共無定形體系改善低水溶性藥物達(dá)比加群酯甲磺酸鹽和他達(dá)拉非的溶出行為及穩(wěn)定性

鮑興嘉，陳 鑫，王世茹，凌運妮，張建軍，高 緣*

(1中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 211198；2浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，臺州 318020；3中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198)

共無定形體系是活性藥物成分與小分子物質(zhì)(藥物或輔料)結(jié)合形成的具有單一玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)的單相體系[1]，不同分子間可存在如氫鍵、離子鍵等作用力，如鹽酸魯拉西酮-糖精共無定形、瑞格列奈-糖精共無定形等[2-3]；也可僅是分子狀態(tài)的混溶而無明顯分子間作用力，如辛伐他汀-格列吡嗪共無定形、鹽酸魯拉西酮-瑞格列奈共無定形[4-5]。本課題組前期研究表明，將藥物制成共無定形，與單獨無定形相比，不僅可保持較高的表觀溶解度和溶出度，同時還具有提高物理穩(wěn)定性的潛力[2-3,5-7]。

達(dá)比加群酯甲磺酸鹽(dabigatran etexilate mesylate，DE，圖1)是FDA批準(zhǔn)的首個口服凝血酶抑制劑，具有良好的抗凝療效，顱內(nèi)出血發(fā)生率低，安全性更好[8]。臨床試驗表明DE可替代華法林預(yù)防肺動脈栓塞復(fù)發(fā)[9]。他達(dá)拉非(tadalafil，TD，圖1 )是細(xì)胞中高選擇性磷酸二酯酶5型(phosphodiesterase 5，PDE-5)抑制劑[10]。PDE-5在調(diào)節(jié)肺血管和陰莖海綿體的平滑肌張力中起關(guān)鍵作用[11]。研究表明每日攝入適量TD和前列環(huán)素能有效緩解晚期肺動脈高壓[12]。肺動脈高壓是急性或慢性肺動脈栓塞患者常見的病癥，臨床研究表明口服抗凝劑DE與PDE-5抑制劑TD聯(lián)用具有治療肺動脈栓塞和肺動脈高壓的潛力[13]。根據(jù)BCS分類系統(tǒng)，DE和TD均屬于BCS Ⅱ類藥物[14-16]，溶解度差直接影響其在生物體內(nèi)的口服吸收。因此本研究將通過共無定形技術(shù)將兩者制備成共無定形物，以提高其溶出度，同時考察了其穩(wěn)定性，并與其無定形物進(jìn)行比較。

Figure1 Chemical structures of dabigatran etexilate mesylate (DE) and tadalafil (TD )

1 材 料

1.1 試藥和試劑

達(dá)比加群酯甲磺酸鹽(批號：201705003，常州遠(yuǎn)大醫(yī)藥化工有限公司，純度99.7%)；他達(dá)拉非(批號：1501103，浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，純度99.6%)；甲醇與乙腈均為色譜純(上海安普科學(xué)儀器公司)；實驗用水由Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

PM6000偏光顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)；D8 Advance X射線粉末衍射儀(德國布魯克公司)；掃描電子顯微鏡S-3400N Ⅱ(日本日立公司)；DSC 204 F1 Phoenix差示掃描熱分析儀(德國耐馳公司)；Pyris 1 TGA熱重分析儀(美國鉑金埃爾默公司)；Nicolet Impact 410型紅外光譜儀(美國賽默飛世爾公司)；RC-806溶出儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；LC-2010A HT型高效液相色譜儀(日本島津公司)，配備DAD二極管陣列檢測器、四元泵、自動進(jìn)樣器、LC-solution色譜工作站。

2 方 法

2.1 樣品的制備

稱取DE原料藥500 mg至100 mL茄形瓶中，加入甲醇10 mL和乙腈25 mL，室溫超聲溶解。50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到淡黃色泡沫狀DE旋蒸產(chǎn)物，將所得旋蒸產(chǎn)物置于25 ℃真空干燥箱中干燥24 h，過100目篩備用。同樣方法處理TD原料，得到TD旋蒸產(chǎn)物。

稱取DE原料藥約1 448 mg、TD原料藥(均過100目篩處理)約778.8 mg(物質(zhì)的量比1∶1)至250 mL燒杯中，加入甲醇40 mL和乙腈100 mL，室溫超聲溶解。轉(zhuǎn)移至茄形瓶，50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到淡黃色泡沫狀DE-TD共旋蒸產(chǎn)物，置于25 ℃真空干燥箱中真空干燥24 h，過100目篩備用。

根據(jù)本課題組前期研究[17]，可通過溶劑體系調(diào)整制備獲得TD無定形產(chǎn)物。稱取TD原料藥約200 mg至100 mL茄形瓶中，加入甲醇20 mL、乙腈25 mL和二氯甲烷25 mL，室溫超聲溶解。45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到TD無定形旋蒸產(chǎn)物，置于25 ℃真空干燥箱中真空干燥24 h，過100目篩備用。

將DE原料藥與TD原料藥分別過100目篩后，按物質(zhì)的量比(1∶1)手工三維混合制備晶體物理混合物。

2.2 共無定形分子水平相互作用的理論分析

Hildebrand溶解度參數(shù)(δ)[18]可預(yù)測小分子藥物和載體的相容性，推測分子相互作用。一般而言，兩物質(zhì)間的溶解度參數(shù)差(Δδ)<7.0 MPa1/2時易混溶[19]。公式如(1)所示E、V分別代表分子中各基團(tuán)能量和體積的總和。

δ=(E/V)1/2

(1)

根據(jù)Fedors提出的優(yōu)化基團(tuán)貢獻(xiàn)法[20]，將DE和TD分子拆分為若干原子或基團(tuán)，計算單原子或基團(tuán)內(nèi)聚能和摩爾體積的比值獲得δ。

Hansen溶解度參數(shù)是在Hildebrand溶解度參數(shù)的基礎(chǔ)上又考慮了分子間的3種相互作用(即色散力、極性力和氫鍵作用力)?？?cè)芙舛葏?shù)(δt)與色散溶解度參數(shù)(δd)、極性溶解度參數(shù)(δp)氫鍵溶解度參數(shù)(δh)的關(guān)系如公式(2)。

δt=δd+δt+δh

(2)

3種溶解度參數(shù)又分別由公式(3)～(5)求得(其中i是分子內(nèi)的結(jié)構(gòu)基團(tuán)，F(xiàn)di是對色散力的貢獻(xiàn)，F(xiàn)pi是對極性力的貢獻(xiàn)，F(xiàn)hi是對氫鍵能的貢獻(xiàn)，Vi是對摩爾體積的貢獻(xiàn))。

(3)

(4)

(5)

(6)

2.3 物理化學(xué)表征

2.3.1 偏振光顯微鏡(polarizing microscope，PLM) 將DE晶體、TD晶體、旋蒸制備的DE無定形、TD旋蒸產(chǎn)物和旋蒸制備DE-TD共無定形均勻灑在載玻片上，滴加液體石蠟，并適當(dāng)分散，在偏光顯微鏡觀察，圖像信息用D3K-MS軟件采集。

2.3.2 X射線粉末衍射法(X-ray powder diffractograms，PXRD) 使用D8 Advance X射線衍射儀Cu-Kα靶測定。掃描范圍3～40 °，波長為1.540 6 ?，掃描速度4(°)/min，管壓40 kV，管流40 mA，步長0.02°，步時0.30 s。

2.3.3 差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC) 取DE晶體、TD晶體、DE無定形、DE-TD晶體混合物和DE-TD共無定形各3～5 mg置于坩堝內(nèi)，升溫速率10 ℃/min，掃描范圍為30～340 ℃，數(shù)據(jù)用Netzsch-Proteus熱分析軟件(Version 4.2)處理。

2.3.4 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM) 將少量DE晶體、TD晶體、DE無定形和DE-TD共無定形分散灑于載物盤膠帶上，并在其邊緣位置滴加導(dǎo)電銀漿，給藥物細(xì)粉蒸涂一層重金屬導(dǎo)電膜，抽真空后用掃描電子顯微鏡慢速掃描，加速電壓為20 kV。

2.3.5 熱重分析(thermal gravity analysis，TGA) 將DE晶體、TD晶體、DE無定形、DE-TD晶體混合物和DE-TD共無定形置于鋁制樣品池中，升溫速率10 ℃/min，溫度范圍為30～340 ℃，數(shù)據(jù)用PerkinElmer Thermal Analysis軟件處理。

2.3.6 傅里葉紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR) 將DE晶體、TD晶體、DE無定形、DE-TD物理混合物及DE-TD共無定形與KBr壓片，紅外光譜掃描范圍為4 000～400 cm-1，數(shù)據(jù)用Nicolet Omnic紅外光譜軟件(Version 8.0)處理。

2.4 HPLC分析方法

色譜柱：Ultimate LP-C8柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測波長：291 nm；流動相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(pH 3.0)(50∶50)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.5 溶出度

2.5.1 特性溶出速率(intrinsic dissolution rate，IDR) 特性溶出速率[23]反映藥物固有的溶出行為，它可能與藥物在體內(nèi)藥物動力學(xué)有關(guān)[24]。依據(jù)文獻(xiàn)[23]，分別稱取樣品各300 mg，使用Carver液壓機(jī)將其壓制成致密規(guī)整的圓片，直徑13 mm。依照《中華人民共和國藥典》(2015年版)通則0931第二法(大杯法)裝置，溶出介質(zhì)為0.5%十二烷基硫酸鈉水溶液1 000 mL，轉(zhuǎn)速50 r/min，溫度37 ℃。分別于5、10、15、30、45、60、90、120、180 min 取樣3 mL，并及時補液3 mL。樣品微孔濾膜過濾，HPLC測定樣品濃度，計算IDR[5,25]。

2.5.2 過飽和粉末溶出 依照小杯法[《中華人民共和國藥典》(2015年版)通則0931第三法]測定藥物的過飽和溶出曲線。溶出介質(zhì)為pH 5.5磷酸鹽緩沖液。過飽和溶出試驗中，溶出介質(zhì)體積為100 mL，溫度37.0 ℃，攪拌速度100 r/min。稱取過量上述樣品粉末，投入介質(zhì)中，在0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、24 h取樣，每次取樣3 mL，并及時補液3 mL。樣品微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液適當(dāng)稀釋，HPLC測定樣品濃度。

2.6 吸濕及引濕性質(zhì)

2.6.1 引濕性 照《中華人民共和國藥典》2015年版通則9103——藥物引濕性試驗指導(dǎo)原則，取干燥具塞玻璃稱量瓶數(shù)個，于試驗前1天置于下部盛有(NH4)2SO4飽和溶液的恒溫干燥器(25±1 ℃)中，24 h后精密稱重m1。取各樣品粉末適量，分別平鋪于上述稱量瓶內(nèi)，精密稱重m2。將稱量瓶敞口，與瓶蓋一同置于上述恒溫恒濕條件下24 h，封蓋，精密稱重m3。各組實驗平行測定3份，計算吸濕增重百分?jǐn)?shù)。

2.6.2 動態(tài)吸濕性 按“2.6.1”項下方法，分別稱取各樣品適量，分散鋪在稱量瓶m1中，精密稱重m2。將稱量瓶敞口，分別放在盛有KOH(8%RH)、K2CO3(43%RH)、NaNO2(65%RH)、NaCl(75%RH)、KCl(85%RH)、KNO3(92.5%RH)飽和溶液的恒溫恒濕器內(nèi)，平衡24 h，精密稱重m3，計算吸濕增重百分?jǐn)?shù)。

2.7 物理穩(wěn)定性

2.7.1 影響因素試驗 參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)通則9001——原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則，取DE無定形及DE-TD共無定形樣品適量，分別置于扁形稱量瓶中，放置于40 ℃干燥箱、60 ℃干燥箱、75%RH恒濕器皿(25 ℃)、92.5%RH恒濕器皿(25 ℃)以及(4 500±500) lx的光照箱中放樣10、30 d后取出，PXRD進(jìn)行分析。

2.7.2 長期/加速試驗 分別稱取DE無定形及DE-TD共無定形樣品適量，放置于25 ℃/60%RH恒溫恒濕箱、40 ℃/75%RH恒溫恒濕箱中放樣30、90 d后取出樣品，觀察DE無定形及DE-TD共無定形的形態(tài)變化(相同制備條件無法獲得TD的無定形，故未進(jìn)行比較)，并通過PXRD分析，測定不同放樣環(huán)境下兩者的物理穩(wěn)定性。

2.7.3 壓力穩(wěn)定性 稱取DE無定形和DE-TD共無定形樣品適量，用Carver液壓機(jī)壓制系列梯度硬度的致密規(guī)整藥片，施加壓力范圍為74～665 MPa，并維持10 s，沖頭直徑為13 mm。分別測定不同壓力下片子的偏光顯微鏡圖像及片劑硬度，考察樣品壓力下是否發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶解度參數(shù)的預(yù)測

3.2 固態(tài)表征

3.2.1 偏振光顯微鏡分析 如圖2所示，偏光顯微鏡視野中可以看見DE晶體(圖2-A)、TD晶體(圖2-B)和TD旋蒸產(chǎn)物(圖2-D)均有明顯的不同形態(tài)的雙折射現(xiàn)象。而DE旋蒸產(chǎn)物(圖2-C)和DE-TD共旋蒸產(chǎn)物(圖2-E)在偏光顯微鏡下呈現(xiàn)不規(guī)則的碎片狀，且無晶體特有的雙折射現(xiàn)象，為無定形態(tài)。

Table1 Calculation of Hildebrand solubility parameter for DE and TD

GroupDEFrequencyCohesiveenergy/(kJ/mol)Molarvolume/(cm3/mol)TDFrequencyCohesiveenergy/(kJ/mol)Molarvolume/(cm3/mol)CH3418.8134.014.733.5CH2944.5144.9314.848.3CH///26.9-2.0=CH417.254.0///=C312.9-16.528.6-11.0O///26.77.6CO2236.036.0///CON129.5-7.7259.0-15.4NH2112.619.2///NH18.44.518.44.5N14.2-9.0///-N=335.215.0///SO3118.851.0///Phenylene(o,m,p)131.952.4131.952.4Phenyl(trisubstituted)131.933.4131.933.4Ringclosure5ormoreatoms22.132.044.264.0Conjugationinringforeachdoublebond46.7-8.835.0-6.6SUM/310.8534.4/182.2208.7

Table2 Calculation of Hansen solubility parameter for DE

GroupFrequencyFdi/(J1/2·cm3/2/mol)Fpi/(J1/2·cm3/2/mol)Fhi/(J/mol)Vm/(cm3/mol)CH34168000134.0CH29243000144.9=CH714000094.5=C535000-27.5CO1290592900200010.8CO227804802001400036.0NH21300193600860019.2NH11604410031004.5N240128000010000-18.0-N=36019200001500015.0O=S=O1112918441641167051.0OH12102500002000010.0Phenylene(o,m,p)1127012100052.4Ring35700048.0Conjugationinringforeachdoublebond4000-8.8SUM/10669661706484370566.0

Table3 Calculation of Hansen solubility parameter for TD

GroupFrequencyFdi/(J1/2·cm3/2/mol)Fpi/(J1/2·cm3/2/mol)Fhi/(J/mol)Vm/(cm3/mol)CH314200033.5CH238100048.3=CH36000040.5CH216000-2=C535000-27.5CO25801185800400021.6O220032000060007.6NH11604410031004.5N240128000010000-18Phenylene(o)1127012100052.4Ring59500080Conjugationinringforeachdoublebond4000-8.8SUM/5540284200023100232.1

Figure2 Polarizing microscope pictures of crystalline DE(A),crystalline TD(B),rotary evaporation product of DE(C),rotary evaporation product of TD(D) and rotary evaporation product of DE-TD(E)

3.2.2 X射線粉末衍射法分析 據(jù)圖3所示，DE晶體衍射峰為3.71°，4.48°，9.06°，9.34°，9.64°，11.04°，17.72°，18.13°，19.96°，21.20°，22.08°，22.90° 2θ。TD晶體特征衍射峰為7.34°，10.68°，12.61°，13.54°，14.59°，15.63°，17.00°，18.50°，21.74°，24.24°和25.07°，與文獻(xiàn)報道一致[26-27]。TD旋蒸產(chǎn)物仍保留TD晶體的特征衍射峰，說明在此條件下無法獲得TD無定形。DE和TD晶體物理混合物則表現(xiàn)為兩晶體譜圖的簡單疊加。而DE旋蒸產(chǎn)物及DE與TD的共旋蒸產(chǎn)物PXRD均呈現(xiàn)彌散衍射環(huán)，表明為無定形態(tài)。

Figure3 X-ray powder diffractograms for crystalline DE(a),crystalline TD(b),amorphous DE(c),evaporation product of TD(d),DE-TD physical mixture(e) and co-evaporation product of DE-TD(f)

3.2.3 差示掃描量熱法分析 由圖4可知，187.2 ℃和302.5 ℃分別為DE晶體與TD晶體的吸熱熔融峰。晶體混合物的DSC圖可觀察到DE晶體吸熱熔融峰(186.6 ℃)，TD晶體的吸熱熔融峰可能被DE晶體300 ℃附近的熱降解放熱峰掩蓋。升溫過程中，DE無定形在71.4 ℃處出現(xiàn)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，沒有出現(xiàn)DE晶體的特征熔融峰。DE-TD共旋蒸產(chǎn)物在119.0 ℃出現(xiàn)單一的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)，結(jié)合偏光顯微鏡無雙折射現(xiàn)象及PXRD無晶體衍射峰，表明減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法獲得的DE-TD共旋蒸產(chǎn)物為共無定形體系，即DE-TD共無定形。Tg-50 K規(guī)則常用來評價Tg溫度以下無定形態(tài)分子有限結(jié)構(gòu)流動性的一個重要參數(shù)[28]，DE-TD共無定形較高的Tg將有利于其物理穩(wěn)定性。

Figure4 Differential scanning calorimetry thermograms for crystalline DE(a),crystalline TD(b),amorphous DE(c),DE-TD physical mixture(d) and coamorphous DE-TD(e)

3.2.4 掃描電子顯微鏡觀察 不同晶體或無定形物固體粉末SEM差異明顯，與偏光顯微鏡觀測到的外觀形態(tài)結(jié)果相對應(yīng)。DE晶體(圖5-A)表現(xiàn)為層層堆疊的簇狀晶體；TD晶體(圖5-B)為長條形的棱柱狀晶體；DE無定形(圖5-C)和DE-TD共無定形(圖5-D)為大小不規(guī)則邊緣鋒利的板塊狀。

Figure5 Scanning electron microscopy pictures of crystalline DE(A),crystalline TD(B),amorphous DE(C) and coamorphous DE-TD(D)

3.2.5 熱重分析法 由圖6可知，DE晶體、TD晶體、DE無定形、DE-TD晶體混合物和DE-TD共無定形在170 ℃以下均未有明顯失重，表明不含溶劑；DE晶體在180～220 ℃可觀察到15.74%的質(zhì)量減失，且隨溫度升高逐步下降，可能是DE晶體吸熱熔融的過程中伴隨著熱降解反應(yīng)的發(fā)生。TD晶體在加熱的過程中質(zhì)量穩(wěn)定，310 ℃之前無質(zhì)量損失。DE無定形、晶體物理混合物和DE-TD共無定形的TGA圖基本與DE晶體一致，170 ℃以上發(fā)生化學(xué)降解。

Figure6 Thermal gravity analysis curves of crystalline DE(a),crystalline TD(b),amorphous DE(c),DE-TD physical mixture(d) and coamorphous DE-TD(e)

3.2.6 傅里葉紅外光譜分析 從圖7中4 000～1 300 cm-1范圍內(nèi)的紅外圖譜特征區(qū)可以看出，DE晶體的芳香仲胺υN-H位于3 261.2 cm-1，脂肪鏈υC-H位于2 931.8 cm-1；酯羰基υC==O為1 734.0 cm-1，1 666.6 cm-1則為與吡啶環(huán)連接的CONR2伸縮振動，酯氨基υC==O為1 646.4 cm-1。TD晶體仲胺υN-H峰位于3 326.8 cm-1，內(nèi)酰胺羰基υC==O位于1 677.3 cm-1，譜帶與官能團(tuán)的對應(yīng)關(guān)系明確，與文獻(xiàn)所述一致[29-30]。與DE晶體相比，DE無定形的芳香仲胺基團(tuán)υN-H從3 261.2 cm-1藍(lán)移至3 294.9 cm-1，說明DE形成無定形物后，分子晶格無序性的增加破壞了原晶體中仲胺形成的氫鍵締合體系。通過改變?nèi)軇w系制備的TD無定形與TD晶體相比，仲胺υN-H峰寬化，表明TD分子間形成氫鍵，同時只有一個羰基伸縮振動峰[17]。DE和TD晶體物理混合物的FTIR光譜為兩者圖譜的綜合疊加。

DE-TD共無定形與單獨DE無定形相比，DE仲胺υN-H從單獨無定形的3 294.9 cm-1紅移至3 286.5 cm-1，而DE脂肪鏈C-H伸縮振動(2 930.7 cm-1)、DE酯羰基伸縮振動(1 732.2 cm-1)未發(fā)生明顯位移；而與TD無定形相比，TD內(nèi)酰胺羰基υC==O峰由1 656.5 cm-1處藍(lán)移至1 661.8 cm-1，因此，DE和TD共旋蒸后形成的共無定形物中DE分子的仲胺N-H官能團(tuán)與TD分子內(nèi)酰胺羰基C==O之間可能形成分子間氫鍵。

Figure7 Fourier transform infrared spectroscopy spectra for crystalline DE (a),crystalline TD (b),amorphous DE (c),amorphous TD (d),DE-TD physical mixture (e) and coamorphous DE-TD (f)

3.3 溶出性質(zhì)研究

3.3.1 特性溶出速率測定 DE晶體、TD晶體、DE無定形、晶體物理混合物及DE-TD共無定形在0.5%十二烷基硫酸鈉水溶液中的特性溶出結(jié)果見圖8。與DE晶體相比，DE無定形的特性溶出速率未有顯著變化，這可能與其在水中轉(zhuǎn)晶有關(guān)[2]；晶體混合物中DE的溶出速率與DE晶體相近，而將DE與TD兩者制備成共無定形后，共無定形中DE的特性溶出速率提高了2.6倍。另一方面，DE-TD共無定形中TD的特性溶出速率斜率為0.025 4 mg·cm-2·min-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TD晶體(0.002 5 mg·cm-2·min-1)和晶體物理混合物(0.006 7 mg·cm-2·min-1)，共無定形同時顯著改善了兩種BCS Ⅱ類藥物DE和TD的溶出速率。

3.3.2 過飽和粉末溶出 無定形態(tài)屬于熱力學(xué)亞穩(wěn)定體系，在溶出過程中可能發(fā)生溶劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)晶現(xiàn)象，使其表觀溶解度恢復(fù)到晶體溶解度水平[5]，甚至也有可能由于進(jìn)入過冷液態(tài)產(chǎn)生凝膠化現(xiàn)象，導(dǎo)致其溶出度比晶態(tài)更低，如無定形鹽酸魯拉西酮[31]。

如圖9所示，DE晶體和晶體物理混合物中DE在PBS 5.5緩沖鹽溶液中的濃度都隨時間的推移緩慢升高，4 h達(dá)到平衡。DE無定形在前0.5 h內(nèi)表現(xiàn)出很高的表觀濃度，隨后濃度迅速下降并逐漸趨近于晶體，這可能與溶劑介導(dǎo)轉(zhuǎn)晶有關(guān)。共無定形中DE在溶出介質(zhì)中快速達(dá)到過飽和狀態(tài)(3倍于DE的平衡溶解度)，并維持至4 h，隨后濃度緩慢下降，在24 h時濃度高于晶體約2倍，呈現(xiàn)出Guzman彈簧-降落傘溶出模式[32]，這可能是由于TD的加入，抑制了DE的晶體成核或晶體生長過程，使DE轉(zhuǎn)晶變慢，維持較高的過飽和度。此外，共無定形中的TD與其晶體相比，也表現(xiàn)出相似的過飽和溶出現(xiàn)象。

Raina等[33]研究了無定形過飽和溶解度對藥物跨膜吸收的影響，發(fā)現(xiàn)過飽和度的維持有助于藥物的滲透吸收。因此，結(jié)合共無定形不僅顯著提高了DE與TD的特性溶出速率，同時可在長時間內(nèi)(至少4 h)維持較高的過飽和度，這將有助于這兩種溶出為限速步驟的BCS Ⅱ類藥物的體內(nèi)吸收，提高其口服生物利用度。

3.4 吸濕及引濕性質(zhì)研究

3.4.1 引濕性 在25 ℃/80%RH條件下TD晶體和晶體混合物的吸濕增重分別為(1.44±0.10)%和(1.81±0.21)%，均介于為0.2%與2%之間，說明兩者略有引濕性。而DE晶體、DE無定形和DE-TD共無定形物在25 ℃/80%RH條件下吸濕增重介于2%和15%之間，分別為(2.04±0.18)%、(5.72±0.07)%和(5.16±0.15)%，表明它們具有一定的引濕性。

3.4.2 動態(tài)吸濕性 DE晶體、TD晶體、DE無定形、晶體物理混合物及DE-TD共無定形物的動態(tài)吸濕曲線見圖10，5種試樣的吸濕量均隨環(huán)境濕度增加而增加，它們的臨界濕度均在80%RH左右。跟晶體藥物相比，其無定形物或共無定形態(tài)的吸濕增量會顯著增加。DE無定形和DE-TD共無定形的吸濕曲線相似，在臨界相對濕度處吸濕量大幅升高，在25 ℃/92.5%RH環(huán)境中吸濕增量分別為(11.70±0.21)%和(10.26±0.08)%，對高濕度環(huán)境敏感，制備及貯存時應(yīng)適當(dāng)控制環(huán)境的溫度和濕度。而DE晶體、TD晶體和晶體物理混合物在不同濕度環(huán)境中吸濕增量均較少，在25 ℃/92.5%RH條件下分別為(2.89±0.17)%、(1.88±0.10)%、(2.99±0.13)%，對環(huán)境濕度不敏感。

3.5 DE-TD共無定形物理穩(wěn)定性研究

3.5.1 影響因素試驗 由圖11可知，DE-TD共無定形在各影響因素條件下放樣后，其PXRD圖譜均呈現(xiàn)彌散狀的衍射環(huán)狀；而DE無定形在75%RH和92.5% RH環(huán)境中放置10 d后已出現(xiàn)DE晶體的特征衍射峰，表明高濕度環(huán)境中DE無定形不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的DE晶體。在高溫(40 ℃、60 ℃)和光照條件下，DE無定形未發(fā)生結(jié)晶現(xiàn)象。無定形態(tài)TD由于在同樣制備條件下無法獲得，故未進(jìn)行考察。

Figure11 PXRD patterns of amorphous DE and coamorphous DE-TD after storage at affecting factors testing

3.5.2 長期/加速穩(wěn)定性研究 如圖12所示，長期試驗條件(25 ℃/60%RH)下，DE無定形放置30 d穩(wěn)定，但放置60 d后出現(xiàn)DE晶體特征衍射峰；加速試驗條件(40 ℃/75%RH)下，DE無定形放置30 d和60 d均檢測到DE晶體特征的衍射峰，且隨著放置時間的增加，衍射峰強(qiáng)度越強(qiáng)。而DE-TD共無定形在長期和加速條件下放置90 d后的PXRD仍呈現(xiàn)彌散狀衍射環(huán)，未發(fā)生晶型轉(zhuǎn)變，具有良好的物理穩(wěn)定性。影響因素實驗中濕度是造成DE無定形轉(zhuǎn)晶的主要原因，當(dāng)DE制備成無定形后，明顯提高了物理穩(wěn)定性。兩種組分的空間位阻效應(yīng)、分子間可能存在的氫鍵和均勻單相系統(tǒng)可能是抑制結(jié)晶，提高共無定形系統(tǒng)物理穩(wěn)定性的內(nèi)在原因[8]。

3.5.3 壓力對DE-TD共無定形的影響 DE無定形在不同壓力下均難以成型，可壓性差。觀察DE無定形在不同壓力下的偏光顯微鏡圖(圖13)可知，壓力從369 MPa開始，DE無定形開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)晶現(xiàn)象。與DE無定形不同，DE-TD共無定形的壓片成型性良好。DE-TD共無定形在不同壓力下的偏光顯微鏡圖如圖14，在(74～517) MPa壓力下偏光顯微鏡下并未觀察到雙折射現(xiàn)象，無晶型轉(zhuǎn)變；壓力為665 MPa時，偏光顯微鏡視野下能觀測到個別微小的雙折射現(xiàn)象，但視野中絕大部分粉末仍是無定形態(tài)，說明DE-TD共無定形僅在高壓力下中發(fā)生了輕微轉(zhuǎn)晶。

Figure12 PXRD patterns of amorphous DE and coamorphous DE-TD under long-term and accelerated testing conditions

Figure13 Polarizing microscope pictures of amorphous DE under different pressures

4 結(jié) 論

本研究采用減壓旋蒸法制備了DE-TD共無定形物，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為119.0 ℃，紅外光譜表明共無定形物中DE分子的仲胺N-H基團(tuán)與TD分子的內(nèi)酰胺羰基 C==O 之間可能形成氫鍵。與DE晶體、TD晶體相比，共無定形物顯著提高了兩者的特性溶出速率，且與DE無定形相比可保持長時間的過飽和度，有利于藥物的吸收。穩(wěn)定性試驗表明所制備的DE-TD共無定形物與DE無定形物相比，在加速條件及壓片過程中具有良好的物理穩(wěn)定性。

Figure14 Polarizing microscope pictures of coamorphous DE-TD under different pressures