新型產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌Arthrobacter sp. ZXY772的分離鑒定及其應(yīng)用

陳彥梅 聶語(yǔ)琪 謝燕純 鄧素奇 張揚(yáng) 周欽茂 陳瓊?cè)A

摘要? ? 從廣東省南澳島采集龍須菜（Gracilaria lemaneiformis），分離出一株酶活性較高的瓊膠酶產(chǎn)生菌，探究其應(yīng)用價(jià)值，通過(guò)篩選培養(yǎng)基分離產(chǎn)瓊膠酶的菌株，采用形態(tài)學(xué)和16S rRNA基因序列分析對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù);采用DNS比色法對(duì)瓊膠酶活性進(jìn)行測(cè)定;初步探究菌株所產(chǎn)瓊膠酶類(lèi)型和酶解產(chǎn)物的抑菌效果。結(jié)果表明，經(jīng)分離純化得到一株產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌ZXY772，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性球桿菌，屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）;胞外酶只產(chǎn)β-瓊膠酶;該菌株于28 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min液體發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為3～14 h，當(dāng)菌株搖床發(fā)酵至27 h，其瓊膠酶活力到達(dá)最高96.0 U/mL;菌株粗酶液的酶解產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最強(qiáng)，其抑菌圈直徑大小到達(dá)14.45 mm。

關(guān)鍵詞? ? 瓊膠酶;節(jié)桿菌屬;鑒定;抑菌

中圖分類(lèi)號(hào)? ? Q936? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）17-0237-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? A agarase-producing strain was isolated and identified from Gracilaria lemaneiformis collected from Nan′ao Island，Guangdong Province to study its wide application values. The agarase-producing strains were isolated by different screening culture-mediums，and identified by morphology and the analyses of 16S rRNA sequence to construct a phylogenetic tree. The agarase activity was determined by DNS colorimetry. Agarase type produced by the strains and the bacteriostatic effect of enzymatic hydrolysate were investigated.The results showed that after isolation and purification，a strain of agarase-producing ZXY772 was obtained. The strain was Gram-positive，coccus，belonging to Arthrobacter sp.，producing extracellular β-agarase.The strain was cultured in a liquid fermentation medium under the condition of 180 r/min and 28 ℃，the logarithmic phase of the strain was 3-14 h and the agarase activity of ZXY772 reached 96.0 U/mL after fermenting for 27 h.The enzymatic hydrolysate of the crude enzyme solution had the most obvious bacteriostasis to Bacillus subtilis，and the diameter of the inhibition zone reached 14.45 mm.

Key words? ? agarase;Arthrobacter sp.;identification;bacteriostasis

瓊膠（agar）是一種海洋多糖，普遍存在于石花菜、龍須菜等多種藻類(lèi)植物及部分寄生在軟體動(dòng)物的海洋細(xì)菌當(dāng)中。目前，工業(yè)大量生產(chǎn)瓊膠的首要來(lái)源是海藻。

我國(guó)海域具有豐富的海藻資源，其中數(shù)千種海藻中有一百多種被認(rèn)為有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，我國(guó)在海藻養(yǎng)殖方面取得了很大進(jìn)展，但在開(kāi)發(fā)利用方面還比較薄弱，存在很大的資源利用空間。利用海藻生產(chǎn)出來(lái)的瓊脂，水解成瓊膠低聚糖即瓊膠寡糖，具有多種生理活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒、抗血栓等[1]，在食品、化工、醫(yī)藥、美妝方面[2]有重大的利用價(jià)值。當(dāng)前利用瓊膠獲取瓊膠寡糖的方法主要有生物酶法和化學(xué)法。其中，化學(xué)法處理有較多不足和局限，如較難精確控制水解度，后期的分離純化過(guò)程十分復(fù)雜，不容易操作，而且利用該法生成的瓊膠寡糖生物活性很低并容易喪失;而生物酶法作用環(huán)境十分溫和，降解過(guò)程易控制，產(chǎn)物專(zhuān)一且易于分離純化，工藝環(huán)保高效[3]。因此，為解決海藻深加工及瓊膠寡糖開(kāi)發(fā)利用所面臨的瓶頸問(wèn)題，新型高產(chǎn)瓊膠酶菌株的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用基礎(chǔ)研究勢(shì)在必行，這也是本試驗(yàn)研究的意義所在。

瓊膠酶主要通過(guò)藻類(lèi)生物和海洋微生物獲得，其中海洋微生物來(lái)源居多。因此，獲得高產(chǎn)瓊膠酶菌株是開(kāi)發(fā)微生物瓊膠酶的前提條件。迄今，人們對(duì)瓊膠酶產(chǎn)生菌的探究已經(jīng)逐漸深入，現(xiàn)已從海洋藻類(lèi)、海洋軟體動(dòng)物及淤泥中分離得到多株瓊膠酶產(chǎn)生菌，包括假單孢菌屬（Pseudomonas sp.）[4]、假交替單胞菌屬（Alteromonas sp.）[5]、弧菌屬（Vibrio sp.）[6]、船蛆桿菌屬（Teredinibacter sp.）[7]、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp.）[8-11]和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）[12]等，但是普遍存在的問(wèn)題是這些菌株所產(chǎn)瓊膠酶活性低，多數(shù)報(bào)道的菌株產(chǎn)瓊膠酶活力在10 U以下、降解瓊膠能力普遍較低，遠(yuǎn)未能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)瓊膠寡糖的需求[13]，嚴(yán)重阻礙了海藻的深加工及瓊膠寡糖的開(kāi)發(fā)利用[14]。迄今只有Sigma公司從大西洋假單胞菌中分離的β-瓊膠酶應(yīng)用于生產(chǎn)且價(jià)格十分昂貴，目前應(yīng)用范圍僅限于科研工作中[15]。因此，篩選出高產(chǎn)瓊膠酶菌株，對(duì)攻克當(dāng)前瓊膠酶活力低、產(chǎn)量小的難關(guān)具備重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價(jià)值，是我國(guó)研究海藻多糖降解酶的首要方向。

因此，本研究選擇富含瓊膠的海洋龍須菜作為瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離對(duì)象，通過(guò)多種不同的篩選培養(yǎng)基，從海洋龍須菜中分離得到產(chǎn)瓊膠酶菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)及16S rRNA基因序列分類(lèi)鑒定、發(fā)酵產(chǎn)酶研究，初步探究其酶解產(chǎn)物的抑菌性，旨在獲得新型高產(chǎn)瓊膠酶菌株，為瓊膠酶及瓊膠寡糖的開(kāi)發(fā)利用奠定一定基礎(chǔ)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

新鮮海洋龍須菜，于2016年8月采自廣東省南澳海域。

X-半海水固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g，蛋白胨6 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，人工海水配制，pH值7.2。2216E培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高鐵0.01 g，人工海水配制，pH值7.5。改良后培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4 0.1 g，（NH4）2SO4 2 g，K2HPO4 7 g，KH2PO4 3 g，瓊脂粉15 g，人工海水配制，pH值7.2。富集培養(yǎng)基：瓊脂粉2 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，NaCl 20 g，pH值7.0[16]。種子培養(yǎng)基：瓊脂粉2 g，牛肉膏5 g，酵母膏1.5 g，Ca2+ 0.2 g，人工海水配制，pH值7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：瓊脂粉2 g，麥芽糖1 g，檸檬酸三銨5 g，酵母膏1.5 g，Mg2+ 0.5 g，Ca2+ 0.2 g，F(xiàn)e2+ 0.02 g，人工海水配制，pH值7.5。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，pH值7.2。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，pH值7.2。

1.2? ? 主要試劑與儀器

α-pNPG和β-pNPG（麥克林Macklin生產(chǎn)），瓊脂為進(jìn)口分析純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（均購(gòu)買(mǎi)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（Airtech公司），SX-50高壓蒸汽滅菌鍋（Tomy公司），PB-10精密pH計(jì)（Sartorius公司），BS423S天平（Sartorius公司），ETC 811 PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），7230G紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海諾科）。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 瓊膠酶菌株的篩選。將從南澳島采集到的海洋龍須菜，采用均質(zhì)法和振蕩法制備樣品，取懸液接入富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行系列稀釋?zhuān)瞥?10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 一系列梯度稀釋菌懸液。依次涂布3個(gè)平板，并將涂布后的平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～7 d，觀察其菌落的生長(zhǎng)狀況和特征。挑取周?chē)哂忻黠@水解圈或凹陷的菌落，在X-半海水固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行3次以上劃線純化培養(yǎng)，將分離到的菌株平板點(diǎn)接培養(yǎng)后進(jìn)行盧戈氏碘液染色，觀察菌落周?chē)a(chǎn)生的水解透明圈大小情況以便進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.2? ? 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定。將挑選獲得的高產(chǎn)瓊膠酶菌株，經(jīng)平板劃線后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，肉眼觀察其菌落形態(tài)特征。菌株的革蘭氏染色、芽孢染色試驗(yàn)等參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]。

1.3.3? ? 菌株的16S rRNA基因序列擴(kuò)增、比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析。挑取少許活化菌體利用煮沸法對(duì)其進(jìn)行破壁處理，作為PCR模板DNA。PCR引物分別選取細(xì)菌鑒定擴(kuò)增通用引物27F（5′-AGAGTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGCTAC CTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，交由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因序列分析測(cè)定，將分析結(jié)果通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心NCBI（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov）在GenBank上進(jìn)行BLAST序列分析比對(duì)，分析待檢菌株與其他菌株的同源關(guān)系，挑選與待檢菌株相似度較高的模式菌，采用軟件Mega 7.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4? ? 瓊膠酶活力的測(cè)定。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確量取0.100 g干燥至恒重的半乳糖于100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，并定容至100 mL作為標(biāo)準(zhǔn)半乳糖溶液（1 mg/mL），準(zhǔn)確依次量取該溶液0、0.200、0.400、0.600、0.800、1.000、1.200、1.400、1.600 mL分別置于9支25 mL具塞比色管中[18]。按表1數(shù)據(jù)加入適量溶液，經(jīng)沸水浴處理5 min，冷卻定容至25 mL，得到半乳糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048、0.056、0.064 mg/mL，震蕩搖勻后于波長(zhǎng)540 nm下測(cè)OD值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）DNS法測(cè)定瓊膠酶酶活。挑取活化后的菌株2～3環(huán)接入裝有60 mL培養(yǎng)液的100 mL種子培養(yǎng)基中，于28 ℃搖床培養(yǎng)18 h后，按4%接種量轉(zhuǎn)接到裝有100 mL培養(yǎng)液的500 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)30 h后，取適量發(fā)酵液于4 ℃、5 000 r/min冷凍離心10 min，緩慢倒取上清液，即得發(fā)酵粗酶液進(jìn)行下一步研究。

采用DNS測(cè)定還原糖的方法測(cè)定瓊膠酶酶活力[19]。具體步驟如下：取100 μL粗酶液加入1 mL以NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制而成的瓊脂底物中，置于適宜溫度條件下45 ℃水浴處理30 min后，加入1.5 mL已在相同溫度條件下預(yù)熱的DNS溶液中，煮沸5 min，經(jīng)冷卻后加入蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光值;以滅活處理的粗酶液為對(duì)照，利用半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酶降解底物所產(chǎn)生還原糖的量[16]。將瓊膠酶的活力定義為：在上述反應(yīng)處理?xiàng)l件下，1 mL酶液1 min產(chǎn)生1 μg還原糖作為1個(gè)酶活力單位（U/mL）[20]。

瓊膠酶活力（U/mL）=半乳糖含量（mg）×1 000×粗酶液（mL）×稀釋倍數(shù)/反應(yīng)體系中酶液加入量（mL）×?xí)r間（min）[16]

1.3.5? ? 菌株生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶曲線的測(cè)定。利用滅菌接種環(huán)取活化菌株2～3環(huán)于配制好的種子培養(yǎng)基中，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h后，依照4%比例接種至改良發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min下?lián)u床培養(yǎng)，定期取樣于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)量其稀釋10倍后菌液的吸光值，計(jì)算菌株生物量，并測(cè)定該粗酶液的產(chǎn)酶活力和pH值，繪制該菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶曲線。

1.3.6? ? 瓊膠酶類(lèi)型的鑒別。參照Temuujin U[21]，馬芮萍[12]等的方法，對(duì)照組、試驗(yàn)組各取1 mL 50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH值7.0）與400 μL 4 mg/mL pNPG（α-pNPG和β-pNPG）置于45 ℃環(huán)境恒溫水浴預(yù)熱5 min。在試驗(yàn)組中快速加入1 mL在相同溫度條件下預(yù)熱好的新鮮酶液，對(duì)照組則加入高溫煮沸滅活的酶液作為對(duì)照，混勻后均置于45 ℃水浴加熱1 h，再加入1 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，快速測(cè)定在波長(zhǎng)420 nm下的吸光度值。

1.3.7? ? 酶解產(chǎn)物抑菌性的測(cè)定。將發(fā)酵的粗酶液加入0.3%瓊膠底物中，于45 ℃條件下振蕩水浴90 min，160 r/min。所得樣品于5 000 r/min離心10 min后取上清液，經(jīng)200目篩過(guò)濾器得到的無(wú)菌瓊膠寡糖溶液于4 ℃貯存?zhèn)溆?。將指示菌株大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種適量于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床恒溫培養(yǎng)16～18 h。取0.9%無(wú)菌生理鹽水配制成菌懸液，用移液槍吸取100 μL稀釋菌液進(jìn)行平板涂布。待平板表面無(wú)液體時(shí)，用無(wú)菌鑷子取濾紙片貼在平板相應(yīng)區(qū)域，吸取100 μL瓊膠寡糖溶液于濾紙片上[22];平板中間的濾紙片加等量50 μg/mL氨芐青霉素作對(duì)照。其中，分別將指示菌株設(shè)為1組，各組均有1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和1個(gè)陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為只涂布指示菌株溶液的平板，陰性對(duì)照為只涂布無(wú)菌0.9%生理鹽水的平板。將上述平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)16～18 h后，及時(shí)觀察其抑菌效果。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 產(chǎn)瓊膠酶菌株的分離篩選及形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1? ? 產(chǎn)瓊膠酶菌株的篩選。從采集到的海洋龍須菜樣品中分離篩選得到18株產(chǎn)瓊膠酶菌株，其中1株菌株編號(hào)為ZXY772。對(duì)ZXY772菌株進(jìn)行盧戈氏碘液法染色后，菌落四周形成較明顯的透明圈，透明圈直徑約為11.21 mm，如圖1所示。由此表明該菌株對(duì)瓊膠具有較顯著的降解能力[23]。

2.1.2? ? 產(chǎn)瓊膠酶菌株的形態(tài)學(xué)觀察。菌株平板分區(qū)劃線結(jié)果和單染色鏡檢結(jié)果如圖2所示，菌株ZXY772在瓊脂平板上有明顯的凹陷，在平板上可形成圓形菌落，菌落直徑約為1～2 mm，因培養(yǎng)時(shí)間不同呈淡黃色至黃色，菌落表面微隆起，濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊。該菌株為革蘭氏陽(yáng)性（G+）細(xì)菌，短桿形至近球形，有明顯的桿、球周期變化，呈V形排列，無(wú)芽孢。

2.2? ? 菌株的16S rRNA基因序列擴(kuò)增、比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖3所示，在約1 500 bp處得到1條清晰、通亮、單一的條帶，符合預(yù)期長(zhǎng)度。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，經(jīng)拼接獲得1022個(gè)堿基序列，將分析結(jié)果交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上（登錄號(hào)XY4GUF9D014）。將測(cè)序所得基因序列在NCBI上通過(guò)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)，菌株ZXY772的16S rRNA基因序列與Arthrobacter nicotianae strain BS23、Arthrobacter nicotianae strain S2、Arthr-obacter nicotianae strain YNA111等節(jié)桿菌屬細(xì)菌的序列相似度達(dá)到99%，因而可初步判定ZXY772為節(jié)桿菌屬（Arth-robacter sp.）。將這些相似性達(dá)到98%以上的模式菌株序列，采用軟件MEGA7.0進(jìn)行模式菌同源比對(duì)，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4所示。

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上看，菌株ZXY772與Arthrobacter nicot-ianae strain BS23，Arthrobacter nicotianae strain VITNJ6等聚為一簇，構(gòu)建出的bootstrap達(dá)到99%，綜合革蘭氏染色結(jié)果、16S rRNA序列相似性，可鑒定菌株ZXY772為1株節(jié)桿菌屬細(xì)菌（Arthrobacter sp.）。

2.3? ? 菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶曲線

取種子液依照4%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于28 ℃、180 r/min條件下進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間定期取樣，測(cè)定菌株ZXY772的生物量、產(chǎn)酶活力和pH值。測(cè)定產(chǎn)酶活力的半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。

菌株ZXY772的生長(zhǎng)特性與產(chǎn)酶活性并非成完全正相關(guān)（圖6），其生長(zhǎng)特性與細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律一致，0～3 h時(shí)為菌株生長(zhǎng)繁殖的延滯階段，生長(zhǎng)極其遲緩;在3 h以后即開(kāi)始進(jìn)入菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期;3～14 h期間，菌體生物量快速上升，培養(yǎng)基中發(fā)酵液的pH值由7.25升至8.28，猜測(cè)是由于培養(yǎng)基組分中的檸檬酸三銨經(jīng)菌體代謝后產(chǎn)生某種堿性物質(zhì);14～33 h處于相對(duì)穩(wěn)定期。其中，當(dāng)培養(yǎng)21 h時(shí)，菌體密度達(dá)到最大值;同時(shí)在這一時(shí)期，培養(yǎng)27 h時(shí)，發(fā)酵液酶活力升至最大值，酶活力達(dá)到96 U/mL。隨后發(fā)酵液中死亡菌體數(shù)逐漸上升，進(jìn)入了衰亡期，pH值由8.28升至8.81，可能是由于菌體衰亡、自溶導(dǎo)致pH值迅速上升;也可能是由于碳源被利用完，菌體被迫利用胞內(nèi)有機(jī)酸所致。27 h后隨著菌體衰亡，死亡菌體數(shù)密度逐漸增大，發(fā)酵液的產(chǎn)酶活力逐漸降低，酶活力幾乎接近0。

2.4? ? 菌株瓊膠酶類(lèi)型的鑒定

將菌株ZXY772發(fā)酵得到的粗酶液分別和α-pNPG與β-pNPG混合反應(yīng)1 h。結(jié)果顯示，粗酶液與α-pNPG的混合液反應(yīng)前后在420 nm處的吸光度值均為0.223，無(wú)變化;粗酶液與β-pNPG的混合液反應(yīng)前后在420 nm處的吸光度值分別為0.201、0.234。粗酶液可以作用于含有β-糖苷鍵的 β-pNPG，未作用于含有α-糖苷鍵的α-pNPG。由此可推斷，該菌株胞外只產(chǎn)β-瓊膠酶。

2.5? ? 菌株酶解產(chǎn)物的抑菌結(jié)果

利用濾紙片法檢測(cè)菌株ZXY772的酶解產(chǎn)物對(duì)指示菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活力。數(shù)據(jù)表明，菌株ZXY772的瓊膠酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有較大的抑制圈，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為6.83 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為7.51 mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活力最高，透明圈直徑達(dá)到14.45 mm。

3? ? 討論

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外與瓊膠酶產(chǎn)生菌相關(guān)資料中鮮少有人報(bào)導(dǎo)過(guò)節(jié)桿菌屬，其是1株新型的瓊膠酶產(chǎn)生菌株。通過(guò)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，可判定菌株ZXY772是1株新型的產(chǎn)瓊膠酶節(jié)桿細(xì)菌。其中，相比相同研究領(lǐng)域的瓊膠酶酶活：2012年已申請(qǐng)專(zhuān)利的應(yīng)國(guó)清等[24]利用類(lèi)芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶活力為53.72 U/mL;2014年馬芮萍等[12]分離的Stenotrophomonas sp. NTa.，經(jīng)過(guò)改良優(yōu)化后的瓊膠酶活力僅有1.98 U/mL;2017年由張建美等[25]對(duì)篩選獲得的產(chǎn)瓊膠酶菌株Vibrio sp.Ag-1進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，其最高酶活僅為45.51 U/mL;2018年Leema Roseline T等[9]對(duì)分離得到的瓊膠酶菌株Acinetobacter sp. PS12B進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，酶活由1.52 U/mL增加到45.76 U/mL。本研究經(jīng)過(guò)采用改良后的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，酶活達(dá)到了比較高的水平，穩(wěn)定在96 U/mL，這在國(guó)內(nèi)外已報(bào)道瓊膠酶的相關(guān)文獻(xiàn)中屬于較高水平，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。瓊膠酶水解瓊膠得到的產(chǎn)物瓊膠寡糖具有良好的抑菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫、美白保濕等藥理活性，已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。然而，關(guān)于瓊膠寡糖抑菌作用的相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)較少。本試驗(yàn)從海洋龍須菜上分離篩選獲得的瓊膠酶產(chǎn)生海洋細(xì)菌ZXY772的酶解產(chǎn)物具有較為顯著的抑菌活性。相信通過(guò)后續(xù)優(yōu)化其發(fā)酵工藝，可進(jìn)一步提高瓊膠酶產(chǎn)量;同時(shí)對(duì)酶解產(chǎn)物的抑菌、抗氧化能力等應(yīng)用方面深入研究，有望開(kāi)發(fā)應(yīng)用功能性低聚糖瓊膠寡糖。

4? ? 參考文獻(xiàn)

[1] WANG J X，MOU H J，JIANG X L.Biological activities of a neutral water-soluble agar polysaccharide prepared by agarase degradation[J].High Tech Lett，2005，11（4）：415-420.

[2] 吳湛霞，董靜靜，李思東，等.國(guó)內(nèi)江蘺提取瓊膠加工工藝的研究進(jìn)展[J].廣西輕工業(yè)，2010（9）：19-20.

[3] 謝喜珍，謝金盛，楊捷，等.瓊膠寡糖的生物酶解制備工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2017，38（1）：208-213.

[4] KANG N Y，CHOI Y L，CHO Y S，et al.Cloning，expression and charact-erization of a beta-agarase gene from a marine bacterium，Pseudomonas sp. SK38[J].Biotechnology Letters，2003，25（14）：1165-1170.

[5] CHI W J，PARK D Y，SEO Y B，et al. Cloning，expression，and biochem-ical characterization of a novel GH16 β-agarase AgaG1 from Alteromonas sp. GNUM-1[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（10）：4545-4555.

[6] 修爽，賈馨媛，祖國(guó)仁.海洋細(xì)菌Vibrio agarivorans-1產(chǎn)瓊膠酶培養(yǎng)基優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（5）：328-331.

[7] 牟宗娟，李貴陽(yáng)，茅云翔，等.4株瓊膠降解菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶條件分析[J].海洋科學(xué)，2013，37（4）：13-20.

[8] 劉興凱，朱丹，史曉娟，等.產(chǎn)瓊膠酶細(xì)菌Acinetobacter sp. LXK的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，35（1）：57-65.

[9] LEEMA R T，SACHINDRA N M.Purification and characterization of agarase from marine bacteria Acinetobacter sp. PS12B and its use for preparing bioactive hydrolysate from agarophyte red seaweed gracilaria verrucosa[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2018，186（12）：1-19.

[10] ZHANG L，GUO X F，SONG Y Y，et al.Bioadhesive immobilize agarase on magnetic ferriferous by polydopamine[J].Materials Science & Engin-eering，2018（7）：68.

[11] ROSELINE T L，SACHINDRA N M.Characterization of extracellular agarase production by Acinetobacter junii PS12B，isolated from marine sediments[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2016，6：219-226.

[12] 馬芮萍，朱艷冰，倪輝，等.一株產(chǎn)瓊膠酶細(xì)菌的分離、鑒定及其瓊膠酶基本性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào)，2014，54（5）：543-551.

[13] 解卉.產(chǎn)瓊膠酶菌株Agarivorans albus QM38的發(fā)酵條件優(yōu)化、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2009.

[14] 劉麗莉，祖國(guó)仁.新型產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌的篩選和鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（20）：4831-4834.

[15] 李能章，邱榮蓉，彭遠(yuǎn)義.瓊膠酶的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2006（增刊1）：62-66.

[16] 周欽茂，謝燕純，陳彥梅，等.一株高產(chǎn)瓊膠酶海洋細(xì)菌的篩選與鑒定[J].生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（12）：140-146.

[17] 東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[18] 彥繁鶴，周金梅，吳如春.DNS法測(cè)定甘蔗渣中還原糖含量[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2015，36（2）：126-128.

[19] 趙凱，許鵬舉，谷廣燁.3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量的研究[J].食品科學(xué)，2008（8）：534-536.

[20] 方園.纖維素酶在棉織物生物整理中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2013.

[21] TEMUUJIN U，CHI W J，CHANG Y K，et al.Identification ang bioche-mical characterization of Sco3487 from Streptomyces coelicolor A3（2），an exo- and endo-type β-agarase-producing neoagarobiose[J].Journal of Bacteriology，2012，194（1）：142-149.

[22] 韓莎莎.瓊膠酶高產(chǎn)菌株的選育和紅藻寡糖的酶法制備與分析[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2015.

[23] 呂國(guó)強(qiáng).紅藻附生瓊膠降解細(xì)菌的分離鑒定及HQM9瓊膠酶研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2011.

[24] 應(yīng)國(guó)清，唐中秀，梅建鳳，等.產(chǎn)瓊脂酶的類(lèi)芽孢桿菌及其應(yīng)用：中國(guó)：CN 102559547 A[P].2012-07-11.

[25] 張建美，韓堯躍，王國(guó)增，等.海洋弧菌Ag-1產(chǎn)瓊膠酶條件研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2017，17（3）：90-95.