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    石墨烯量子點(diǎn)的光熱和光動(dòng)力效應(yīng)在殺菌中的應(yīng)用

    2019-10-31 08:18:46郭昱良章澤飛
    關(guān)鍵詞:活性氧水溶液菌液

    吳 穎,郭昱良,章澤飛,桂 馨

    (同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,上海200092)

    自從中國科學(xué)院黃慶課題組首次發(fā)現(xiàn)石墨烯(graphene oxide,GO)具有抗菌作用以來,石墨烯及其衍生物的抗菌研究引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注[1-3].單層石墨烯的厚度僅為0.35 nm,是目前世界上已知最薄的2維材料.巨大的比表面積可以讓石墨烯和更多的細(xì)菌接觸,良好的熱/化學(xué)穩(wěn)定性可以使其持續(xù)地抑制細(xì)菌生長[4-5].

    石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots,GQDs)可以通過切割大尺寸的石墨烯得到,因此GQDs的粒徑更小,從而獲得了比石墨烯更大的比表面積,在相同質(zhì)量下可以裝載更多的藥物;而且不同于最常見的石墨烯和氧化石墨烯,GQDs不僅能夠高效地將光能轉(zhuǎn)換為熱能,同時(shí)還能產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS).但是,過量的ROS會(huì)破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)以及DNA從而殺傷細(xì)胞[6-7].可見GQDs無需裝載光敏劑即可達(dá)到光熱和光動(dòng)力的協(xié)同殺傷效果,而這2種效應(yīng)的協(xié)同可以更大程度地殺傷細(xì)胞[8-9].因此GQDs將是一種性能優(yōu)異、應(yīng)用前景較好的殺菌材料.

    本工作將GQDs的光熱效應(yīng)和光動(dòng)力效應(yīng)聯(lián)合,達(dá)到協(xié)同殺傷細(xì)菌的效果,進(jìn)一步推動(dòng)GQDs在殺菌領(lǐng)域的研究.

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    蛋白胨、酵母提取粉購自O(shè)xide公司(美國);瓊脂購自沃凱化學(xué)試劑有限公司(上海);大腸桿菌(Escherichia coli)菌種干粉購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC,上海);石墨粉購自上海南球碳素合作公司(上海);活性氧檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司(江蘇);氯化鐵、濃氨水、高錳酸鉀、濃硫酸、氯化鋇、無水乙醇、氯化鈉等試劑均購自國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司(上海).

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 GQDs合成及形貌表征

    本工作首先通過改良的Hummers法合成氧化GO[10-11],基本步驟如下:在冰水浴條件下,把1 g石墨粉緩慢加入到攪拌中的25 mL濃硫酸溶液,持續(xù)攪拌12 h;維持低溫,緩慢加入6 g高錳酸鉀,轉(zhuǎn)入40°C油浴中,攪拌30 min;加入20 mL去離子水,將油浴溫度提高到90°C,攪拌2 h;加入95 mL去離子水,將油浴溫度提高到105°C,攪拌40 min;使用溫水將整個(gè)體系稀釋到160 mL,再加入10 mL 10%的H2O2,趁熱過濾,得到濾餅;用5%HCl洗滌濾餅,直至濾液中檢測(cè)不到SO42-(氯化鋇溶液檢測(cè));將濾餅從濾紙上取下,超聲分散在500 mL去離子水中,得到約2 mg/mL GO水懸液.

    取100 mL約0.2 mg/mL GO水懸液,加入2 mL H2O2(30%),80°C油浴下劇烈攪拌,緩慢滴加4 mL氯化鐵溶液(2 mg/mL),繼續(xù)攪拌約4 h直至溶液變?yōu)辄S亮色;冷卻后,裝入截留分子量為1 000的透析袋中透析,直至透析外液中檢測(cè)不到Fe3+(濃氨水檢測(cè));之后冷凍干燥得到GQDs粉末;在透射電鏡下觀察GQDs形貌.

    1.2.2 655 nm激光誘導(dǎo)GQDs的光熱轉(zhuǎn)換

    將制備的GQDs粉末分散在蒸餾水中,得到質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的GQDs水溶液,取200 μL于透明的玻璃小管中,封口膜密封管口,以低功率密度(0.25 W/cm2)的655 nm的激光束垂直照射玻璃小管中的樣品,采用紅外熱成像儀實(shí)時(shí)檢測(cè)樣品的溫度變化.以200 μL蒸餾水在同樣功率激光照射下的升溫測(cè)試作為對(duì)照,每組樣品在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).

    1.2.3 LB培養(yǎng)基的配置

    稱取氯化鈉10 g、酵母提取粉5 g、胰化蛋白胨10 g,溶解于1 000 mL去離子水中,121°C高壓滅菌20 min,4°C保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)中所需的平板固體培養(yǎng)基,需要在上述的培養(yǎng)基配方中加入20 g瓊脂粉,高壓滅菌后趁熱倒至平板,待冷卻凝固后于4°C保存?zhèn)溆?

    1.2.4 大腸桿菌的培養(yǎng)及菌液的制備

    在35 mL預(yù)熱的液體LB(luria-bertani)培養(yǎng)基中加入少許大腸桿菌干粉粉末,于37°C,220 r/min搖床上培養(yǎng)過夜;待菌液的600 nm吸收值(OD600)為0.5左右時(shí),取0.1 mL菌液加入新鮮的35 mL的LB培養(yǎng)基中,相同條件過夜振蕩培養(yǎng);然后,10 000 g離心10 min,取沉淀,用滅菌的蒸餾水將菌液OD600調(diào)整至0.5后備用.大腸桿菌OD600為0.5時(shí)的菌體濃度為5×108個(gè)/mL.

    1.2.5 655 nm激光誘導(dǎo)GQDs產(chǎn)生活性氧

    取6 mL上述OD600值為0.5的大腸桿菌水溶液,加入6 μL活性氧檢測(cè)試劑盒中的探針DCFH-DA,37°C孵育20 min后用滅菌水洗滌3次,得到6 mL裝載了探針的大腸桿菌水溶液;將制備的GQDs粉末分散到3 mL大腸桿菌水溶液中,獲制3 mL質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的GQDs和大腸桿菌混合液以及3 mL裝載了探針的大腸桿菌水溶液;取200 μL GQDs和大腸桿菌混合液加入到96孔板中,以低功率密度的655 nm的激光束垂直照射樣品孔,在不同時(shí)間點(diǎn)用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的DCF(2,7-dichlorofluorescein)熒光值;以200 μL大腸桿菌水溶液在同樣功率激光照射下的DCF熒光值作為對(duì)照,每組樣品各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn).

    1.2.6 GQDs對(duì)大腸桿菌生長的影響

    將0.1 mL上述OD600值為0.5的大腸桿菌水溶液加入到15 mL培養(yǎng)基中,加入紫外照射滅菌處理后的GQDs,調(diào)整其質(zhì)量濃度為1 mg/mL,在上述條件下進(jìn)行培養(yǎng);設(shè)置未加GQDs的對(duì)照組,培養(yǎng)2 h后,每隔1 h取0.1 mL菌液檢測(cè)OD600的值用于繪制大腸桿菌的生長曲線,直至菌液的吸收值不再明顯增長為止.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

    1.2.7 655 nm激光誘導(dǎo)GQDs對(duì)大腸桿菌的殺傷作用

    取0.2 mL的上述活菌液置于2 mL離心管中,分別加入GQDs形成濃度梯度,采用655 nm的近紅外激光在管壁正上方5 cm處照射20 min,設(shè)置未加GQDs的菌液進(jìn)行相同激光處理作為對(duì)照;照射結(jié)束后采用梯度稀釋涂板法(103倍、104倍及105倍)對(duì)菌液內(nèi)活菌數(shù)目進(jìn)行記數(shù),并取無GQDs菌液的菌數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算活菌抑制率.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

    取0.2 mL的上述活菌液置于2 mL的離心管中,加入GQDs使其最終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL,分別用655 nm近紅外激光在管壁正上方處照射不同時(shí)間,形成時(shí)間梯度;照射結(jié)束后使用梯度稀釋涂板法(103倍、104倍及105倍)對(duì)菌液內(nèi)活菌數(shù)目進(jìn)行記數(shù),并取未進(jìn)行激光照射的菌液的菌數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算活菌抑制率.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

    1.2.8 數(shù)據(jù)分析

    采用IBM SPSS Statistics 22提供的單因素方差分析法分析樣本各組間差異性,P<0.05(*)表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01(**)表示具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.001(***)表示具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

    如圖1所示,本工作的整體實(shí)驗(yàn)思路是利用655 nm激光誘導(dǎo)GQDs產(chǎn)生大量的熱量和活性氧,達(dá)到協(xié)同殺傷大腸桿菌的目的.

    2.1 GQDs在655 nm激光照射下的光熱效應(yīng)

    圖2為制備的GQDs的透射電鏡照片和粒徑分布.結(jié)果顯示,該GQDs在溶液中的分布均勻,粒徑大小主要集中在8~14 nm,說明制備的GQDs是一種可以均勻分散的納米材料.

    圖1 實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Schematic illustration of experiment

    圖2 GQDs的表征Fig.2 Characterizations of GQDs

    在655 nm激光照射下的GQDs水溶液可以產(chǎn)生大量的熱量.圖3顯示了GQDs水溶液和單純的蒸餾水在655 nm激光照射下的升溫情況.圖中紅外熱成像儀檢測(cè)到200 μL 0.6 mg/mL的GQDs水溶液在被激光照射0.5 min后,就從最初的25.3±0.3°C上升到了31.8±0.7°C;5 min時(shí),GQDs水溶液的溫度已經(jīng)到達(dá)了儀器可檢測(cè)到的上限50.5°C,平均升溫幅度超過25°C.而相同體積的蒸餾水激光照射20 min后,僅上升到了29.0±0.2°C,平均升溫幅度僅為4°C左右.由此可見,GQDs是一種高效的光熱轉(zhuǎn)化材料.

    2.2 GQDs在655 nm激光照射下的光動(dòng)力效應(yīng)

    在655 nm激光照射下的GQDs可以產(chǎn)生數(shù)量可觀的活性氧.將GQDs和大腸桿菌水溶液混合,使混合溶液體積為200 uL,GQDs質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL.圖4顯示了0.6 mg/mL的GQDs經(jīng)655 nm激光照射不同時(shí)間后的活性氧水平.圖中,酶標(biāo)儀檢測(cè)到在被655 nm激光照射5 min后,相對(duì)活性氧水平從最初的2.6±0.9上升到18.5±6.2;隨著照射時(shí)間的增加,活性氧水平持續(xù)上升,照射20 min后達(dá)到了95.3±12.2,表明GQDs是一種性能較好的光動(dòng)力材料.

    2.3 GQDs對(duì)大腸桿菌生長的影響

    GQDs自身對(duì)細(xì)菌的毒性很低.GQDs經(jīng)過紫外照射滅菌后,加到大腸桿菌培養(yǎng)液中,并且確保共培養(yǎng)溶液中的GQDs質(zhì)量濃度為1 mg/mL(見圖5),不論是調(diào)整期(0~6 h)、對(duì)數(shù)生長期(8~10 h)還是穩(wěn)定期(12 h后),大腸桿菌的總體數(shù)量以及生長速度和未加GQDs組均無顯著差異,其生長曲線基本重疊,說明GQDs是一種生物相容性較好的材料.

    圖4 0.6 mg/mL的GQDs經(jīng)655 nm激光照射不同時(shí)間后的ROS水平Fig.4 ROS level of GQDs with a concentration of 0.6 mg/mL under 655 nm laser irradiation at different time point

    圖5 單獨(dú)的GQDs對(duì)大腸桿菌生長的影響(GQDs質(zhì)量濃度為1 mg/mL)Fig.5 Effect of GQDs on the growth of Escherichia coli(GQDs concentration:1 mg/mL)

    2.4 655 nm激光照射下GQDs對(duì)大腸桿菌的殺傷作用

    在655 nm激光照射下的GQDs可以有效地殺傷細(xì)菌.圖6顯示了不同質(zhì)量濃度的GQDs經(jīng)20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定性分析).圖中,當(dāng)GQDs質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí),激光照射20 min后,可以觀察到大腸桿菌生長被抑制的趨勢(shì);隨著質(zhì)量濃度增大到0.2 mg/mL時(shí),發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的生長受到了顯著的抑制;而質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),平板里的大腸桿菌菌落數(shù)量?jī)H為2位數(shù).更可喜的是,0.6 mg/mL GQDs在激光照射20 min后可以完全殺滅大腸桿菌,而單獨(dú)的激光照射對(duì)大腸桿菌的生長無明顯影響,證明一定質(zhì)量濃度的GQDs輔以激光照射是一種有潛力的殺菌方法.

    圖6 不同質(zhì)量濃度的GQDs經(jīng)20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定性分析)Fig.6 Antibacterial effects of GQDs on Escherichia coli with different concentrations under 655 nm laser irradiation for 20 min(qualitative analysis)

    接下來的定量檢測(cè)也證實(shí)了GQDs可以有效地殺傷細(xì)菌.圖7顯示了不同質(zhì)量濃度的GQDs經(jīng)20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定量分析).圖中,GQDs的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí),激光照射20 min后,活菌數(shù)量和對(duì)照組(未加GQDs組)相比減少了10%;當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí),細(xì)菌數(shù)量和對(duì)照組相比減少了25%,2組之間的活菌數(shù)有著顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL時(shí),實(shí)驗(yàn)組的活菌數(shù)和對(duì)照組相比有著極顯著的差異(P<0.001);而當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí),活菌數(shù)為0.

    根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),激光照射下GQDs殺滅細(xì)菌的有效質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察GQDs殺滅細(xì)菌的有效時(shí)間.如圖8和9所示,激光照射僅3 min后,活菌數(shù)量就已明顯減少;照射5 min后,86%的細(xì)菌被殺死;照射15 min后,細(xì)菌完全被殺滅.可見,激光照射下0.6 mg/mL GQDs殺滅細(xì)菌的有效時(shí)間為15 min.如果提高GQDs的質(zhì)量濃度,殺滅細(xì)菌的有效時(shí)間有希望進(jìn)一步縮短.可見,在激光照射下的GQDs可以短時(shí)、高效、可控地殺滅細(xì)菌.

    圖7 不同質(zhì)量濃度的GQDs經(jīng)20 min 655 nm激光照射后的抑菌效果(定量分析)Fig.7 Antibacterial eきciency of GQDs on Escherichia coli with different concentrations under 655 nm laser irradiation for 20 min(quantitative analysis)

    圖8 0.6 mg/mL的GQDs經(jīng)不同時(shí)間655 nm激光照射后的抑菌效果(定性分析)Fig.8 Antibacterial effects of GQDs with a concentration of 0.6 mg/mL on Escherichia coli under 655 nm laser irradiation at different time points(qualitative analysis)

    3 結(jié)束語

    綜上,本工作首次利用655 nm激光誘導(dǎo)GQDs產(chǎn)生的光熱效應(yīng)和光動(dòng)力效應(yīng)用于殺菌的研究.結(jié)果表明,在較低的GQDs質(zhì)量濃度和較短的激光照射條件下,能夠高效地抑制細(xì)菌生長,如在GQDs質(zhì)量濃度僅為0.6 mg/mL和激光僅照射15 min的條件下,能夠?qū)⒋竽c桿菌完全殺滅,表現(xiàn)出了較好的殺菌性能.本工作的研究結(jié)果可以促進(jìn)GQDs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用以及殺菌新方法的推廣.

    圖9 0.6 mg/mL的GQDs經(jīng)不同時(shí)間655 nm激光照射后的抑菌效果(定量分析)Fig.9 Antibacterial effects of GQDs with a concentration of 0.6 mg/mL on Escherichia coli under 655 nm laser irradiation at different time points(quantitative analysis)

    致謝感謝同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院儲(chǔ)茂泉教授提供的研究思路和實(shí)驗(yàn)條件,并參與論文修改和有意義的討論.

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