高尿酸血癥大鼠的血清脂肪酸代謝特征及祛濁通痹方干預(yù)研究

譚祖教 李倩倩 周佳

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院

尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致體內(nèi)尿酸生成增多，形成高尿酸血癥，尿酸鹽堆積會進一步引發(fā)痛風(fēng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。黃嘌呤氧化還原酶（xanthine oxidoreductase，XOR）是嘌呤代謝的關(guān)鍵酶之一。別嘌醇能有效抑制XOR，阻斷黃嘌呤、次黃嘌呤代謝為尿酸，從而抑制尿酸的合成[1]，是目前臨床上應(yīng)用范圍最廣的降尿酸藥物之一，但別嘌醇可能引起別嘌醇過敏綜合征和嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)，嚴(yán)重時可能危及患者生命[2]。

痛風(fēng)屬中醫(yī)“痹癥”范疇，課題組前期研究認(rèn)為痛風(fēng)的發(fā)病主要與肝郁脾虛、濁瘀等有關(guān)，從而提出祛濁通痹是高尿酸血癥和痛風(fēng)的重要治則，并結(jié)合臨床實踐基礎(chǔ)確立了袪濁通痹方[3]。該方以土茯苓、川萆薢解毒除濕、祛風(fēng)通痹為君藥，薏苡仁、玉米須、澤瀉、葎草利水滲濕、瀉熱通淋為臣藥，佐以桑寄生、豨薟草補益肝腎、通利關(guān)節(jié)，以片姜黃、延胡索、佛手疏肝理氣止痛為使藥，意在發(fā)揮其疏肝運脾、通瘀泄?jié)嶂АＥR床研究表明，該方可有效降低尿酸水平，減輕關(guān)節(jié)腫脹程度，緩解痛風(fēng)發(fā)作[4]。動物研究證實，祛濁通痹方對XOR有一定的抑制作用[5]，但由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜、作用靶點多，目前關(guān)于祛濁通痹方治療痛風(fēng)的機制仍未明確。

高尿酸血癥與脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)[6]。研究表明，尿酸通過激活碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（carbonhydrate response elementbinding protein，ChREBP），使ChREBP與碳水化合物結(jié)合生成乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS），并最終合成脂肪[7]。FAS參與了脂肪酸合成的整個過程，是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，F(xiàn)AS表達異常將造成脂肪酸代謝紊亂[8]。尿酸水平升高正反饋調(diào)節(jié)FAS表達，或?qū)?dǎo)致一系列脂肪酸代謝異常。本研究擬采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)全面系統(tǒng)地分析高尿酸血癥大鼠體內(nèi)脂肪酸代謝譜的變化，從脂肪酸代謝的角度進一步探討別嘌醇和中藥祛濁通痹方治療痛風(fēng)的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠20只，8周齡，體質(zhì)量（240±30）g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2008-0033]。

1.1.2 主要試劑 生藥土茯苓、薏苡仁、川萆薢、玉米須、澤瀉、葎草、桑寄生、豨薟草、片姜黃、延胡索、佛手均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠；色譜級甲醇購于德國Merck公司（批號：10964207831）；正己烷購于美國A-vantor公司（批號：0000094377）；十二酸-12,12,12-D3購于瑞典 Larodan公司（批號：5053:2）；三氟化硼/甲醇（boron trifluoride/methanol，BF3/MeOH）溶液購于美國 Sigma-Aldrich公司（批號：BCBW3188）；別嘌醇為重慶科瑞制藥產(chǎn)品（0.1g/片，國藥準(zhǔn)字號：H50020455）；酵母粉購于英國OXOID公司（批號：1167448）；高脂飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司（批號：20181204）。

1.1.3 主要實驗儀器 Agilent 7890/5975C GC-MS聯(lián)用儀為美國Agilent公司產(chǎn)品；CentriVap低溫冷凍離心濃縮儀購于美國Labconco公司；TBA-40FR全自動生化分析儀購于日本東芝三廣醫(yī)療株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備 祛濁通痹方由土茯苓60g、薏苡仁30g、川萆薢 30g、玉米須 15g、澤瀉 15g、葎草 15g、桑寄生15g、豨薟草18g、片姜黃12g、延胡索18g、佛手1 2g組成，生藥量共240g，加入10倍量的蒸餾水浸泡1h后煎煮1h，將濾液于50℃減壓蒸餾，制備成濃度為2.4g·mL-1的祛濁通痹方提取液。別嘌醇以0.2%羧甲基纖維素鈉配制成濃度為1.0mg·mL-1的混懸液備用。

1.2.2 飼料配制 將酵母粉以10%的含量均勻拌入粉碎的大鼠高脂飼料中，重新壓粒成型即為含10%酵母提取物的高脂飼料。

1.2.3 實驗動物分組及處理 20只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后隨機分為4組，每組5只，組別如下：正常（N）組、模型（M）組、別嘌醇（T1）組及祛濁通痹方（T2）組。N組給予正常飲食，其余3組給予高脂飲食。除N組和M組外，其余2組分別從高脂飲食第3周開始灌胃給藥，1次/d，持續(xù)3周，T1組給予10mg/kg別嘌醇混懸液灌胃（成人劑量的6倍），T2組給予10mL/kg祛濁通痹方提取液灌胃[5]，N組和M組給予等體積蒸餾水灌胃。所有大鼠每3d稱重一次，按體質(zhì)量計算給藥劑量。

1.2.4 血尿酸檢測 造模前、造模2周及末次給藥24h后，以眼眶采血法采集大鼠全血，靜置1h后2 000r/min離心10min，分離血清，-80℃保存。使用TBA-40FR全自動生化分析儀檢測血清中尿酸水平。

1.2.5 脂肪酸提取和衍生 藥物干預(yù)3周后，抽取大鼠血樣 20μL，加入 50μg·mL-1內(nèi)標(biāo)（十二酸-12,12,12-D3）20μL，混勻后再加入 0.5mol·L-1NaOH/MeOH 200μL，90℃反應(yīng) 5min，然后加入 10%BF3/MeOH溶液200μL，90℃反應(yīng)5min。冷卻后分別加入飽和氯化鈉溶液和正己烷萃取甲酯化脂肪酸各200μL，取上層凍干。以50μL正己烷溶解后上機分析。

1.2.6 GC-MS分析 采用DB-5MS石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm，美國 J&W 公司產(chǎn)品）進行分離。進樣體積為1μL，分流比為5:1；載氣為氦氣（99.9996%），流速為1.2mL/min。柱溫箱升溫程序：初始60℃保持1min后，以20℃/min升溫至200℃，保持3min，然后以5℃/min升溫至280℃并保持5min。進樣口溫度設(shè)為280℃，傳輸線溫度設(shè)為280℃，電子轟擊離子源溫度為230℃。溶劑延遲時間為3.5min，質(zhì)譜掃描范圍m/z 50～500。分析過程中隨機安排樣本進樣順序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 利用MSD工作站，對比脂肪酸數(shù)據(jù)庫，對脂肪酸進行識別和積分，得到由質(zhì)荷比、保留時間及對應(yīng)峰面積組成的數(shù)據(jù)矩陣，峰面積經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正。應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組計量資料組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血尿酸水平比較 造模前各組大鼠血尿酸水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖1A。造模2周后，與N組比較，M組、T1組和T2組大鼠血尿酸水平均顯著升高（P＜0.05）。見圖1B。由此證明以含10%酵母提取物的高脂飼料喂養(yǎng)可成功誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型。藥物干預(yù)3周后，與M組比較，T1組和T2組血尿酸水平均顯著下降（P＜0.05），且與N組血尿酸水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖1C。說明別嘌醇與祛濁通痹方均能有效降低血尿酸。

圖1 各組大鼠血尿酸水平比較Fig.1 Comparison of serum uric acid level in each group

2.2 造模和藥物對高尿酸血癥大鼠脂肪酸代謝的影響 藥物干預(yù)3周后，采用GC-MS對各組大鼠血樣進行檢測，一共檢測到31種脂肪酸，包括10種飽和脂肪酸、9種單不飽和脂肪酸和12種多不飽和脂肪酸。單因素方差分析結(jié)果顯示，與N組比較，M組單不飽和脂肪酸總量顯著下降（P＜0.05）。見圖2-1A。進一步比較每種脂肪酸的含量變化后發(fā)現(xiàn)，M組中飽和脂肪酸——十六烷酸（棕櫚酸）和單不飽和脂肪酸——十六碳烯酸（棕櫚油酸）及十八碳烯酸（油酸）相對含量顯著低于 N 組（P＜0.05）。見圖 2-1B、C、D。表明高尿酸血癥大鼠存在多種脂肪酸代謝的異常，尤其是單不飽和脂肪酸含量下降。

別嘌醇和祛濁通痹方干預(yù)后，高尿酸血癥大鼠體內(nèi)下調(diào)的3種脂肪酸含量均回升，與N組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖 2-1B、C、D。此外，別嘌醇干預(yù)后，T1組十八碳三烯酸（亞麻酸）和二十四碳烯酸（神經(jīng)酸）含量顯著低于N組（P＜0.05），而T2組亞麻酸和神經(jīng)酸的含量與N組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），其中神經(jīng)酸含量高于 T1組（P＜0.05）。見圖2-2。

圖2 -1造模和藥物干預(yù)后含量發(fā)生變化的脂肪酸Fig.2-1 Content changed fatty acids after modeling and drugs intervention

2.3 造模或藥物干預(yù)對脂肪酸延長酶的影響 脂肪酸延長酶是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，通過對比產(chǎn)物脂肪酸與前體脂肪酸的比值（C18:1/C16:1）可估算脂肪酸延長酶活性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)M組大鼠體內(nèi)C18:1/C16:1的比值顯著高于N組（P＜0.05），M組中脂肪酸延長酶活性可能增強；而藥物干預(yù)后，C18:1/C16:1的比值下降，與N組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖3。推測別嘌醇和祛濁通痹方均可影響脂肪酸延長酶的活性。

圖2 -2造模和藥物干預(yù)后含量發(fā)生變化的脂肪酸Fig.2-2 Content changed fatty acids after modeling and drugs intervention

圖3 各組C18:1/C16:1比值比較Fig.3 Comparison of C18:1/C16:1 ratio in each group

3 討論

肥胖是造成高尿酸血癥的重要原因之一，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）與高尿酸血癥顯著相關(guān)[10-11]。高尿酸血癥患者常伴有高脂血癥和脂質(zhì)代謝紊亂，而脂肪酸代謝是脂質(zhì)代謝的重要環(huán)節(jié)。目前研究表明，尿酸水平升高能夠正反饋調(diào)節(jié)FAS表達，進一步造成脂肪酸代謝異常和脂肪沉積[7-8]。別嘌醇是目前常用的降尿酸藥物之一，但可引起別嘌醇過敏綜合征和嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)，嚴(yán)重時可能危及患者生命[2]。痛風(fēng)屬中醫(yī)的痹癥范疇，課題組前期在臨床實踐的基礎(chǔ)上確立了袪濁通痹方[3]，該方由土茯苓60g、薏苡仁 30g、川萆薢 30g、玉米須 15g、澤瀉 15g、葎草 15g、桑寄生 15g、豨薟草 18g、片姜黃 12g、延胡索18g、佛手12g組成，臨床研究證明該方有良好的降尿酸效果[4]。本實驗中以含10%酵母提取物的高脂飼料構(gòu)建高尿酸血癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)別嘌醇或祛濁通痹方干預(yù)后均可顯著降低血尿酸水平，再次證明兩種藥物都有很好的降尿酸作用。

本研究采用GC-MS技術(shù)系統(tǒng)地分析高尿酸血癥大鼠體內(nèi)脂肪酸代謝譜的變化，探討別嘌醇和中藥祛濁通痹方對脂肪酸代謝的干預(yù)作用。圖4總結(jié)了造模及藥物干預(yù)后脂肪酸代謝的改變。M組大鼠體內(nèi)多種脂肪酸下降，尤其是單不飽和脂肪酸（不飽和脂肪酸總量、棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸等）均下降。單不飽和脂肪酸具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂水平、降低心血管疾病風(fēng)險等作用[12-13]，其含量在M組中整體下調(diào)提示高尿酸血癥大鼠存在較高的心腦血管疾病風(fēng)險。別嘌醇和祛濁通痹方干預(yù)后，上述單不飽和脂肪酸含量均增高，表明祛濁通痹方與別嘌醇均能改善高尿酸血癥大鼠體內(nèi)脂肪酸代謝紊亂。

脂肪酸的合成代謝涉及多種代謝酶，如脂肪酸延長酶和去飽和酶，這些酶活性的異常與肥胖、高脂血癥、高血壓和高尿酸血癥等密切相關(guān)。高尿酸血癥大鼠C18:1/C16:1比值顯著上調(diào)，說明高脂飲食刺激了脂肪酸延長酶活性，延長酶活性增強可進一步促進體內(nèi)甘油三酯含量的增加[14]，進而為黃嘌呤、次黃嘌呤氧化提供條件。經(jīng)過別嘌醇或祛濁通痹方干預(yù)后，C18:1/C16:1比值顯著下降，提示藥物可能通過影響脂肪酸延長酶參與脂肪酸代謝，但其在降尿酸中的作用仍需進一步研究。

圖4 造模及藥物干預(yù)后脂肪酸代謝差異總結(jié)Fig.4 Summary of the differences of fatty acid metabolism after modeling and drug intervention

祛濁通痹方重用土茯苓、川萆薢為君，意在解毒除濕、祛風(fēng)通痹；臣以薏苡仁、玉米須、澤瀉、葎草，利水滲濕、瀉熱通淋；佐以桑寄生、豨薟草，補益肝腎、通利關(guān)節(jié)；以片姜黃、延胡索、佛手疏肝理氣止痛為使，共達疏肝運脾、通瘀泄?jié)嶂А，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，方中單味藥如土茯苓、薏苡仁、玉米須等中含有豐富的棕櫚酸、油酸、亞麻酸等，能夠從多個途徑參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)[15-19]。由此推測祛濁通痹方可能通過干預(yù)脂肪酸代謝，影響嘌呤代謝。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)別嘌醇引起了亞麻酸和神經(jīng)酸含量減少，而祛濁通痹方干預(yù)后這些脂肪酸含量沒有明顯變化。亞麻酸是人體必需脂肪酸，可在體內(nèi)代謝為二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），人體缺乏亞麻酸，會出現(xiàn)免疫力降低、記憶力減退、動脈粥樣硬化等癥[20]。神經(jīng)酸可迅速分解清除血液內(nèi)多余的甘油三酯和膽固醇，抑制脂類吸收，清除血液內(nèi)的自由基、降低血液黏稠度[21]。筆者推測，祛濁通痹方可能選擇性地影響脂肪酸代謝，其作用與別嘌醇存在差異。

脂質(zhì)代謝紊亂與高尿酸血癥發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，脂肪酸代謝是脂質(zhì)代謝的重要環(huán)節(jié)。本研究利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)全面分析了高尿酸血癥大鼠脂肪酸代謝譜，并比較了別嘌醇和祛濁通痹方對脂肪酸代謝的影響，結(jié)果提示高尿酸血癥大鼠存在脂肪酸代謝異常，尤其是單不飽和脂肪酸含量下調(diào)明顯；別嘌醇和祛濁通痹方均 可改善高尿酸血癥大鼠的脂肪酸代謝；祛濁通痹方除了糾正高尿酸血癥相關(guān)的異常脂肪酸代謝外，對其他脂肪酸無影響，不良反應(yīng)少于別嘌醇，但其有效成分和具體作用機制仍需進一步研究。