HPLC測(cè)定芙蓉散中蘆薈大黃素和大黃酸的含量

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院（100010）莊志宏 吳劍坤

北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所（101300）姜迪 張林華

芙蓉散是北京中醫(yī)醫(yī)院法定制劑，主要成分有芙蓉葉、生大黃、黃芩、黃連、關(guān)黃柏、澤蘭、冰片，具有清熱解毒，消腫止痛的功效[1]。醫(yī)院皮科、外科應(yīng)用治療陽性腫瘍50多年來取得了良好的效果，為了有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，針對(duì)目前執(zhí)行的《北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)程》中芙蓉散只是采用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，本實(shí)驗(yàn)研究采用高效液相法測(cè)定大黃的主要成分蘆薈大黃素、大黃酸的含量，為建立全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 日立L-2000型高效液相色譜儀；D-2000工作站；島津AUW-220D分析天平等。

1.2 樣品與試劑 蘆薈大黃素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110795-201710）；大黃酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110757-201607）；芙蓉散（北京中醫(yī)醫(yī)院提供，批號(hào)：1709015）；乙腈（色譜純，天津市光復(fù)科技有限公司）；純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Diamonsil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈（B）和0.1%磷酸水（A）為流動(dòng)相梯度洗脫，梯度洗脫條件詳見下附表1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)256nm；進(jìn)樣量10μL；理論塔板數(shù)按蘆薈大黃素及大黃酸計(jì)算不低于2500，樣本色譜圖如附圖所示。

附表1 梯度洗脫色譜條件

附表2 芙蓉散中蘆薈大黃素含量測(cè)定結(jié)果

附表3 芙蓉散中大黃酸含量測(cè)定結(jié)果

附表4 正交試驗(yàn)考察因素水平表

附表5 正交試驗(yàn)及結(jié)果（蘆薈大黃素）

附表6 正交試驗(yàn)及結(jié)果（大黃酸）

附表7 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 蘆薈大黃色對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品1.66mg，置于10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆薈大黃素為0.166mg/mL的對(duì)照品溶液。

大黃酸對(duì)照品溶液制備：精密稱取大黃酸對(duì)照品2.06mg，置于50mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得大黃酸為0.0412mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取芙蓉散5g，按照正交試驗(yàn)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行提取，放冷至室溫，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5～25ml容量瓶中，加相應(yīng)溶劑稀釋至刻度。過0.22μm濾膜，作為供試品溶液進(jìn)行HPLC含量測(cè)定。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2、5、10、15、20μL的蘆薈大黃素對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣含量（μg）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到蘆薈大黃素的的回歸方程為Y=589485.6518X+8587.1707；R2=0.9999＞0.999，蘆薈大黃素在0.332～3.32μg范圍內(nèi)與峰面積呈良性線性關(guān)系。分別精密吸取5、10、20、30、40μL的大黃酸對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣含量（μg）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到大黃酸的的回歸方程為Y=1223833.9747X-4130.5549；R2=1.0000＞0.999，大黃酸在0.206～1.648μg范圍內(nèi)與峰面積呈良性線性關(guān)系。

附圖 芙蓉散色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取蘆薈大黃素、大黃酸對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定蘆薈大黃素和大黃酸的峰面積值。計(jì)算蘆薈大黃素及大黃酸的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=5）分別為1.57%、1.00%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取芙蓉散供試品溶液，按上述色譜條件于0、2、4、8、24h進(jìn)樣，結(jié)果，供試品溶液中蘆薈大黃素峰面積的RSD為1.76%（n=5），供試品溶液中大黃酸峰面積的RSD為2.04%（n=5），表明供試品溶液中的蘆薈大黃素、大黃酸成分在室溫放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)含量的同一批號(hào)芙蓉散樣品6份，每份2g，分別加入一定量的蘆薈大黃素和大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別計(jì)算蘆薈大黃素和大黃酸的回收率。蘆薈大黃素的平均回收率為92.36%，RSD為1.95%。大黃酸的平均回收率為95.46%，RSD為1.86%。見附表2、3。

2.8 芙蓉散供試品溶液制備方法考察及結(jié)果

2.8.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察提取方法 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取提取溶劑、溶媒用量、超聲時(shí)間作為考察因素，應(yīng)用L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見附表4。

2.8.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，精密稱取芙蓉散5g，按照正交試驗(yàn)安排提取，放冷至室溫，用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5～25ml容量瓶中，加相應(yīng)溶劑稀釋至刻度。過0.22μm濾膜，作為供試品溶液進(jìn)行HPLC含量測(cè)定。精密吸取各供試品溶液10μL，按照2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見附表5、6。

2.8.3 結(jié)果分析 由極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)蘆薈大黃素、大黃酸含量的影響順序?yàn)锳＞B＞C，即提取溶劑＞溶媒用量＞超聲時(shí)間。故應(yīng)選取A3B3C2為最佳提取方案。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果對(duì)A3B3C2工藝條件重復(fù)3次試驗(yàn)，以驗(yàn)證該提取方法的合理性和穩(wěn)定性，結(jié)果測(cè)定蘆薈大黃素的平均含量為6.41mg/g，RSD=2.17%；大黃酸的平均含量為5.71mg/g，RSD=2.68%。見附表7。

3 討論

芙蓉散方中芙蓉葉具有涼血解毒、消腫止痛作用，生大黃清熱解毒、祛瘀生新，在方中芙蓉葉、生大黃為君藥，黃芩清熱解毒、瀉火燥濕，助君藥清熱解毒。局部用藥可使腫瘍得以消散，即使難以完全消散也可使腫勢(shì)局限，拔膿外出[2]。大黃的主要成分是蘆薈大黃素和大黃酸[3]，本次研究制定的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，以本法測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸的含量可作為芙蓉散的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。