金花茶通過(guò)AMPK/PPAR-α通路減輕NAFLD引起的脂代謝異常機(jī)制研究

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種排除過(guò)量飲酒及其他導(dǎo)致肝脂肪變?cè)虻?、與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和遺傳密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性損傷，其重要病理改變?yōu)楦渭?xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積[1]。NAFLD是全球最常見(jiàn)的慢性肝病，普通成人發(fā)病率為6.3%～45%，其中10%～30%為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），而包括中國(guó)在內(nèi)的多數(shù)亞洲國(guó)家的NAFLD患病率則大于25%[2]。因脂肪性肝病與糖尿病、肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，故Chris等[3]預(yù)測(cè)，從2016至2030年，NAFLD的發(fā)病率會(huì)隨著糖尿病與肥胖發(fā)病率升高而升高，至2030年或有超過(guò)總?cè)丝?/3的人患有脂肪性肝病，其中有相當(dāng)一部分患者將進(jìn)展成脂肪性肝炎。NAFLD已經(jīng)成為備受全球關(guān)注的一大公共衛(wèi)生問(wèn)題，如何有效防治NAFLD已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)迫切需要解決的問(wèn)題。然而迄目前為止，尚無(wú)能夠安全、有效治療NAFLD的臨床用藥。大量臨床試驗(yàn)與藥理研究證實(shí)，我國(guó)民族醫(yī)藥在治療NAFLD上有顯著的優(yōu)勢(shì)與效果，具有廣泛的發(fā)展前景[4]。

金花茶（Camellia chrysantha(Hu)Tuyama）屬于山茶科、山茶屬，是廣西壯族自治區(qū)的道地藥材，主要成分為茶多酚[5]、黃酮[6]、皂苷[6]、多糖[7]等，具有抗腫瘤[8-9]、降血糖[10]、抗氧化[10]、降血脂[11]等作用。2007 年金花茶已被批準(zhǔn)為藥食同源植物，具有良好的應(yīng)用前景。目前金花茶防治NAFLD的作用機(jī)制研究較少，故本研究擬構(gòu)建NAFLD動(dòng)物模型，初探金花茶對(duì)NAFLD的干預(yù)作用及機(jī)制，為金花茶治療NAFLD提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí) C57BL/6 小鼠 48 只，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0037]，體重（21.0±0.5）g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012]。60%NAFLD肥胖模型飼料和含有金花茶提取物的固體飼料，由南通特洛菲飼料科技有限公司制備并提供（批號(hào)：TP 23300、TP 20171102003）。

1.1.2 藥物和試劑 干燥潔凈的金花茶購(gòu)于浙江九支農(nóng)業(yè)科技有限公司。甘油三酯（triglyceride，TG）檢測(cè)試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京普利萊公司（批號(hào)：E1003、E1005）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所（批號(hào)：C009-2、C010-2）；β-actin抗體、極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）抗體、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α（peroxisome proliferator activated receptor-α，PPAR-α）抗體、羊抗兔抗體、羊抗鼠抗體、Western blot超敏化學(xué)發(fā)光底物均購(gòu)于博士德生物工程有限公司（批號(hào)：BM0627、A02195、BA1691、BA1039、BA1038、AR1111）；磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶（phosphorylated-adenosine monophosphate activated protein kinase，p-AMPK）抗體購(gòu)于Cell Signal公司（批號(hào)：#2535）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金花茶提取物制備 選擇干燥清潔的金花茶茶花部分，破碎后過(guò)300目篩，量入10～20倍重量的超純水，100℃水浴提取2次，每次0.5～1h，合兩次過(guò)濾溶液，提取液以孔徑0.45μm濾膜過(guò)濾2次，在真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥成粉末即得金花茶水提物。金花茶粉末則由干燥清潔的金花茶茶花部分經(jīng)打粉機(jī)直接粉碎制成。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及NAFLD模型建立 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，對(duì)照組、NAFLD模型組、金花茶粉末低劑量組、金花茶粉末高劑量組、金花茶水提物低劑量組和金花茶水提物高劑量組，每組8只。對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)，NAFLD模型組予NAFLD肥胖模型飼料，其余各組采用NAFLD肥胖模型飼料中分別加入金花茶粉末和金花茶水提物制成的固體飼料，繼續(xù)喂養(yǎng)8周，建立NAFLD模型。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥情況Tab.1 Experimental grouping and administration

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1 小鼠一般情況觀察 觀察并記錄小鼠的體重、體色體毛、進(jìn)食量、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)等。

1.2.3.2 小鼠體重、脂肪數(shù)據(jù)收集 小鼠末次進(jìn)食后禁食18h，稱(chēng)重，戊巴比妥鈉麻醉后取血，4℃下3 000r/min離心10min，分離血清，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。并?duì)小鼠進(jìn)行解剖，收集肝臟組織及腎周脂肪、附睪脂肪、皮下脂肪并稱(chēng)重。

1.2.3.3 小鼠血清指標(biāo)檢測(cè) 取上述血清檢測(cè)TG、TC、ALT、AST水平，具體操作參照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3.4 小鼠肝臟組織蛋白檢測(cè) 取小鼠肝組織50mg加入離心管，再加入RIPA裂解液1mL，放置冰上裂解10min，12 000r/min離心10min，吸取上清液，蛋白定量后，100℃變性5min，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉1h，一抗孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗孵育、洗膜，進(jìn)行熒光顯色，對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況觀察 在C57BL/6小鼠NAFLD模型構(gòu)建過(guò)程中，對(duì)照組小鼠飲食正常，毛發(fā)有光澤，體型偏瘦；而NAFLD模型組小鼠毛發(fā)黯淡雜亂，體型明顯較胖；金花茶處理的4組小鼠喂養(yǎng)期間飲食正常，毛色比NAFLD模型組鮮亮，體型介于對(duì)照組與NAFLD模型組之間。飼養(yǎng)期間各組無(wú)小鼠死亡情況發(fā)生。

2.2 各組小鼠進(jìn)食量、體重和體脂含量比較 與對(duì)照組比較，其余各組小鼠每天平均進(jìn)食量均減低（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，NAFLD模型組小鼠體重顯著增加（P＜0.05）；與NAFLD模型組比較，金花茶粉末低劑量組與金花茶水提物低劑量組小鼠體重減輕（P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

表2 各組小鼠進(jìn)食量與體重比較Tab.2 Comparison of food intake and body weight in each group

與對(duì)照組比較，NAFLD模型組小鼠的各部位脂肪重量均顯著增加（P＜0.05）。與NAFLD模型組比較，給予金茶花粉末處理后，金花茶粉末低劑量組小鼠的附睪脂肪和皮下脂肪重量均顯著減輕（P＜0.05），金花茶粉末高劑量組附睪脂肪重量顯著減輕（P＜0.05）；給予金茶花水提物處理后，金花茶水提物低劑量組小鼠的附睪脂肪和皮下脂肪重量均顯著減輕（P＜0.05），金花茶水提物高劑量組小鼠的附睪脂肪重量顯著減輕（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

2.3 各組小鼠NAFLD相關(guān)血清生化指標(biāo)比較 高脂膳食喂養(yǎng)至8周時(shí)，與對(duì)照組比較，NAFLD模型組小鼠血清中 TG、TC、ALT、AST水平均顯著增高（P＜0.05）；與NAFLD模型組比較，給予不同劑型與劑量金花茶處理后，小鼠血清中TG水平均顯著降低（P＜0.05），但TC水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與NAFLD模型組比較，金花茶粉末低劑量組、金花茶水提物低劑量組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；而金花茶粉末高劑量組、金花茶水提物高劑量組血清中僅AST水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），ALT 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與金花茶粉末低劑量組比較，金花茶水提物低劑量組血清中AST水平顯著降低（P＜0.05），而ALT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 4。

2.4 金花茶水提物對(duì)小鼠肝組織蛋白表達(dá)的影響

表3 各組小鼠各部位脂肪重量比較（g）Tab.3 Comparison of fat weight of different part in each group(g)

表4 各組小鼠NAFLD相關(guān)血清生化指標(biāo)比較Tab.4 Comparison of related serum biochemical parameters of NAFLD in each group

由于金花茶水提物低劑量組小鼠血清中AST水平較金花茶粉末低劑量組顯著降低，考慮到金花茶水提物可能具有更好的護(hù)肝作用，故選擇金花茶水提物處理組進(jìn)行后續(xù)研究。與對(duì)照組比較，NAFLD模型組VLDLR 蛋白表達(dá)顯著升高 （P＜0.05），p-AMPK、PPAR-α蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；給予金花茶水提物干預(yù)后，與NAFLD模型組比較，金花茶水提物低、高劑量組小鼠肝組織中VLDLR蛋白表達(dá)均顯著降低，p-AMPK與PPAR-α蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖 1。

3 討論

NAFLD肝臟病理學(xué)和影像學(xué)改變與酒精性肝病相似，但無(wú)過(guò)量飲酒等導(dǎo)致肝脂肪變的其他原因，患者通常存在營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、肥胖和代謝綜合征（metabolic syndrome）相關(guān)表現(xiàn)（腹型肥胖、高血壓、高TG血癥、低高密度脂蛋白膽固醇血癥、高血糖）[12]，相當(dāng)一部分NAFLD患者還合并存在NASH，若不及時(shí)控制有可能會(huì)惡化為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌。鑒于NAFLD是肥胖和代謝綜合征累及肝臟的表現(xiàn)，大多數(shù)患者仍處于單純性脂肪肝階段，故治療NAFLD的首要方式為減肥和改善IR[1]，而目前臨床治療的藥物大多具有肝毒性，可能加重肝臟負(fù)擔(dān)，故本研究希望從中醫(yī)藥中尋找防治NAFLD的藥物。

張萍[11]研究發(fā)現(xiàn)，金花茶茶花水提物與醇提物均能降低NAFLD大鼠血清中TG、TC和低密度脂蛋白含量。黃永林等[13]發(fā)現(xiàn)，金花茶葉醇提物能降低NAFLD血癥鵪鶉總膽固醇含量。何進(jìn)勇等[14]發(fā)現(xiàn)，金花茶提取物能有效降低高脂血癥小鼠血清中TC、TG和低密度脂蛋白膽固醇水平，而對(duì)血清中的AST、ALT、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平無(wú)明顯影響。這些研究初步證實(shí)金花茶具有良好的降血脂作用，且對(duì)肝功能無(wú)明顯影響。此外，牛廣俊等[7]發(fā)現(xiàn)在金花茶各部位中，茶花中的黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他部位。故本研究在此基礎(chǔ)上，選擇金花茶茶花為研究對(duì)象。又因金花茶作為一種藥食同源的植物，故嘗試將其茶花加入高脂飼料，探究其對(duì)高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型的 TG、TC、ALT、AST、體重及其他代謝相關(guān)指標(biāo)的影響。此外，由于在高脂飼料中加入金花茶的配制方式無(wú)現(xiàn)有研究作為參考，本研究先擬定成人劑量為1朵/d，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中小鼠與人的劑量換算，初步得到金花茶粉末的加藥范圍，金花茶水提物的加藥劑量范圍則根據(jù)其粉末提取得率進(jìn)行換算。

圖1 各組小鼠肝組織蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparison of protein expression of liver tissue in each group

本研究結(jié)果表明，低劑量金花茶粉末和水提物均能有效降低NAFLD小鼠的體重，減小其附睪脂肪重量，而對(duì)腎周脂肪無(wú)明顯影響。此外，低劑量金花茶粉末和水提物還能有效抑制高脂飲食攝入導(dǎo)致的TG、ALT、AST升高。而且與相同劑量的金花茶粉末相比，低劑量的金花茶茶花水提物具有更好的肝臟保護(hù)作用。

VLDLR與細(xì)胞脂蛋白攝取TG的過(guò)程有關(guān)[15]。VLDLR通過(guò)與極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）、乳糜微粒等脂蛋白結(jié)合，加快細(xì)胞對(duì)外周TG的攝取。VLDLR的過(guò)量表達(dá)可以抑制低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）和乳糜微粒受體的表達(dá)，導(dǎo)致NAFLD小鼠出現(xiàn)肝脂肪變性。金花茶水提物干預(yù)抑制了NAFLD小鼠肝臟的VLDLR過(guò)量表達(dá)，降低肝細(xì)胞脂肪變性的概率。

PPAR-α是參與過(guò)氧化物酶體和線粒體β-氧化、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和肝葡萄糖生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[16]，參與多種代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)。肝臟特異性敲除PPAR-α?xí)茐母闻K和全身脂肪酸的平衡。在衰老過(guò)程中，肝臟PPAR-α特異性敲除能誘發(fā)NAFLD和高膽固醇血癥[17]。上調(diào)PPAR-α能降低肝臟組織和血漿中的TG含量[18]，抑制促炎因子的生成和肝細(xì)胞炎癥的發(fā)生[19]，減輕肝纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，金花茶水提物干預(yù)可以誘導(dǎo)NAFLD小鼠PPAR-α蛋白表達(dá)增高，減少肝細(xì)胞脂肪病變。

AMPK蛋白在調(diào)節(jié)糖脂代謝平衡方面發(fā)揮著重要作用[20]，巨噬細(xì)胞中的AMPK促進(jìn)炎癥消退、逆轉(zhuǎn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和肥胖導(dǎo)致的IR；肝細(xì)胞中的AMPK對(duì)預(yù)防肝臟脂質(zhì)累積和IR具有重要作用，但不能直接抑制肝臟葡萄糖的生成。AMPK通過(guò)抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C（sterol regulatory element-binding protein 1C，SREBP1C）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）的磷酸化來(lái)抑制脂肪酸和膽固醇的合成，同時(shí)AMPK可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-應(yīng)激蛋白（C/Ebp-homologous protein，CHOP）磷酸化可減少細(xì)胞凋亡[21]。肝細(xì)胞AMPK β1基因敲除后，肝臟AMPK活性降低，從而導(dǎo)致脂肪酸氧化的減少和脂肪生成的增加[22]。2型糖尿病大鼠肝臟AMPK α1的過(guò)表達(dá)抑制了脂肪生成基因表達(dá)，進(jìn)而降低肝臟TG含量，減少肝脂肪變性[23]。本研究則證實(shí)，金花茶水提物激活了NAFLD小鼠肝臟中AMPK通路，加快小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝。

本研究中給予低劑量金花茶水提物干預(yù)后，NAFLD小鼠肝臟VLDLR蛋白表達(dá)水平顯著降低，p-AMPK蛋白與PPAR-α蛋白表達(dá)水平均顯著升高。從不同角度證明了，低劑量的金花茶水提物通過(guò)抑制高脂飲食引起的VLDLR過(guò)表達(dá)、激活A(yù)MPK通路并上調(diào)PPAR-α蛋白的表達(dá)，減輕肝臟中TG蓄積，減輕了NAFLD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥反應(yīng)，進(jìn)而具有改善NAFLD的效果。其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/PPAR-α信號(hào)通路，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞中脂肪酸氧化增加與脂質(zhì)蓄積減少，加快NAFLD小鼠肝臟的脂質(zhì)代謝有關(guān)。

綜上所述，本研究初步證實(shí)低劑量的金花茶水提物能在一定程度上減輕NAFLD，為后續(xù)金花茶防治NAFLD的研究提供參考。然而本研究還存在一定不足，如金花茶的單體和合適劑量尚未確定，相關(guān)信號(hào)通路和干預(yù)的有效靶點(diǎn)有待證實(shí)等，進(jìn)一步研究中將優(yōu)化金花茶的提取方法，以確定合適劑量，并進(jìn)一步明確其作用的分子靶點(diǎn)，以期為金花茶提取物治療NAFLD提供更加明確的依據(jù)。