵母生產(chǎn)異源蛋白和丁醇發(fā)酵過程為例，闡述了環(huán)境變化條件下的細(xì)胞自適應(yīng)行為及其基于自適應(yīng)行為的發(fā)酵過程優(yōu)化方法和策略，為利用基于細(xì)胞自適應(yīng)行為的發(fā)酵過程優(yōu)化提供參考。

細(xì)胞自適應(yīng)行為，環(huán)境變化，發(fā)酵過程優(yōu)化，異源蛋白生產(chǎn)，丁醇發(fā)酵

工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)在我國國民經(jīng)濟(jì)中占重要地位，如何深化工業(yè)發(fā)酵的內(nèi)涵和外延是發(fā)酵領(lǐng)域科研工作者需要深思的重要問題。近年來，通過先進(jìn)生物技術(shù)的創(chuàng)新實(shí)現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵的系統(tǒng)優(yōu)化得到了廣泛關(guān)注，而微生物菌株是工業(yè)發(fā)酵的核心要素。但是，在工業(yè)發(fā)酵過程中，操作模式經(jīng)常需要進(jìn)行改變(如溫度、底物切換、操作環(huán)境、環(huán)境脅迫等)，微生物細(xì)胞必須對(duì)上述環(huán)境變化作出適應(yīng)，以確保自我生存。上述細(xì)胞自適應(yīng)行為將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部基因轉(zhuǎn)錄、關(guān)鍵生物酶活性、代謝流、電子流等發(fā)生變化，并最終在發(fā)酵性能上得到體現(xiàn)。有時(shí)發(fā)酵性能可以得到提高，有時(shí)則惡化。如何充分利用“細(xì)胞自適應(yīng)行為”，改善或穩(wěn)定發(fā)酵性能是本綜述所要探討的主要內(nèi)容。

1 環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為與系統(tǒng)優(yōu)化

1.1 環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為

細(xì)胞自適應(yīng)行為有兩種類型：1) 隱性自適應(yīng)，也就是說即使由于細(xì)胞自適應(yīng)、其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但表觀發(fā)酵參數(shù)卻沒什么變化[1-2]，很長時(shí)間以后發(fā)酵性能的差異才能得到體現(xiàn)；2) 顯性自適應(yīng)，當(dāng)環(huán)境條件或操作變量發(fā)生后，表觀發(fā)酵參數(shù)很快就會(huì)發(fā)生顯著變化。比較典型的例子包括：在高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中，將稀釋速率直接設(shè)定為0.04 h?1，發(fā)酵過程可以達(dá)到穩(wěn)態(tài)；而將稀釋速率由0.027 h?1切換至0.04 h?1后，過程則在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)入到周期振蕩狀態(tài)[3]；在丁醇發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酸期后添入廢棄畢赤酵母處理懸濁液，發(fā)酵產(chǎn)氣量迅速大幅增加[4]。細(xì)胞的這種自適應(yīng)行為對(duì)于提高發(fā)酵性能指標(biāo)，有時(shí)是有利 的[3-4]，有時(shí)則是有害的，必須通過一定的控制手段將其抑制或排除，以確保發(fā)酵性能的穩(wěn)定[2]。

1.2 利用細(xì)胞自適應(yīng)行為的過程優(yōu)化

利用細(xì)胞的這種自適應(yīng)行為改善發(fā)酵過程性能是可能的。以顯性自適應(yīng)行為為例，在高濃度乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中，細(xì)胞自適應(yīng)所引發(fā)的周期振蕩狀態(tài)可以降低殘?zhí)菨舛?、提高乙醇平均濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度[3]。在利用帶遺傳質(zhì)粒的釀酒酵母分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)b-半乳糖苷酶時(shí)，利用周期控制策略強(qiáng)行將葡萄糖濃度從“過量”向“匱乏”的狀態(tài)進(jìn)行切換，并重復(fù)4–5個(gè)周期，可將細(xì)胞遺傳質(zhì)粒的脫落率控制在較低水平，提高b-半乳糖苷酶的產(chǎn)量[5]。具有隱性自適應(yīng)特征的發(fā)酵過程也可以利用數(shù)據(jù)聚類、代謝分析等手段[1-2]找出原因后，對(duì)有害的細(xì)胞自適應(yīng)行為加以抑制，同樣也可以優(yōu)化發(fā)酵過程[2]。

2 利用細(xì)胞自適應(yīng)行為的優(yōu)化

2.1 畢赤酵母高效生產(chǎn)異源蛋白

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母能夠在以甲醇為唯一碳源的條件下生長，基于這一特性開發(fā)出的表達(dá)系統(tǒng)是一種應(yīng)用廣泛的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)通過誘導(dǎo)醇氧化酶啟動(dòng)子(Alcohol oxidase，AOX)進(jìn)行異源蛋白的合成。在異源蛋白表達(dá)過程中，甲醇起著碳源、能源和誘導(dǎo)劑的三重作用。與大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)除了具有遺傳操作簡單、細(xì)胞生長快、易于培養(yǎng)等原核生物的特點(diǎn)外，還具有真核生物特有的加工、修飾蛋白的功能。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)效率高、外源基因遺傳穩(wěn)定、易實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)、蛋白翻譯后可被正確加工、蛋白產(chǎn)物分泌于胞外等眾多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為極受青睞的外源蛋白表達(dá)宿主，產(chǎn)品種類涉及藥物蛋白、抗體、酶制劑、食品添加劑等。畢赤酵母表達(dá)宿主菌株主要包括兩種表型，即甲醇利用慢型菌(MutS) 和甲醇利用快型菌(Mut+)。Mut+型菌的AOX由1和2基因共同編碼，胞內(nèi)AOX活性高、細(xì)胞利用甲醇速度快；而MutS型菌1基因缺失，AOX僅由2一個(gè)基因編碼，因此其胞內(nèi)AOX活性較低，細(xì)胞利用甲醇的速度較慢。

典型的、利用重組畢赤酵母高密度培養(yǎng)生產(chǎn)異源蛋白的發(fā)酵過程可以大致分為細(xì)胞培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)兩個(gè)階段。在培養(yǎng)階段，適宜的環(huán)境條件(如溶解氧濃度DO、甘油濃度等) 是細(xì)胞快速生長，同時(shí)保證細(xì)胞以較高生理活性狀態(tài)進(jìn)入誘導(dǎo)階段的前提條件[6]。誘導(dǎo)階段中的環(huán)境條件(如溫度、甲醇濃度、DO等) 則決定了異源蛋白的表達(dá)水平[7-9]。畢赤酵母對(duì)培養(yǎng)和誘導(dǎo)階段環(huán)境的綜合自適應(yīng)調(diào)節(jié)能力決定了細(xì)胞自身的生理狀態(tài)，并最終影響到異源蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、分泌，特別是最終的發(fā)酵性能指標(biāo)。

2.1.1 細(xì)胞高密度培養(yǎng)條件下異源蛋白表達(dá)主要抑制物乙醇的控制方法

在使用MutS型畢赤酵母表達(dá)豬a干擾素(pIFN-a) 的過程中，即便采用相同的甘油流加策略和甲醇誘導(dǎo)控制策略，發(fā)酵性能也會(huì)表現(xiàn)出很大的差異[1]?！罢０l(fā)酵”批次的pIFN-a抗病毒活性在106–107IU/mL，而“異常發(fā)酵”批次的pIFN-a抗病毒活性只有105IU/mL，甚至更低。

在細(xì)胞培養(yǎng)階段，所有10個(gè)發(fā)酵批次的DO變化、最終細(xì)胞濃度和甘油耗量是基本一致的。將誘導(dǎo)期內(nèi)的各種表觀數(shù)據(jù)的組合(O2攝取速度OUR、CO2釋放速度CER、呼吸商RQ、甲醇濃度和流加速度) 在二維平面上進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，“正常”發(fā)酵批次的表觀數(shù)據(jù)基本聚類于幾個(gè)特定區(qū)域，而“異?！卑l(fā)酵批次的表觀數(shù)據(jù)則散落于平面的各處(圖1)。

葡萄糖效應(yīng)(Crabtree effect) 是細(xì)胞高密度培養(yǎng)時(shí)普遍存在的現(xiàn)象。有報(bào)道指出，在重組釀酒酵母和大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的過程中，葡萄糖過量流加會(huì)導(dǎo)致代謝副產(chǎn)物乙醇和乙酸的積累，這本身就是細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境的一種隱性自適應(yīng)行為，其結(jié)果最終導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)水平和發(fā)酵穩(wěn)定性顯著下降[10–11]。即便乙醇或乙酸被耗盡，這種發(fā)酵性能惡化也無法避免。細(xì)胞長時(shí)間處在高乙醇或高乙酸濃度環(huán)境，其功能骨架受到嚴(yán)重破壞，進(jìn)而抑制目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)，而且這種抑制作用還是不可逆的。重組菌功能骨架因代謝副產(chǎn)物的嚴(yán)重積累而受到破壞是一種典型的和具有負(fù)面效應(yīng)的“細(xì)胞隱性自適應(yīng)”現(xiàn)象。因此，必須在細(xì)胞培養(yǎng)期遏制住上述“細(xì)胞隱性自適應(yīng)”現(xiàn)象，才能保證發(fā)酵性能的穩(wěn)定。

圖1 誘導(dǎo)期“正?！焙汀爱惓！卑l(fā)酵批次的表觀(在線測量)數(shù)據(jù)在二維平面上的聚類(純甲醇誘導(dǎo))

畢赤酵母表達(dá)pIFN-a過程中，上述“細(xì)胞隱性自適應(yīng)”行為(葡萄糖效應(yīng)) 也會(huì)出現(xiàn)。在細(xì)胞流加培養(yǎng)期，使用傳統(tǒng)DO-Stat甘油流加策略時(shí)，某些批次的最終pIFN-a濃度也可以達(dá)到相當(dāng)高的水平。如批次#1，最大乙醇濃度相對(duì)較低 (4.37 g/L) 且細(xì)胞處于高乙醇濃度環(huán)境的時(shí)間比較短(圖2，表1)。有時(shí)乙醇濃度高(7.08 g/L) 且細(xì)胞處于高乙醇濃度環(huán)境的時(shí)間較長，進(jìn)入誘導(dǎo)期后AOX根本無法正常啟動(dòng)，pIFN-a濃度很低(批次#3)。pIFN-a發(fā)酵性能不穩(wěn)定的原因就在于此。商業(yè)化的甲醇電極，可以同時(shí)在線檢測甲醇和乙醇：細(xì)胞培養(yǎng)階段發(fā)酵液只含有乙醇；進(jìn)入到誘導(dǎo)階段后，由于前期積累的乙醇全部消耗殆盡，發(fā)酵液中僅含有甲醇。因此，甲醇電極可以分別用于在線檢測細(xì)胞培養(yǎng)階段的乙醇和誘導(dǎo)階段的甲醇濃度，且互不干擾。在此基礎(chǔ)上，提出了一種基于乙醇/DO在線測量的“改良型”DO-Stat甘油流加控制策略，根據(jù)乙醇濃度測量值自動(dòng)調(diào)節(jié)DO-Stat策略的流加延遲時(shí)間，交替利用甘油和積累的乙醇作為碳源，可以將培養(yǎng)期內(nèi)的乙醇濃度控制在任意水平?？刂埔掖紳舛仍诘退?約2.0 g/L)，則AOX被激活，pIFN-a表達(dá)順利穩(wěn)定地進(jìn)行；控制乙醇濃度在高水平(約10.0 g/L)，則AOX被抑制，pIFN-a表達(dá)無法進(jìn)行(圖2， 表1)。高效穩(wěn)定的pIFN-a表達(dá)控制策略得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[2]。

2.1.2 聯(lián)合操控DO和甲醇誘導(dǎo)濃度促進(jìn)異源蛋白表達(dá)

在確保重組菌達(dá)到高密度，且其功能骨架完整健全后，發(fā)酵就進(jìn)入到甲醇誘導(dǎo)階段。誘導(dǎo)階段的主要目標(biāo)就是通過合理地控制誘導(dǎo)條件，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量或活性的最大化。甲醇誘導(dǎo)體系的一個(gè)最主要的特征就是高耗氧，甲醇濃度和溶解氧濃度DO是影響誘導(dǎo)性能和目標(biāo)代謝產(chǎn)物表達(dá)水平的主要操作或控制參數(shù)。甲醇消耗與O2消耗相互耦聯(lián)，在使用空氣的條件下很難同時(shí)將甲醇和DO控制在相應(yīng)的設(shè)定水平。這時(shí)，只能選擇其中一個(gè)參數(shù)并將其優(yōu)先控制于設(shè)定水平。因此，可行的甲醇和DO控制模式就只有以下兩種，即“高甲醇濃度/低DO”或“高DO/低甲醇濃度”。Mut+和MutS型的畢赤酵母是兩種最常用的表達(dá)宿主，但是，兩種模式菌株對(duì)不同控制環(huán)境的自適應(yīng)行為是不同的[12-15]，難以形成統(tǒng)一的最優(yōu)控制標(biāo)準(zhǔn)。有研究者針對(duì)利用Mut+和MutS型畢赤酵母表達(dá)目標(biāo)產(chǎn)物提出了不同的、但具有一定普適效果的DO/甲醇濃度“次優(yōu)(Sub-optimal)”聯(lián)合操控方案，并對(duì)“次優(yōu)控制”條件下的細(xì)胞自適應(yīng)行為與系統(tǒng)優(yōu)化機(jī)理進(jìn)行了歸納總結(jié)[16–17]。

圖2 使用不同甘油流加控制策略時(shí)，培養(yǎng)期內(nèi)的乙醇、DO、甘油流加速度和細(xì)胞濃度的變化模式

表1 不同控制策略下的豬a干擾素的發(fā)酵性能和甲醇代謝關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄水平

Note: 1) ?: Refers to the gene transcriptional data collected at 40 h after initiating methanol induction; 2) Methanol/sorbitol co-feeding induction mode was adopted; 3) Methanol/sorbitol co-feeding ratio of 1:1 was applied for runs #1–#7, but 4:1 for run #8; 4) N/A presented no measurements.

MutS和Mut+型畢赤酵母在“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”誘導(dǎo)模式下顯示出不同的顯性自適應(yīng)行為表征。有研究[16-17]以一株產(chǎn)人血清白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體融合蛋白(HSA- GCSFm) 的Mut+型和一株產(chǎn)pIFN-a的MutS型重組畢赤酵母為模式菌株，探討了二者在“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”模式下的發(fā)酵性能差異，并與文獻(xiàn)結(jié)果[12-13,18-21]進(jìn)行了綜合分析比較。對(duì)Mut+型畢赤酵母而言，通過限制甲醇流加的方式可將DO控制在10%左右，此時(shí)甲醇濃度降低到接近于0 g/L的水平，形成了“高DO/低甲醇”的誘導(dǎo)環(huán)境，誘導(dǎo)50 h后HSA-GCSFm濃度達(dá)到587.5 mg/L。而利用在線甲醇電極將甲醇濃度控制在5–8 g/L的較高水平，由于甲醇供應(yīng)充足、耗氧劇烈，DO迅速降至接近于0%的低水平，形成了“高甲醇/低DO”的誘導(dǎo)環(huán)境，誘導(dǎo)50 h后HSA-GCSFm濃度僅有88.5 mg/L。但是，MutS型菌卻表現(xiàn)出與Mut+型菌截然相反的特性：同樣，在限制甲醇流加的條件下，可將DO控制在10%左右，甲醇濃度自然降低到接近于0 g/L的水平，形成了“高DO/低甲醇”的誘導(dǎo)環(huán)境，但誘導(dǎo)70 h后pIFN-a濃度僅有0.79 g/L。而將甲醇濃度控制在5–8 g/L的較高水平，DO自然降低到接近于0%的低水平，形成“高甲醇/低DO”的誘導(dǎo)環(huán)境，誘導(dǎo)70 h后pIFN-a濃度則高達(dá)1.86 g/L。

Mut+型畢赤酵母生產(chǎn)異源蛋白時(shí)，用限制碳源流加的方式來提高DO水平，甲醇濃度雖然很低，但細(xì)胞消耗利用甲醇速率的變化不大(僅降低10%左右)，這增加了甲醇利用效率，促進(jìn)了異源蛋白的高效表達(dá)。而MutS型畢赤酵母生產(chǎn)異源蛋白時(shí)，限制碳源流加雖然提高了DO水平，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致甲醇消耗速率大幅下降(超過50%)，進(jìn)而減少異源蛋白合成過程所需的碳源供給，顯著降低了異源蛋白的表達(dá)水平。以上結(jié)果總結(jié)歸納在表2中，總的結(jié)論就是：Mut+型畢赤酵母的“次優(yōu)誘導(dǎo)控制”策略是“高DO/低甲醇”；而MutS型畢赤酵母的“次優(yōu)誘導(dǎo)控制”策略則是在“高甲醇/低DO”。從轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的角度研究了Mut+型和MutS型畢赤酵母應(yīng)對(duì)不同“次優(yōu)控制”誘導(dǎo)環(huán)境的自適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制：Mut+型菌在“高DO/低甲醇” (甲醇/山梨醇共混誘導(dǎo)) 的誘導(dǎo)環(huán)境下，上調(diào)的基因主要集中在甲醇主代謝、TCA循環(huán)和過氧化物酶體合成途徑中，下調(diào)的基因則主要集中在蛋白水解過程中。表明在該誘導(dǎo)條件下，甲醇和山梨醇的代謝活性高，細(xì)胞抗高DO沖擊能力強(qiáng)，錯(cuò)誤折疊的蛋白減少。而MutS型菌在“高甲醇/低DO”的誘導(dǎo)環(huán)境下，上調(diào)基因主要集中于甲醇代謝、過氧化物酶體合成和核糖體蛋白合成途徑中，甲醇代謝和異源蛋白合成得到促進(jìn)[17]。

表2 “高甲醇濃度-低DO”和“低甲醇濃度-高DO”誘導(dǎo)模式下Mut+和MutS型畢赤酵母異源蛋白表達(dá)量比較

Note: 1) N/A represented that the data not found; 2)?: Using the enzymatic data to replace the concentrations data.

2.1.3 甲醇濃度周期控制強(qiáng)化MutS型畢赤酵母表達(dá)外源蛋白

將狀態(tài)變量(如濃度、比生長速度、底物比消耗速度等) 定值控制在恒定水平，是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化的普遍控制方法。但是，周期控制(Periodic control)，無論是自發(fā)式的[22]還是強(qiáng)制式的[5]，在某些特定情況下比定值控制具有優(yōu)勢。所謂周期控制，就是將狀態(tài)變量以一定的頻率在兩種不同的狀態(tài)之間反復(fù)切換，并具有一定數(shù)量的周期重復(fù)循環(huán)次數(shù)。

周期控制在發(fā)酵過程控制領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用和研究報(bào)道[4-5,23-24]。實(shí)際上，周期控制與細(xì)胞自適應(yīng)行為和基于自適應(yīng)行為的過程優(yōu)化密切相關(guān)。比如，Ye等[23]利用費(fèi)氏丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在厭氧環(huán)境中生長較快，但是長期在厭氧環(huán)境中培養(yǎng)，生成的丙酸濃度較高，會(huì)抑制細(xì)胞生長。細(xì)胞長期處在有氧環(huán)境下會(huì)造成細(xì)胞生長速率和產(chǎn)物合成大幅下降。因此，采用一種周期性的、在有氧和厭氧環(huán)境進(jìn)行切換的操作方法來解決上述問題。與傳統(tǒng)厭氧發(fā)酵相比，利用上述“周期控制”發(fā)酵的細(xì)胞濃度提高了189%，丙酸控制在較低水平(5.08 g/L?2.78 g/L)，維生素B12產(chǎn)量提高了 1倍左右。馬善康等[24]通過大幅改變發(fā)酵環(huán)境，利用雙碳源(甲醇和甘油) 交替刺激畢赤酵母高效表達(dá)人尿激酶原，5 L罐上的發(fā)酵結(jié)果表明，與對(duì)照相比(單純流加甲醇)，雙碳源交替刺激法的人尿激酶原酶活可以提高57%。

MutS型畢赤酵母嗜好“高甲醇/低DO”的誘導(dǎo)環(huán)境，在利用MutS型畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)pIFN-a和人源溶菌酶(hLYZ) 的過程中，通常將甲醇濃度控制在5–10 g/L。但是如果細(xì)胞長期處于“高甲醇/低DO”的誘導(dǎo)環(huán)境，由于O2匱乏，由AOX催化的甲醇代謝的第一步反應(yīng)(甲醇+O2?甲醛) 成了律速反應(yīng)步驟。這時(shí)，甲醇(有毒物質(zhì)) 不斷地跨膜進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，卻又無法高效消耗利用，胞內(nèi)積累嚴(yán)重，最終造成細(xì)胞代謝活性和目標(biāo)蛋白合成能力逐步下降，限制了目標(biāo)產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)效率的提升。為解決這一問題，有研究提出了一種新穎的周期甲醇誘導(dǎo)控制策略，并將其用于MutS型畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)pIFN-a和hLYZ的過程中[25]。研究的基本思路如圖3所示。使用傳統(tǒng)的“高甲醇/低DO”誘導(dǎo)策略，甲醇和DO長時(shí)間處于高濃度和低濃度，會(huì)造成毒性物質(zhì)甲醇在胞內(nèi)的積累；而在“高DO/低甲醇”的極端誘導(dǎo)環(huán)境下，細(xì)胞可以吸收并有效利用胞內(nèi)的毒性物質(zhì)甲醇合成目標(biāo)產(chǎn)物。甲醇周期誘導(dǎo)控制就是利用上述兩種極端誘導(dǎo)環(huán)境下的細(xì)胞自適應(yīng)特性，在“高甲醇/低DO”的誘導(dǎo)環(huán)境下，增強(qiáng)誘導(dǎo)強(qiáng)度(T1= 7 h)；而在“高DO/低甲醇”的誘導(dǎo)環(huán)境下，旨在解除胞內(nèi)甲醇毒性作用，恢復(fù)細(xì)胞的代謝活性(T2=4 h)。圖5對(duì)每一完整控制周期內(nèi)的T1和T2進(jìn)行了優(yōu)化。以此循環(huán)往復(fù)，持續(xù)5–6個(gè)周期。相比于傳統(tǒng)的定值控制策略(甲醇濃度和DO定值控制)，使用該甲醇周期控制策略進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，兩種目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量和活性都有大幅提升。表達(dá)生產(chǎn)pIFN-a時(shí)，使用傳統(tǒng)的甲醇濃度定值控制策略(8–10 g/L)，胞內(nèi)甲醇濃度最高可達(dá)0.014 g/g DCW，誘導(dǎo)后期pIFN-a不能持續(xù)表達(dá)。而使用周期誘導(dǎo)控制時(shí)，甲醇誘導(dǎo)強(qiáng)度并沒有受到太大影響，胞內(nèi)甲醇濃度控制在極低水平(≤0.003 g/g DCW)，pIFN-a抗病毒活性達(dá)到水平3.90×107IU/mL，比使用“甲醇濃度定值控制”策略時(shí)提高了86%，與低溫、通純O2進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)時(shí)的水平相當(dāng)[26](圖4)。代謝強(qiáng)度(OUR、CER) 維持在較高水平，甲醇比消耗速率也有提高。表達(dá)生產(chǎn)hLYZ時(shí)，使用周期誘導(dǎo)控制也可將胞內(nèi)甲醇濃度控制在低水平，最終hLYZ酶活達(dá)到2.15×105IU/mL，比使用“高甲醇/低DO”誘導(dǎo)控制策略提高了69%。周期誘導(dǎo)控制策略能提高M(jìn)utS型畢赤酵母生產(chǎn)異源蛋白的通用性得到了一定程度的驗(yàn)證。甲醇周期誘導(dǎo)控制策略有效整合了“高甲醇/低DO”和“高DO/低甲醇”兩種極端誘導(dǎo)環(huán)境下細(xì)胞自適應(yīng)行為的優(yōu)點(diǎn)，使得目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量和活性得到大幅改善。

圖3 甲醇周期誘導(dǎo)控制提高發(fā)酵性能的概念圖

2.2 丁醇 (丙酮A-丁醇B-乙醇E，ABE) 發(fā)酵過程中的細(xì)胞自適應(yīng)行為及其優(yōu)化

丁醇和丙酮都是重要的平臺(tái)化合物。另外，它們也都是清潔/高效的液態(tài)燃料或燃料添加劑。丁醇作為燃料添加劑使用時(shí)，其許多性能均優(yōu)于乙醇[27-31]。丙酮也是高效的柴油助燃劑，可以大幅改善柴油的燃燒性能，燃燒后產(chǎn)生的尾氣中SOX和NOX含量低[32-33]。丙酮是丁醇發(fā)酵的主要副產(chǎn)物(丁醇60%、丙酮30%)。隨著化石資源的日益枯竭，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇和丙酮重新受到人們的重視。目前國內(nèi)外科研人員對(duì)丁醇發(fā)酵的研究主要包括代謝工程改造微生物細(xì)胞、利用廉價(jià)原料發(fā)酵生產(chǎn)丁醇、通過分離耦合技術(shù)解除丁醇對(duì)微生物細(xì)胞的抑制作用以及發(fā)酵過程優(yōu)化與控制策略改善丁醇發(fā)酵性能等。關(guān)于上述幾個(gè)方面的相關(guān)綜述和成果最近幾年已有較多論文發(fā)表[34-35]，在此不再贅述。這里，主要針對(duì)丁醇發(fā)酵過程環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為與系統(tǒng)優(yōu)化方面進(jìn)行探討，為丁醇發(fā)酵過程優(yōu)化提供新的思路和參考。

2.2.1 電子受體添加條件下的梭菌生理代謝自適應(yīng)特征以及丁醇合成的強(qiáng)化

提高丁醇產(chǎn)量、丁醇/丙酮比或丁醇占總?cè)軇┍壤歉纳贫〈及l(fā)酵性能的主要目標(biāo)。添加電子載體(如中性紅、甲基紫等) 可導(dǎo)致丙丁梭菌胞內(nèi)的代謝流發(fā)生變化，是提高丁醇/丙酮比的比較公認(rèn)的手段[36]，但是，丁醇/丙酮比的提升實(shí)際上是以降低丙酮濃度或總ABE濃度為代價(jià)的。另外，電子載體一般是對(duì)細(xì)胞有毒的化學(xué)染料或色素，其添加增加了產(chǎn)品分離純化過程的操作成本。

圖4 甲醇周期控制策略下的pIFN-a發(fā)酵性能

圖5 理論確定每一誘導(dǎo)周期內(nèi)的T1和T2

最近，有研究提出了電子受體添加策略強(qiáng)化丁醇合成的新型發(fā)酵策略[37]。外添Na2SO4/CaSO4等電子受體后，梭菌胞內(nèi)發(fā)生硫還原反應(yīng)，少量的SO42–被還原成H2S。該反應(yīng)打破了胞內(nèi)H+/e–的原有平衡，造成e–相對(duì)過剩和H+相對(duì)匱乏。這時(shí)，細(xì)胞為了自身正常生存，必須要恢復(fù)H+/e–的原有平衡。在梭菌胞內(nèi)電子穿梭傳遞系統(tǒng)中，NADH再生反應(yīng)和H2合成反應(yīng)都需要H+和e–，并因此產(chǎn)生競爭。但NADH再生反應(yīng)中e–的需求量是H2合成反應(yīng)中e–需求量的2倍，在H+相對(duì)匱乏的情況下，為了消耗過量的e–，更多的e–/H+(電子/質(zhì)子對(duì)) 必須向NADH再生途徑遷移，使得丁醇合成得到強(qiáng)化(圖6)。在此過程中，細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的自適應(yīng)行為得到了充分體現(xiàn)。7 L厭氧發(fā)酵罐下，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入到產(chǎn)溶劑期后，在發(fā)酵液中添加2.0 g/L的CaSO4或Na2SO4，最終丁醇濃度分別達(dá)到12.80 g/L和12.94 g/L，比不添加電子受體的發(fā)酵批次的相應(yīng)值提高35%左右，丁醇/丙酮比也有一定幅度的增加(15%)。添加Na2SO4等廉價(jià)電子受體提高了丁醇濃度，雖然提高幅度有限，但通過合理地利用細(xì)胞自適應(yīng)行為，可為改善丁醇發(fā)酵性能提供一條新的途徑和優(yōu)化模式。

圖6 電子受體添加條件下的丙丁梭菌代謝簡圖

2.2.2 梭菌/釀酒酵母混菌培養(yǎng)改善丁醇發(fā)酵性能

混菌培養(yǎng)作為一種重要的發(fā)酵技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、生物降解和生物燃料生產(chǎn)等領(lǐng)域。近幾年，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，研究者們已經(jīng)將混菌培養(yǎng)技術(shù)用于丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)。Tran等[38]將丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行混菌培養(yǎng)，由于芽孢桿菌分泌a-淀粉酶，并在其生長過程中消耗培養(yǎng)液中的氧氣，而自產(chǎn)的a-淀粉酶可以將淀粉分解為單糖，在無需對(duì)可溶性淀粉進(jìn)行預(yù)處理的前提下改善了丁醇的發(fā)酵性能。Li等[39]將拜氏梭菌和酪丁酸梭菌混合培養(yǎng)，拜氏梭菌可以將酪丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸直接用于丁醇合成。在某些混合培養(yǎng)體系中，“輔菌”被置于惡劣的生存環(huán)境之下?！拜o菌”為了生存，通過其自適應(yīng)行為被迫釋放出某些有益于“主菌”生存或代謝的物質(zhì)或輔因子，而“主菌”則通過充分利用上述物質(zhì)，提高其自身的發(fā)酵性能。Ashe等[40]發(fā)現(xiàn)，在10 g/L的高濃度丁醇環(huán)境下，釀酒酵母會(huì)發(fā)生適應(yīng)性改變，胞內(nèi)翻譯過程中的真核起始因子2B活性被抑制，胞內(nèi)氨基酸存留在“氨基酸池”中。如果將釀酒酵母置于高丁醇脅迫環(huán)境下，使其從“氨基酸池”中分泌一定量的有益于丁醇合成和梭菌耐受生存的氨基酸，將有望提高丁醇發(fā)酵性能。

基于以上分析，Luo等提出了混菌培養(yǎng)丁醇發(fā)酵策略：當(dāng)丁醇發(fā)酵進(jìn)入到產(chǎn)溶劑期后，添加少量活性釀酒酵母(輔菌，0.2 g DCW/L)。釀酒酵母在惡劣的生存環(huán)境(37 ℃、嚴(yán)格厭氧) 下，可釋放出苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和賴氨酸 4種有益于丁醇合成的氨基酸，但釋放量(濃度) 有限；總葡萄糖消耗速度提高，但梭菌(主菌) 的葡萄糖消耗速度反而有所下降；總ABE產(chǎn)量提高，ABE產(chǎn)量的提高完全得益于乙醇濃度的大幅上升(2.0–3.0 g/L?8.4 g/L)，混菌培養(yǎng)的優(yōu)越性沒有得到體現(xiàn)。于是，在添加活性釀酒酵母的同時(shí)外添4.0 g/L的丁酸，這時(shí)，丁醇發(fā)酵性能得到了極大的改善。首先，在丁醇/丁酸同時(shí)存在的情況下，釀酒酵母生存環(huán)境更加惡劣，被迫釋放出更多的上述4種“有益”氨基酸，氨基酸濃度大幅度提高，可以進(jìn)入到梭菌胞內(nèi)，強(qiáng)化梭菌對(duì)高丁醇濃度環(huán)境的耐受能力；其次，丁酸的添入壓制住了釀酒酵母的乙醇合成和對(duì)葡萄糖的消耗；最后，丁酸雖然是丁醇的合成前體之一，但它對(duì)梭菌細(xì)胞具有毒性。丁酸進(jìn)入梭菌胞內(nèi)后，必須通過代謝反應(yīng)Butyrate?Butyryl-CoA?Butanol將其排出胞外，而Butyryl-CoA?Butanol這步反應(yīng)又依賴于NADH。過量的NADH需求，必然誘發(fā)和刺激梭菌對(duì)葡萄糖的利用消耗和NADH的再生(速率)。以上因素造就了如下結(jié)果：在7 L厭氧發(fā)酵罐中，實(shí)施上述“丙丁梭菌/釀酒酵母混菌培養(yǎng)耦聯(lián)丁酸外添”的發(fā)酵策略(圖7)，丁醇濃度從對(duì)照的11.63 g/L大幅提高至15.74 g/L，丁醇/丙酮比也從對(duì)照的1.98猛增至2.83[41]。為降低發(fā)酵成本，使用酪丁酸梭菌厭氧發(fā)酵濃縮液替代化學(xué)合成丁酸，丁醇濃度可提高到16.34 g/L的最高水平，丁醇/丙酮比達(dá)到3.02[42]。充分利用“主菌”和“輔菌”的自適應(yīng)舉動(dòng)，極大地提高了丁醇發(fā)酵的性能。

2.2.3 調(diào)控還原力再生速率提高丙酮生物合成和丙酮/丁醇比

丁醇是丁醇發(fā)酵或ABE發(fā)酵的主產(chǎn)物，提高丁醇濃度和丁醇/丙酮比是ABE發(fā)酵的首要性能指標(biāo)。但是，在維持原有丁醇濃度基本不變的基礎(chǔ)上，提高主要副產(chǎn)物丙酮濃度也可以認(rèn)為是改善ABE發(fā)酵性能的另一個(gè)重要指標(biāo)[43]。目前，自然界中還沒有專一性合成丙酮的微生物，從生命周期評(píng)價(jià)(LCA) 角度上看，強(qiáng)化ABE發(fā)酵中丙酮合成具有顯著的環(huán)保和工業(yè)需求意義[44–46]，還可以實(shí)現(xiàn)ABE發(fā)酵的產(chǎn)品多樣化。

圖7 丙丁梭菌/釀酒酵母混合培養(yǎng)外添少量丁酸體系下的ABE發(fā)酵代謝網(wǎng)絡(luò)簡圖

有研究提出了“混菌培養(yǎng)同時(shí)外添少量乙酸(4.0 g/L) 的高效合成丙酮的ABE發(fā)酵策略”[47]。與“丙丁梭菌/釀酒酵母混菌培養(yǎng)耦聯(lián)丁酸外添”的發(fā)酵策略基本類似，該策略也可以充分利用“主菌”和“輔菌”的自適應(yīng)舉動(dòng)，改善ABE發(fā)酵性能，在此不再贅述。與后者唯一不同的是：外添的乙酸可以直接通過反應(yīng)途徑Acetate?Acetyl-CoA?Acetoacetyl-CoA?Acetone合成丙酮，而無需NADH的參與；乙酸對(duì)梭菌細(xì)胞也具有毒性，但其毒性小于丁酸，外添乙酸可以適度降低梭菌的葡萄糖消耗速度和NADH再生速率，使較多碳流走向不依存NADH的丙酮合成途徑，造成丁醇和丙酮比例的改變；適中的NADH再生速率還可以緩解細(xì)胞能量周轉(zhuǎn)負(fù)荷，延長有效發(fā)酵時(shí)間。在7 L厭氧發(fā)酵罐中實(shí)施“混菌培養(yǎng)外添少量乙酸的ABE發(fā)酵策略”，丙酮和丁醇濃度同時(shí)達(dá)到8.27 g/L和13.91 g/L的較高水平，分別比對(duì)照提高了41%和20%。在此基礎(chǔ)上，Luo等[48]又提出了“葡萄糖受限條件下葡萄糖/乙酸雙底物耦聯(lián)混菌培養(yǎng)”的更加新型的高效丙酮發(fā)酵策略。該策略可以將丙酮濃度和丙酮/丁醇比自由控制在6–12 g/L和0.5–1.0之間，最大丙酮濃度和丙酮/丁醇比達(dá)到了11.74 g/L和1.02，且丁醇濃度不受影響。上述策略為ABE發(fā)酵的產(chǎn)品多樣化和供需靈活化等目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供了重要信息。

2.2.4 使用廢棄酵母進(jìn)行丁醇發(fā)酵實(shí)現(xiàn)玉米原料的資源化和生物質(zhì)廢料的減量化

利用玉米原料生產(chǎn)丁醇存在原料成本高和與人爭糧的問題，用廉價(jià)基質(zhì)替代或部分替代糧食原料是目前解決該問題的有效方法。目前這方面的研究主要集中在利用秸稈、木屑等農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇和丁醇等液態(tài)燃料方面。2.1章節(jié)所論述的高密度畢赤酵母細(xì)胞(400 g-DCW/L，干物質(zhì)約35%) 屬于難以處理的半固態(tài)廢棄生物質(zhì)，嚴(yán)重污染環(huán)境，但卻擁有農(nóng)業(yè)廢棄物所不具備的高能量密度化特征，其組成除了含有36%的多糖(碳水化合物) 外，還含有46%的蛋白質(zhì)(氮源) 和12%的脂肪等物質(zhì)[49]。利用廢棄畢赤酵母部分替代玉米原料也頗具發(fā)展前景。

有研究報(bào)道顯示，用NaOH處理半固態(tài)廢棄酵母，形成廢棄酵母處理懸濁液，并在ABE發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)溶劑期后向玉米粉培養(yǎng)基發(fā)酵液中投入懸濁液，發(fā)酵產(chǎn)氣量增加約30%，有機(jī)酸積累量最大提高了近300%，總糖(以葡萄糖為結(jié)構(gòu)單位)利用效率從低于50%提高到超過90%的水平，這是一個(gè)典型的具有顯性自適應(yīng)特征的發(fā)酵過程。這種細(xì)胞自適應(yīng)行為或特征極大地改善了丁醇發(fā)酵性能，特別是整個(gè)發(fā)酵體系的資源化率(玉米淀粉/固態(tài)廢棄酵母) 和半固態(tài)廢棄酵母的減量化率[4,50]。這種顯性的細(xì)胞自適應(yīng)特征行為顯著改善丁醇發(fā)酵性能和促進(jìn)半固態(tài)廢棄酵母的利用主要得益于：1) 投入廢棄酵母處理液后所自然形成的高SO42–和氨基酸濃度環(huán)境(在酸堿中和與蛋白質(zhì)分解中產(chǎn)生)，根據(jù)章節(jié)2.2.1和2.2.2所述，上述因素均有利于丁醇合成；2) 丙丁梭菌有分泌糖化酶的能力，減少初始玉米粉用量、并在葡萄糖濃度降低到較低水平后投入廢棄酵母處理液后，糖化酶得到誘導(dǎo)、混合培養(yǎng)基中的二糖/三糖可以得到有效利用，有利于總糖利用效率的提升；3) 廢棄酵母處理液的某些特定物質(zhì)(尚未能確定) 直接刺激了玉米淀粉中多糖和還原糖的利用，這是總糖利用效率大幅提升的最主要原因，還需今后進(jìn)一步的研究和探索。

2.2.5 木質(zhì)纖維素預(yù)處理抑制物對(duì)梭菌生理代謝的干擾及脅迫響應(yīng)規(guī)律

利用來源更廣泛的木質(zhì)纖維素廢棄原料進(jìn)行液態(tài)燃料的發(fā)酵生產(chǎn)，依舊是相關(guān)研究的主流。在利用最常用的稀硫酸法預(yù)處理木質(zhì)纖維素得到可被微生物利用的可發(fā)酵糖的過程中，也伴隨有弱酸(如甲酸、乙酸、糠醛等)、呋喃類衍生物和酚類物質(zhì)(如丁香醛、香草醛、香草酸、阿魏酸等) 的產(chǎn)生(圖8)[34,51]。上述物質(zhì)對(duì)微生物細(xì)胞的正常生理代謝均有抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性改變。

低濃度糠醛可促進(jìn)拜氏梭菌利用葡萄糖產(chǎn)丁醇的效率，這與胞內(nèi)還原力再生有關(guān)[52]。隨著糠醛濃度的提高，菌株抑制逐漸顯現(xiàn)出來，且需要更長的解毒時(shí)間用于恢復(fù)發(fā)酵能力。高濃度的呋喃類物質(zhì)可以引發(fā)丙丁梭菌的DNA損傷和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，嚴(yán)重?cái)_亂胞內(nèi)氧化還原平衡，最終導(dǎo)致發(fā)酵效能低下。有研究表明[53]，預(yù)處理過程產(chǎn)生的甲酸會(huì)導(dǎo)致丁醇發(fā)酵的“酸崩潰”現(xiàn)象的發(fā)生，最終造成發(fā)酵失敗。Cho等[54]評(píng)估了六類酚化合物對(duì)拜氏梭菌的代謝干擾特征，結(jié)果顯示當(dāng)酚類物質(zhì)的含量達(dá)到1.0 g/L時(shí)，菌體生長降低64%–74%，丁醇發(fā)酵完全停止。丁香醛和香草醛對(duì)細(xì)胞毒性較小，但對(duì)于丁醇合成的毒性卻非常高。在另一篇研究報(bào)道中[55]，對(duì)拜氏梭菌BA101毒性最大的酚類物質(zhì)是阿魏酸，其次是對(duì)香豆酸。近期的研究結(jié)果表明[56]，在合成培養(yǎng)基條件下，添加少量的香蘭素或香草酸(0.2 g/L) 可以提高丙丁梭菌的產(chǎn)酸能力，在丁醇濃度基本不變的前提下，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸和溶劑的共生產(chǎn)，這主要是由于梭菌為了適應(yīng)酚類脅迫必須強(qiáng)化菌體和能量物質(zhì)ATP的合成。這種現(xiàn)象為基于環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為的過程優(yōu)化提供了借鑒。為了揭示發(fā)酵抑制物對(duì)產(chǎn)溶劑梭菌生理代謝的影響，國內(nèi)外研究者進(jìn)行了大量工作。如俄亥俄州立大學(xué)的Ezeji教授團(tuán)隊(duì)基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)首次解析了拜氏梭菌對(duì)糠醛的脅迫響應(yīng)機(jī)制[52]。結(jié)果表明，在產(chǎn)溶劑期，糠醛的存在使得721個(gè)基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，而這些基因與輔因子水平調(diào)控、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、糖代謝、熱激蛋白表達(dá)等因素關(guān)聯(lián)密切。中國科學(xué)院成都生物研究所的趙海研究員團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，硫化鈉可以解除小麥秸稈水解液對(duì)丁醇發(fā)酵的抑制作用，并利用基于RNA-seq技術(shù)揭示了硫化鈉添加后丙丁梭菌CICC8012在轉(zhuǎn)錄水平上的變化特征[57]。未來的工作需要分析梭菌脅迫環(huán)境下的細(xì)胞自適應(yīng)特征：通過宏觀生理生化參數(shù)的測定、發(fā)酵性能的比較以及系統(tǒng)生物學(xué)的分析，進(jìn)而全局性地揭示發(fā)酵抑制物對(duì)丁醇合成的影響特征，并明確關(guān)鍵的抑制靶點(diǎn)；通過代謝工程和基因編輯技術(shù)提高微生物細(xì)胞對(duì)抑制物的耐受能力，拓寬產(chǎn)溶劑梭菌對(duì)多種可發(fā)酵糖的利用能力，最終實(shí)現(xiàn)利用木質(zhì)纖維素原料高效生產(chǎn)丁醇的目標(biāo)。

圖8 木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的各類發(fā)酵抑制物

3 總結(jié)與展望

圍繞“典型工業(yè)發(fā)酵過程環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為與系統(tǒng)優(yōu)化”這一主題，結(jié)合介紹國內(nèi)外的研究者以及本研究團(tuán)隊(duì)在該領(lǐng)域的研究成果，以畢赤酵母高效生產(chǎn)異源蛋白和丁醇發(fā)酵過程為例，闡述了環(huán)境變化條件下的細(xì)胞自適應(yīng)行為及其基于自適應(yīng)行為的過程優(yōu)化方法和策略。目前，基于細(xì)胞自適應(yīng)行為的發(fā)酵過程優(yōu)化方法和策略的研究例證并不很多，發(fā)酵性能的提升幅度有限，分子機(jī)制研究的還不透徹。這些問題有待今后進(jìn)一步的深入研究加以解決。

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Fermentation optimization based on cell self-adaptation to environmental stress – a review

Jian Ding1, Hongzhen Luo2, and Zhongping Shi1

1,,214122,,2,,223003,,

In industrial fermentation processes, bacteria have to adapt environmental stresses. Sometimes, such a self-adaption does not work and will cause fermentation failures, although such adaptation also can generate unexpected positive effects with improved fermentation performance. Our review introduces cell self-adaption to environmental variations or stress, process optimization based on such self-adaptions, with heterologous proteins production byand butanol fermentation as examples. Our review can sever as reference for fermentation optimization based on cell self-adaption.

cell self-adaption, environmental variations, fermentation optimization, heterologous proteins production, butanol fermentation

10.13345/j.cjb.190207

史仲平 江南大學(xué)生物工程學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師。1991年日本名古屋大學(xué)工學(xué)部獲工學(xué)博士學(xué)位。1991–1995年歷任日本九州工業(yè)大學(xué)情報(bào)工學(xué)部助教，美國得克薩斯大學(xué)校、西弗吉尼亞大學(xué)化工系博士后研究員。1995–2002年在美國/加拿大科技公司工作。研究方向：發(fā)酵工程、發(fā)酵過程控制、代謝工程、生物燃料。獲中國石油和化學(xué)工業(yè)協(xié)會(huì)及中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)3項(xiàng)，發(fā)表論文145篇、其中SCI論文81篇。

丁健, 羅洪鎮(zhèn), 史仲平. 典型工業(yè)發(fā)酵過程環(huán)境變化下的細(xì)胞自適應(yīng)行為與系統(tǒng)優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 1986–2002.

Ding J, Luo HZ, Shi ZP. Fermentation optimization based on cell self-adaptation to environmental stress – a review. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1986–2002.

May20, 2019;

July16, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21606106, 21808075), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BK20150127, BK20160162, BK20170459).

Zhongping Shi. Tel/Fax: +86-510-85918292; E-mail: zpshi@jiangnan.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 21606106, 21808075)，江蘇省自然科學(xué)基金 (Nos. BK20150127, BK20160162, BK20170459) 資助。

2019-08-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190819.1736.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)