復方九節(jié)茶顆粒微生物限度檢查方法的建立與驗證

廣西桂林市食品藥品檢驗所（541012）覃曉 李夏林

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（530021）王仁生

復方九節(jié)茶顆粒是廣西醫(yī)科大學研制的中藥制劑，處方由腫節(jié)風等三味中藥組成。根據(jù)其給藥途徑、成分和制法，應按《中國藥典》2015年版四部（1107）“非無菌藥品微生物限度標準”附表1口服給藥固體制劑要求進行需氧菌、霉菌和酵母菌數(shù)的測定及控制菌——大腸埃希菌檢查?，F(xiàn)按照《中國藥典》2015年版四部（1105、1106）的有關規(guī)定，建立微生物限度檢查方法并加以驗證。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備 電子天平（METTLER TOLEDO公司）、電熱干燥箱（160～250℃）（上海滬越實驗儀器有限公司滬越科學實驗儀器廠）、高壓蒸汽滅菌鍋（ZEALWAY公司）、生物安全柜（ESCO )、恒溫培養(yǎng)箱（30～35 ℃）(BINDER公司）、生化培養(yǎng)箱（20～25℃）（BINDER公司）、微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)（BIONERIEUX公司）等。

1.2 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；麥康凱液體培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基；MUG培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均來源于北京陸橋技術有限責任公司。

1.3 試劑與試藥

1.3.1 試劑 靛基質(zhì)試劑；0.1%苯扎溴銨溶液（供洗手、擦拭操作臺面用）； 75%乙醇溶液；碘伏溶液。

1.3.2 稀釋劑 0.9%無菌氯化鈉溶液、0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，均自己配制。

1.4 菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26 003]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63 501]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） [CMCC(B) 10 104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC(F) 98 003]，以上菌種均購自中國食品藥品檢定研究院。

附表1 需氧菌總數(shù)常規(guī)法預試驗結果（樣品批號：20170701）

附表2 霉菌和酵母菌總數(shù)常規(guī)法預試驗結果（樣品批號：20170701）

附表3 金黃色葡萄球菌稀釋法預試驗結果（樣品批號：20170701）

附表4 需氧菌計數(shù)方法的驗證試驗結果

附表5 霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證試驗結果

附表6 大腸埃希菌檢查預試驗結果

附表7 大腸埃希菌檢查法驗證試驗結果

附表8 復方九節(jié)茶顆粒微生物限度檢查結果

1.5 樣品 名稱：復方九節(jié)茶顆粒。批號：20170701；20170702；20170703。樣品來源：廣西醫(yī)科大學。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 所用菌種均為第三代。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7天，加人5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的孢子菌懸液。

2.2 供試液的制備 取供試品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，混勻，作為1∶10供試液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的建立及驗證

2.3.1 預試驗 ①試驗組：取上述制備好的供試液9.9ml于滅菌試管中，加入0.1ml的試驗菌液，混勻，使每1ml供試液中含菌量不大于l00cfu，然后取1ml注入平皿中，立即傾注培養(yǎng)基（需氧菌傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，霉菌、酵母菌傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基），每株試驗菌平行制備2個平皿，待凝固后，需氧菌置33℃培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌置25℃培養(yǎng)5天，點計結果。測定結果見附表1～3。②供試品對照組：取制備好的供試液于滅菌試管中，以稀釋液代替菌液同試驗組操作，測定供試品本底菌數(shù)。③菌液對照組：取相應稀釋液替代供試液于滅菌試管中，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。④回收比值計算：試驗組的菌回收比值現(xiàn)行標準規(guī)定，若各試驗菌的回收試驗的回收比值在0.5～2.0范圍內(nèi)，則所采用的方法方可行。⑤ 結果判斷 預試驗結果表明，本品采用平皿法（1ml/皿）時，只有金黃色葡萄球菌試驗組的試驗菌回收比值不在0.5～2.0范圍內(nèi)，因此需氧菌總數(shù)不適合采用平皿法（1ml/皿）測定，霉菌和酵母菌總數(shù)可采用平皿法（1ml/皿）測定。用試驗菌金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）重新做回收試驗，其試驗結果見附表3。

從附表3中的結果看，金黃色葡萄球菌回收比值在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合標準規(guī)定的要求，故可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）作為本品的需氧菌總數(shù)測定是可行的。

2.3.2 需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗證 取3批樣品，對上述預試驗方法進行驗證，結果見附表4、附表5。根據(jù)3次獨立的平行試驗結果表明，各試驗組的試驗菌回收比值均在0.5～2.0，確定本品的需氧菌總數(shù)檢查為采用平皿法（培養(yǎng)基稀釋0.5ml/皿），霉菌和酵母菌總數(shù)檢查為平皿法（1ml/皿）。

2.4 控制菌檢查方法的建立和驗證 供試液的制備同2.2項下；菌液制備同2.1項下。

2.4.1 大腸埃希菌 ①試驗組：取1∶10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時加入不大于100cfu的大腸埃希菌，33℃培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物lml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)48小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)72小時，觀察其菌落形態(tài)。取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落經(jīng)純化后培養(yǎng)物，接種至5mlMUG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；反之，則為MUG陰性。沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈現(xiàn)玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試液本色則為靛基質(zhì)陰性。同時挑取經(jīng)純化后的新鮮培養(yǎng)物制成一定菌液濃度后上微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)進行培養(yǎng)鑒定，概率在85%以上可以接受。試驗結果見附表6。②陽性對照組：取不大于100cfu的大腸埃希菌，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，方法同試驗組。③陰性對照組：以稀釋液代替供試品溶液，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，方法同試驗組。

結果表明，采用常規(guī)法進行大腸埃希菌檢驗，結果可行。

2.4.2 控制菌檢查方法的驗證 取3批樣品對上述預試驗方法進行驗證。結果見附表7。根據(jù)3次獨立的平行試驗結果表明，確定大腸埃希菌檢查方法為常規(guī)法。

3 供試品的微生物限度檢查

取三批供試品，按上述確定的微生物限度檢查法進行檢驗，結果見附表8。

4 結果與討論

4.1 樣品預試驗中，采用平皿法（1ml/皿）反復做了三次，每次金黃色葡萄球的回收比值低于0.5，說明樣品對該菌有輕微的抑制作用，改為培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）降低每個皿中的藥物濃度來降低其抑菌能力以提高回收比值。故本試驗采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）作為該品種需氧菌計數(shù)。

4.2 白色念珠菌及黑曲霉預試驗中，采用平皿法（1ml/皿）回收比值均在0.5～2之間，故可采用平皿法作為該品種霉菌和酵母菌計數(shù)。

4.3 控制菌大腸埃希菌檢查的驗證，結果試驗組及陽性對照組細菌生長良好，陰性對照組未長菌，為確保檢測結果的可靠性，用2010年版藥典方法及微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)驗證，結果確證檢出的是大腸埃希菌。因此，確認可以采用該方法進行大腸埃希菌檢查。