激活自噬改善長鏈飽和游離脂肪酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)

賴尚磊 朱翔鴻 竇曉兵

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)濱江學(xué)院

3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、公共衛(wèi)生學(xué)院

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是公認(rèn)的心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素及病理基礎(chǔ)，AS發(fā)生的影響因素復(fù)雜且病程漫長，迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚未完全研究清楚。已有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的過量表達(dá)是導(dǎo)致AS發(fā)生的起始步驟及重要危險(xiǎn)因素[1]。

自噬（autophagy）是真核細(xì)胞中廣泛存在的一種高度保守的、利用溶酶體降解并回收細(xì)胞內(nèi)生物大分子或細(xì)胞器的過程。近年來隨著自噬調(diào)控機(jī)制研究的逐步深入，其與多種疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系也成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)[2]。研究表明，激活自噬對于改善AS的病理進(jìn)程具有重要作用[3]，然而自噬調(diào)控防治AS的作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究以長鏈飽和游離脂肪酸（long-chain saturated free fatty acids，L-SFAs）誘導(dǎo)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，通過探究自噬調(diào)控對L-SFAs誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)的影響，揭示自噬調(diào)控AS的潛在作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 軟脂酸（palmitic acid，PA）、硬脂酸（stearic acid，SA）、DMEM/F12培養(yǎng)基、不含氨基酸及葡萄糖的EBSS培養(yǎng)基、氯喹（chloroquine，CQ）、巴弗洛霉素 A1（Bafilomycin A1，Baf A1）均購于Sigma-Aldrich 公 司 （批 號 ：P5585、S4751、D6421、E2888、C6628、196000）；雷帕霉素（rapamycin，Rap）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）抑制劑（U0126）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制劑（SP600125）、p38抑制劑（SB203580）購于 Selleck公司（批號：S1039、S1102、S1460、S1076）；Atg5 的 siRNA干擾劑（siAtg5）由上海吉瑪公司合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司（批號：P0010）；引物由上海生工生物工程公司合成。RT-PCR儀購于ABI公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于Thermo公司；低溫離心機(jī)為Beckman公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)購于Protein Simple公司。

1.1.2 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購于澳賽爾斯生物技術(shù)（上海）公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于24孔板，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 L-SFAs的配制 PA及SA的配制方法參考文獻(xiàn)[4]。

1.2.3 細(xì)胞干預(yù) 取對數(shù)生長期的HUVECs，以0、0.25、0.5、0.75mmol·L-1PA 或 SA 干預(yù)后進(jìn)行后續(xù)檢測；從中選取 0.5mmol·L-1藥物濃度進(jìn)行 0、3、6、12、24h不同時(shí)間干預(yù)后進(jìn)行后續(xù)檢測；最后選取0.5mmol·L-1PA或SA干預(yù)12h后進(jìn)行檢測。

1.2.4 熒光定量PCR檢測VCAM-1表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，4℃下12 000r/min離心5min，棄去上清液，漂洗后干燥，溶于適量預(yù)冷DEPC水中，測定RNA濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測VCAM-1（F：5′-TTC CCT AGA GAT CCA GAA ATC GAG-3′，R：5′-CTT GCA GCT TAC AGT GAC AGA GC-3′）的mRNA 表達(dá)，并以 18s（F：5′-ACC AAC AAA ATA GAA CCG CG-3′，R：5′-GGG AGG TAG TGA CGA AAA AT-3′）為內(nèi)參進(jìn)行校正。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 1min，95℃變性 30s，60℃退火 30s，共 30個(gè)循環(huán)，并利用2-△△CT計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測VCAM-1蛋白表達(dá) 分別以0、0.25、0.5、0.75mmol·L-1PA 和 SA 干預(yù) 6h，將0mmol·L-1PA和SA預(yù)的細(xì)胞設(shè)為空白對照組。收集各組細(xì)胞，以Western blot檢測各組VCAM-1蛋白表達(dá)，具體操作過程參考文獻(xiàn)[4]。

1.2.6 激活自噬 采用EBSS培養(yǎng)基模擬饑餓狀態(tài)或采用50nmol·L-1自噬特異性激動(dòng)劑Rap干預(yù)細(xì)胞6h，檢測自噬的標(biāo)志蛋白抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）轉(zhuǎn)化情況；再次采用EBSS培養(yǎng)基或50nmol·L-1Rap預(yù)處理細(xì)胞1h，而后以0.5mmol·L-1PA干預(yù)12h。

1.2.7 抑制自噬 采用20μmol·L-1自噬特異性抑制劑CQ或100nmol·L-1Baf A1干預(yù)細(xì)胞1h，而后以0.5mmol·L-1PA 干預(yù) 12h。

1.2.8 siAtg5轉(zhuǎn)染HUVECs 以siAtg5沉默自噬關(guān)鍵基因Atg5的方式抑制自噬，通過Western blot檢測陰性對照組Atg5與siAtg5組Atg5的蛋白表達(dá)量計(jì)算siAtg5抑制效率。siAtg5的干擾序列：Atg5-siRNAs 15′-GCA ACT CTG GAT GGG ATTG-3′，Atg5-siRNAs 25′-CAT CTG AGC TAC CCG GATA-3′；陰性對照隨機(jī)序列：Scramble-siRNAs 5′-TAA GGC TAT GAA GAG ATAC-3′。siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作按照干擾試劑說明書進(jìn)行。

1.2.9 MAPKs通路抑制劑干預(yù) 分別使用10μmol·L-1ERK1/2 抑制劑 U0126、10μmol·L-1JNK 抑制劑SP600125和 10μmol·L-1p38抑制劑 SB203580預(yù)處理細(xì)胞1h，而后以0.5mmol·L-1PA干預(yù)12h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA干預(yù)對VCAM-1表達(dá)的影響 不同濃度PA干預(yù)均可提高VCAM-1轉(zhuǎn)錄水平，與空白對照組（0mmol·L-1PA 組） 比較，0.5 及 0.75mmol·L-1PA 干預(yù)可顯著提高VCAM-1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。見圖 1A。以 0.5mmol·L-1PA干預(yù) 6、12、24h后可顯著提高 VCAM-1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），其中干預(yù)12h后VCAM-1的mRNA表達(dá)水平最高。見圖1B。從中選取實(shí)驗(yàn)結(jié)果較顯著的濃度0.5mmol·L-1及干預(yù)時(shí)間12h進(jìn)行后續(xù)研究，提示0.5mmol·L-1PA干預(yù)12h可顯著提高VCAM-1蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）。見圖1C。

圖1 PA干預(yù)對VCAM-1表達(dá)的影響Fig.1 Effect of PA on VCAM-1 expression

2.2 SA干預(yù)對VCAM-1表達(dá)的影響 SA同樣以劑量依賴的方式激活 VCAM-1的轉(zhuǎn)錄（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2A。與空白對照組（0mmol·L-1SA組）比較，0.5mmol·L-1SA干預(yù)不同時(shí)間后均顯著提高VCAM-1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。見圖2B。0.5mmol·L-1SA干預(yù)12h后，細(xì)胞內(nèi)VCAM-1的蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）。見圖 2C。

圖2 SA干預(yù)對VCAM-1表達(dá)的影響Fig.2 Effect of SA on VCAM-1 expression

2.3 激活自噬對PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)的影響 采用饑餓或50nmol·L-1自噬激動(dòng)劑Rap干預(yù)細(xì)胞后可顯著激活細(xì)胞自噬（P＜0.01）。見圖3A。激活自噬后能夠顯著抑制PA誘導(dǎo)的VCAM-1的mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.01）。見圖3B。此外，激活自噬顯著抑制了PA作用12h后誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)VCAM-1蛋白表達(dá)（P＜0.01）。見圖 3C。

圖3 激活自噬對PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)的影響Fig.3 Effect of autophagy activation on VCAM-1 expression induced by PA

2.4 抑制自噬對PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)的影響 分別以 20μmol·L-1細(xì)胞自噬抑制劑 CQ及100nmol·L-1Baf A1 干預(yù)細(xì)胞 1h，而后以0.5mmol·L-1PA干預(yù)12h，結(jié)果顯示抑制自噬顯著上調(diào)PA誘導(dǎo)的VCAM-1的 mRNA及蛋白表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 4。

圖4 抑制自噬對PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)的影響Fig.4 Effect of autophagy inhibition on VCAM-1 expression induced by PA

2.5 siRNA干擾自噬相關(guān)基因5（Atg5）對PA誘導(dǎo)的VCAM-1的轉(zhuǎn)錄激活的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證抑制自噬對PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)的調(diào)控作用，采用siRNA特異性抑制自噬相關(guān)基因Atg5的表達(dá)，結(jié)果表明siAtg5顯著抑制了Atg5的表達(dá)（P＜0.05）。見圖5A。沉默Atg5顯著增高了PA誘導(dǎo)的VCAM-1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。見圖5B。

圖5 沉默Atg5對PA誘導(dǎo)的VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of silencing of Atg5 on VCAM-1 mRNA expression induced by PA

2.6 p38信號通路參與自噬調(diào)控PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá) 分別以ERK1/2、JNK及p38抑制劑預(yù)處理細(xì)胞1h，而后以PA干預(yù)12h，研究結(jié)果表明抑制p38信號通路顯著抑制了PA誘導(dǎo)VCAM-1的轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05），而抑制ERK1/2和JNK信號通路對VCAM-1的轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響（P＞0.05）。見圖6A。采用饑餓方式激活自噬也能夠顯著抑制PA誘導(dǎo)的p38磷酸化（P＜0.05）。見圖6B。而采用自噬抑制劑CQ抑制自噬顯著增強(qiáng)PA誘導(dǎo)的p38磷酸化（P＜0.05）。見圖6C。說明自噬通過調(diào)控p38參與的信號通路影響PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)。

圖6 自噬調(diào)控p38信號通路影響PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)Fig.6 Autophagy regulated p38 signaling pathway affecting VCAM-1 expression induced by PA

3 討論

AS是一種慢性血管壁炎癥性疾病，是導(dǎo)致心血管疾病患者發(fā)病或死亡的主要原因。血管內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子激活，通過與整合素α4β1的相互作用將循環(huán)單核細(xì)胞招募到內(nèi)皮細(xì)胞，通常被認(rèn)為是AS的早期病理改變[5]。而血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，導(dǎo)致VCAM-1表達(dá)的增加，被認(rèn)為是AS發(fā)生的起始階段及先決條件[6]。現(xiàn)有研究表明，采用單克隆抗體抑制VCAM-1表達(dá)可顯著抑制實(shí)驗(yàn)小鼠AS斑塊的形成[7]。因此，研究抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的途徑可能是防治AS的有效策略。

VCAM-1水平在高脂血癥人群中顯著增加，提示脂類水平增加是誘導(dǎo)VCAM-1激活的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素[8]，本研究以HUVECs為研究對象，使用L-SFAs中的兩種代表性脂肪酸PA和SA進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果提示PA和SA均可顯著促進(jìn)HUVECs中VCAM-1的轉(zhuǎn)錄激活及蛋白表達(dá)，這一結(jié)果與現(xiàn)有研究一致[9]。由于PA和SA兩者作用的一致性，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇PA干預(yù)細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬與包括AS在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[10]。在AS病變細(xì)胞內(nèi)，自噬水平被顯著抑制[11]；激活自噬可顯著改善apoE-/-小鼠的AS斑塊形成[12]。近來研究表明，自噬參與調(diào)控炎性因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)[13]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，激活自噬可顯著改善L-SFAs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的活化。

MAPKs信號通路的激活與L-SFAs、炎性因子、氧化應(yīng)激等因素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的活化關(guān)系密切。研究表明，L-SFAs可顯著激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的ERK1/2、JNK及p38的表達(dá)水平[14]。然而自噬能否通過調(diào)控上述信號通路影響VCAM-1的表達(dá)目前尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，特異性抑制p38信號通路可顯著改善PA誘導(dǎo)的VCAM-1的轉(zhuǎn)錄激活，同時(shí)還證實(shí)激活或抑制自噬也可顯著改善或加重PA誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)增加，而激活自噬還能夠直接抑制p38的磷酸化，上述結(jié)果表明自噬可能通過調(diào)控p38參與的信號通路影響血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)激活自噬能夠降低L-SFAs誘導(dǎo)的p38磷酸化，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)，由此自噬調(diào)控有望成為改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及防治AS的有效策略。