紅裙步甲化學防御研究

郭明磊 柏超 曹杰 劉鵬 韓文鑫 宮立勝 董艷

摘要? ? 本文以紅裙步甲作為試驗昆蟲，初步探究昆蟲的化學防御行為。通過解剖發(fā)現(xiàn)，紅裙步甲的防御腺由分泌腺、貯液囊、反應室和輸出管組成，而且雌雄蟲存在著差異。用二氯甲烷作為萃取劑，采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析其化學防御物質(zhì)成分，獲得21個峰，檢測出18種化學成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅裙步甲防御物質(zhì)主要成分是甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸。

關(guān)鍵詞? ? 紅裙步甲;化學防御;防御腺;防御物質(zhì)

中圖分類號? ? Q964? ? ? ? ?文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）17-0117-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

Abstract? ? In this paper，Carabus augustus were used as experimental insects to explore the chemical defense behavior of insects.Through anatomy，it was found that the defensive gland of the Carabus augustus was composed of the secretory gland，the reservoir，the reaction chamber and the output tube，and there were differences between the male and female.Using dichloromethane as the extractant，the chemical defense component was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS），21 peaks were obtained，and 18 chemical components were detected.The main components of the defensive substance were methacrylic acid and 2 -methyl-2-butenoic acid.

Key words? ? Carabus augustus;chemical defense;defensive gland，defensive substance

昆蟲是所有生物中種類及數(shù)量最多的一群，是動物界中發(fā)展最繁盛的一個類群，目前已命名逾100 萬種，其分布幾乎遍布全球。為了適應各種不同的生活環(huán)境，一些種類成功地進化出較為完善的防御機制。根據(jù)其不同的防御機制，大致可分為隱匿防御、假死和恐嚇防御、機械防御、化學防御以及集群和社會性防御。昆蟲的化學防御是用其自身的特殊結(jié)構(gòu)分泌并釋放化學物質(zhì)以保護自己，是眾多防御類型中最為復雜、效果最佳的一種[1]。

國內(nèi)對昆蟲化學防御物質(zhì)的研究起步較晚，而且多集中在擬步甲科昆蟲的防御結(jié)構(gòu)研究方面，對步甲科昆蟲研究較少。梁永生[2]報道了赤擬谷盜成蟲和幼蟲化學防御物質(zhì)的主要成分以及其成分對成蟲、幼蟲的作用，主要成分是甲醌、1-十五碳烯、1，6-十七碳二烯、芍藥醇，這些成分能夠引誘幼蟲但是對成蟲具有排斥作用。劉 勇等[3]分析了云南琵琶甲（喙尾琵琶甲）防御物質(zhì)的抗菌活性及化學成分，主要成分是1，4-苯醌，對細菌普遍具有抑制作用。任國棟等[4]通過研究34種琵甲屬昆蟲防御腺的結(jié)構(gòu)，探討了其進化關(guān)系;并于2002年根據(jù)琵甲族11屬58種防御腺的結(jié)構(gòu)特征，探討了屬間的進化關(guān)系[5];2009年基于18個代表種的防御腺特征，探討了中國刺甲族的屬級關(guān)系[6]。葉 曄等[7]對141族31屬 50種擬步甲科昆蟲的防御腺結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行了研究。強承魁等[8]研究了黃粉蟲防御物質(zhì)的化學成分和其抑菌活性。羅建蓉等[9]研究了喙尾琵琶甲的化學成分。施貴榮等[10-12]研究了體外防御物質(zhì)的化學成分及其抗菌活性。郭明磊等[13]用氣相色譜-質(zhì)譜分析了喙尾琵琶甲化學防御物質(zhì)的化學成分，并研究了化學防御物質(zhì)的抑菌活性。季莉麗[14]研究表明，廣炮步甲的防御腺化學物質(zhì)有6種，主要成分為甲基對苯二酚、對苯二酚、甲基對苯醌與對苯醌。

步甲的防御腺一般著生于腹部末端。日本科學家Kats-uo等[15]研究部分步甲科昆蟲的防御腺結(jié)構(gòu)，并將其分為三大類六小類（圖1）。圖中A、B、C類型的防御腺主要分泌的防御物質(zhì)是脂肪酸類物質(zhì)，D類型主要分泌甲酚類物質(zhì)，E、F類型主要分泌苯醌類物質(zhì)。Will等[16]報道了Catapiesis bart-yrae和Catapiesis mexicana在電鏡下防御腺的細胞結(jié)構(gòu)。

步甲科昆蟲的化學防御分泌物的化學成分種類復雜，有短鏈有機酸、酮、醛、芳香族化合物以及某些特有的化合物。多種步甲的分泌物是甲酸，Dicaelus屬步甲的化學防御物質(zhì)含有75%的甲酸。曾有人報道過一種步甲Brachinus的臀腺能合成氫酮和過氧化氫等化合物[17]。臭廣肩步甲Calos-oma sycophanta的防御物質(zhì)主要成分是甲基丙烯酸和水楊醛，Carabus ullrichii的防御物質(zhì)主要成分是甲基丙烯酸和當歸酸，Abax parallelepipedus的防御物質(zhì)是甲基丙烯酸和巴豆酸;甲基丙烯酸、巴豆酸和異丁酸在以上3種步甲中存在[18]。邊園步甲Omophrom limbatum、大頭肉步甲Broscus cephalotes 的防御物質(zhì)是2-甲基丙酸和3-甲基丁酸;氣步甲屬 Brach-inus crepilaus化學防御物質(zhì)的主要成分是苯醌、甲基苯醌等。Metrius contractus化學防御物質(zhì)的主要成分是1，4-苯醌、十五烷、（6Z，7Z）-6，9-Heptadecadiene和（7Z，9Z）-7，9-Heptadecadiene[19]。青步甲屬昆蟲Chlaenius cordicollis化學防御物質(zhì)的主要成分是2，5-二甲基苯酚和3-乙基苯酚[20]。粒步甲Carabus granulatus、Carabus intricatus、Carabus auronit-ens、Carabus auratus和Carabus irregularis等步甲屬昆蟲化學防御物質(zhì)的主要化學成分是甲基丙烯酸和巴豆酸（又稱反式丁烯酸、 β-甲基丙烯酸）[21-25]。

紅裙步甲（Carabus augustus）屬于鞘翅目（Coleoptera）肉食亞目（Adephaga）步甲總科（Caraboidea）步甲屬（Carabus），是一種重要的捕食性天敵昆蟲資源，同時也是一種觀賞性昆蟲，主要分布在我國江西一帶，喜食鱗翅目幼蟲、蛹，還可以捕食金龜幼蟲、螻蛄、叩甲卵和幼蟲、蚜蟲等害蟲。目前國內(nèi)還沒有相關(guān)文獻的報道，通過本研究了解紅裙步甲防御結(jié)構(gòu)和分泌物成分，以期為昆蟲化學防御機制的研究及其進一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試昆蟲與儀器

供試昆蟲為紅裙步甲，采自江西省新余大崗山自然保護區(qū)。供試儀器為體視顯微鏡（Carl Zeiss SteREO Discovery.V20，德國卡爾蔡司集團生產(chǎn)）、剖鏡（Leica S6E，德國萊卡）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HP6890GC/5973MS，美國Agilent Techno-logies公司生產(chǎn)）。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 防御腺解剖。參考劉春林[26]的方法，將紅裙步甲的干制標本放于10%氫氧化鈉溶液中煮10 min左右，取出后用清水沖洗干凈，然后用解剖鏡剝離與防御腺無關(guān)的組織獲得防御腺結(jié)構(gòu)。用蒸餾水將其清洗干凈，移入1%伊紅溶液中染色。

1.2.2? ? 防御物質(zhì)GC-MS分析。

（1）化學防御物質(zhì)收集。將紅裙步甲腹部后端放在1.5 mL EP管口，經(jīng)物理刺激，收集由臀腺噴射出的防御物質(zhì)。每管每次收集原液約為200 μL，向其中加入100 μL 二氯甲烷萃取，重復3次。經(jīng)10 000 r/min高速離心10 min。離心后分泌物分為上層水溶性和下層水不溶性2部分，將其水溶性部分吸出，然后將其下層不溶于水的部分置于-20 ℃下玻璃管中保存。同樣方法收集疤步甲Carabus pustulifer和喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera的化學防御分泌物。

（2）GC-MS分析。GC條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）;柱溫為起始溫度40 ℃，程序升溫3 ℃/min至80 ℃，再程序升溫5 ℃/min至260 ℃;柱流量為1.0 mL/min;進樣口溫度250 ℃;柱前壓100 kPa;進樣量1.0 mL;分流比10∶1;載氣為高純氦氣。MS條件：電離方式EI;電子能量70;傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質(zhì)量范圍35～500;采用wiley7n.l標準譜庫檢索定性。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 防御腺

通過解剖，觀察紅裙步甲防御腺的結(jié)構(gòu)，如圖2所示。防御結(jié)構(gòu)著生于腹部最后一節(jié)，由分泌腺、貯液囊、反應室和輸出管組成，分泌腺著生在貯液囊上，防御液可以儲存在貯液囊中，當遇到天敵或者病原菌時，由輸出管噴射而出。雌蟲具有4個貯液囊，反應室上、下、左、右各有1個，其中上、下2個貯液囊較大，左、右較小;雄蟲僅有左、右2個貯液囊。雌蟲位于反應室左、右方向的貯液囊狹長且端部膨大，由一輸出管與反應室連接;位于反應室上、下方向的貯液囊寬大，直接與反應室相連。囊壁上具有花紋和褶皺。

2.2? ? 防御物質(zhì)GC-MC分析

按照試驗方法，測出紅裙步甲的分泌物總離子圖（圖3），得到21個峰;各峰經(jīng)過GC-MS分析得到質(zhì)譜圖，經(jīng)質(zhì)譜庫鑒定，共鑒定出18種成分，如表1所示。結(jié)果表明，所鑒定的18種化學成分占總含量的99.18%。甲基丙烯酸、2-甲基-2-丁烯酸、十八碳烯酰胺以及二十二碳烯酰胺相對含量分別是55.22%、30.40%、3.69%、3.67%，占總含量的92.98%，其中前二者占總含量的85.62%。因此，甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸為主要成分。

另外，將檢測到的各種成分按照類別可以分為烯酸類（包括甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸），占85.62%;胺類（包括十八碳烯酰胺、二十碳烯酰胺、二十二碳烯酰胺、十四酰胺、十六酰胺和十八酰胺），占12.52%;酸類（包括2-甲基丁酸、苯甲酸和十六烷酸），占0.54%;烷類（包括2，6，10，14-四甲基十五烷、十九烷、二十三烷和二十五烷），占0.28%;烯類（包括二十三碳烯和角鯊烯），占0.15%;醛類（僅有壬醛），占0.07%。因此，烯酸類是紅裙步甲化學防御物質(zhì)的主要成分。

3? ? 結(jié)論與討論

3.1? ? 防御腺結(jié)構(gòu)

紅裙步甲雌、雄蟲的防御腺結(jié)構(gòu)不同，雌蟲有貯液囊4 個且貯液囊大，雄蟲僅有2個且貯液囊小。原因可能有2個方面：一是雌蟲有繁殖后代的任務(wù)，需要消耗的能量多、捕食多，同時要防御天敵，因而需要較多的防御液以滿足對食物和能量的需求;二是雄蟲的外生殖器較大，占據(jù)了較大的空間，阻礙了防御結(jié)構(gòu)的生長。另外，紅裙步甲囊壁上具有花紋和褶皺，不僅使得貯液囊的表面積和容積變大，能夠貯存更多的防御液，同時增強了貯液囊的彈性和韌性。

紅裙步甲的防御物質(zhì)主要成分是甲基丙烯酸和2-甲基2-丁烯酸，而Katsuo and Masanori劃分的6個類型分泌的主要物質(zhì)是脂肪酸、甲酚和苯醌類物質(zhì)，分泌物不同防御腺結(jié)構(gòu)存在著差異。說明紅裙步甲的防御腺結(jié)構(gòu)并未在其劃分的類型中。

3.2? ? 防御物質(zhì)化學成分

學者Le■i■等[18]研究發(fā)現(xiàn)，步甲屬Carabus ullrichii的防御物質(zhì)化學成分包含7種，分別是甲基丙烯酸（78.7%）、水楊醛（17.7%）、α-甲基巴豆酸（2.5%）、苯甲酸（0.4%）、異丁酸（0.3%）、丁酸（0.2%）和2-甲基丁酸（0.2%）。在本研究中，紅裙步甲化學防御物質(zhì)的主要成分是甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸，這一結(jié)果與上述結(jié)果既有相同的地方，也有不同之處。相同成分為甲基丙烯酸（55.22%）、2-甲基丁酸（0.13%）和苯甲酸（0.11%），其中甲基丙烯酸均是主要成分;類似成分為2-甲基-2-丁烯酸（30.40%），與α-甲基巴豆酸是同分異構(gòu)體;其余成分是兩者不同之處，如本研究中含有十六酰胺（3.23%）、十八碳烯酰胺（3.69%）、二十二碳烯酰胺（3.67%）以及一些長鏈烷類、烯類等化學成分是Le■i■等學者的研究結(jié)果中沒有的，而水楊醛、異丁酸以及丁酸在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)。

3.3? ? 展望

昆蟲化學防御物質(zhì)具有殺滅細菌的作用，如麗蠅蛹集金小蜂的防御素Navidefensin2-2能夠抑制一批革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，可作為抗感染藥物資源[27]。許多蜂類的毒液已經(jīng)進入商品開發(fā)階段，對許多人類疾病有治療作用。在農(nóng)業(yè)部提出“雙減”目標的前提下，可合理利用植物、昆蟲自身的化學防御物質(zhì)來抑制細菌、真菌、昆蟲，以達到減少化學農(nóng)藥使用的目的[28]?，F(xiàn)已知的昆蟲體外物質(zhì)的研究非常少，分離、提純各種防御物質(zhì)可為生化、藥理研究及治療人類疾病提供借鑒，因而此方面的研究前景廣闊。

4? ? 參考文獻

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