帕羅西汀對(duì)Nav1.5通道電流的作用*

王杏芬 尹元立 李彬 李潔 李泱 高永紅

Brugada綜合征(Brugada syndrome, BrS)是一種離子通道功能異常所致的心電疾病，屬于常染色體遺傳，無明顯的心臟結(jié)構(gòu)性異常。BrS分為遺傳性與獲得性兩種，遺傳性BrS已為人們所熟知。研究表明BrS相關(guān)SCN5A功能喪失型突變，導(dǎo)致峰鈉電流降低。

獲得性BrS以藥物誘導(dǎo)性BrS(drug induced BrS, diBrS)最為突出。大量報(bào)道發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥物在治療的同時(shí)可以引起B(yǎng)rS。Goldgran-Toledano等[1]的研究顯示，在98例過量使用抗抑郁藥的患者中，15.3% 呈現(xiàn)BrS樣心電圖，2.4%發(fā)生猝死。選擇性5-羥色胺攝取抑制劑帕羅西汀(paroxetine，Par)同樣使BrS發(fā)生率顯著增加[2]。Bardai等[3]發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥可引起致命性心律失常，特別是在鈉電流降低的情況下更甚?？梢?，抗抑郁藥所致的BrS危害極大，揭示其發(fā)生機(jī)制，對(duì)于防止diBrS發(fā)生，提高藥物安全性尤為重要。筆者通過應(yīng)用膜片鉗技術(shù)探討Par對(duì)Nav1.5通道電流的作用，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1溶液與試劑 胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天門冬氨酸鉀、丙酮酸鈉、MgATP、HEPES、CaCl2、CdCl2、tetrodotoxin(TTX)均為Sigma 公司產(chǎn)品；乙二醇四乙酸(EGTA)購自FlukaBiochemika；DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibico公司；其他試劑均為分析純。

細(xì)胞外液：NaCl 130、CaCl22、 CsCl 5、MgCl21.2、HEPES 10 和glucose 5, CsOH調(diào) pH 至7.4。于細(xì)胞外液加入4-AP 5 mmol/L阻斷瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)。

細(xì)胞內(nèi)液(mmol/L) ：CsC1 100、TEA-Cl 20、EGTA 10、Na2-ATP 5、HEPES 10，CsOH調(diào)pH調(diào)至7.2。

1.2HEK293細(xì)胞培養(yǎng)與pcDNA3.1-SCN5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞(HEK293)系(由南京普若賽公司提供)，取鏡下觀察培養(yǎng)良好的HEK293細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)應(yīng)符合以下條件：①鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)無明顯顆粒和空泡；②培養(yǎng)液清亮，無偏酸或偏堿征象；③相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)液無黑色顆粒和小碎片；④細(xì)胞分布均勻；⑤細(xì)胞邊界清晰；⑥細(xì)胞貼壁生長融合率達(dá)到50%～70%。轉(zhuǎn)染步驟參考試劑盒中說明書，應(yīng)用Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入0.2 μg綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)質(zhì)粒，和含有目的基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，作為陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的指示劑，再根據(jù)質(zhì)粒的濃度加入所需轉(zhuǎn)染的相應(yīng)質(zhì)粒體積目的質(zhì)粒pcDNA3.1-SCN5A-F1473S 0.5 μg(由武漢博士德生物工程有限公司提供)。選取轉(zhuǎn)染后48～72 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率為50% ～ 80%的HEK293細(xì)胞。使用PBS沖洗一次，加入胰酶消化約1 min后，迅速加入培養(yǎng)基終止消化。吹打后以1∶10比例傳至35 mm培養(yǎng)皿，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中5 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，將轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞用于膜片鉗記錄。

1.3藥物及應(yīng)用 Par購于武漢江民華泰醫(yī)藥有限公司，純品呈白色或類白色解的結(jié)晶粉末，分子量為329.37。將Par用二甲基亞砜溶解后制備成儲(chǔ)備液，臨用時(shí)采用細(xì)胞外液稀釋成終濃度10.0 μmol/L。采用局部灌流裝置，于細(xì)胞外采用恒流灌流方式給藥。為確保藥物效應(yīng)的一致性，待穩(wěn)定5 min 后再記錄電流。同時(shí)，將空白溶解Par所需體積的二甲基亞砜溶液加入細(xì)胞外液，沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)電流產(chǎn)生影響。

1.4膜片鉗的形成及電流的記錄 在倒置熒光顯微鏡下，選擇邊緣清楚、表面光滑、呈球形或多邊形，不與其他細(xì)胞連結(jié)且?guī)в芯G色熒光的細(xì)胞。連接Axon-700B膜片鉗放大器與計(jì)算機(jī)。由軟件(pCLAMP10.2) 控制，應(yīng)用Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器采集刺激信號(hào)及電壓輸入信號(hào)。GG-17玻璃毛坯經(jīng)pp-83微電極拉制儀拉制成入液電阻為2.0～5.5 MΩ的電極。調(diào)節(jié)電極尖端移向細(xì)胞表面進(jìn)行封接，快電容補(bǔ)償以消除儀器引入的電容誤差，采用脈沖式方式負(fù)壓吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。在電壓鉗制下記錄電流。為消除細(xì)胞間的誤差，I值以電流密度(pA/pF)表示。串聯(lián)電阻補(bǔ)償90%～95%以消除電壓偏差；應(yīng)用儀器自動(dòng)進(jìn)行約85%～90%慢電容補(bǔ)償。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞破膜后穩(wěn)定2～3 min，再刺激并記錄給藥前的數(shù)據(jù)，其后用藥物灌流5 min并記錄給藥后的數(shù)據(jù)。為避免通道電流的衰減現(xiàn)象(rundown)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，控制在細(xì)胞破膜后30 min內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)在室溫下(22～24 ℃)進(jìn)行。

1.5參數(shù)設(shè)置 INa的峰值電流測(cè)定：保持電位-80 mV，施予-30 mV，50 ms的去極化脈沖，可記錄到快速激活和失活的內(nèi)向電流，該電流被50 μmol/L的TTX阻斷，即為INa。Par對(duì)INa電流作用的濃度依賴性：取藥物儲(chǔ)備液用細(xì)胞外液稀釋至終濃度為1、3、10、30、100 μmol/L等梯度，觀察INa的電流密度改變。并用Hill方程I/I0=1/[1+([C]/IC50)nH]，求算半抑制濃度(IC50)，其中I0和 I為在用藥前后電流幅值，[C]為藥物濃度，nH為Hill 系數(shù)。

INa電流-電壓(I-V)曲線的繪制：保持電位-80 mV，施予50 ms，階躍10 mV，-70 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，求算電流密度。以各電壓下的電流密度與測(cè)試電壓作圖，得電流-電壓曲線。

INa穩(wěn)態(tài)激活曲線繪制：保持電位-80 mV，施予500 ms，階躍為10 mV，-100 mV～+40 mV的系列去極化脈沖，可記錄到INa電流，標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以電流對(duì)各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)激活曲線，并用Boltzmann方程INa/INa,max=1/{1+ exp[(Vm-V1/2)/k]}進(jìn)行曲線擬合求出半激活電壓(V1/2) 和激活曲線斜率(k)。

INa穩(wěn)態(tài)失活曲線繪制：保持電位-80 mV，施予1 000 ms，階躍為10 mV，-140 ～0 mV的系列去極化脈沖在每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至-35 mV，50 ms的測(cè)試脈沖，記錄INa，標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以電流對(duì)各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)失活曲線，并用Boltzmann方程進(jìn)行曲線擬合求出半失活電壓(V1/2) 和失活曲線斜率(k)。

INa中間態(tài)失活曲線：電壓鉗制在-120 mV，條件脈沖：-20 mV，刺激持續(xù)時(shí)間遞增(10，20，50，100，200，400，800，1 600 ms)，間隔20 ms后，測(cè)試脈沖：-20 mV，50 ms。

INa關(guān)閉態(tài)失活曲線：電壓鉗制在-120 mV，條件脈沖：-100 mV，刺激持續(xù)時(shí)間逐漸遞增(10，20，50，100，200，250，400 ms)，測(cè)試脈沖電壓為-20 mV，50 ms。

INa失活后恢復(fù)曲線：采用雙脈沖刺激法，電壓鉗制在-120 mV，條件脈沖和測(cè)試脈沖均為-35 mV，50 ms，兩次脈沖之間的間隔時(shí)間逐漸遞增(20，40，80，160，320，640，1 280 ms)，將測(cè)試脈沖的鈉電流與條件脈沖的鈉電流之比對(duì)相應(yīng)的時(shí)間間隔繪制曲線。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 膜片鉗數(shù)據(jù)由pCLAMP10.4(Molecular Devices)軟件采集提取，輸出得數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 8.5 (OriginLab) 軟件處理，激活曲線及失活曲線用Boltzmann方程擬合，對(duì)恢復(fù)曲線用Exponential方程擬合。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用Student′st檢驗(yàn)，利用SPSS version 17.0，P< 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1Par對(duì)Nav1.5電流密度和I-V曲線的影響 10 μmol/L的Par使Nav1.5峰電流密度明顯降低，在去極化電位為-35 mV時(shí)，Nav1.5峰電流密度從對(duì)照組(-214.3±10.2)pA/pF降至用藥后(-113.4±9.8)pA/pF(n=10,P<0.01)，見圖1A。將終濃度為1、3、10、30、100 μmol/L的Par加入細(xì)胞外液，發(fā)現(xiàn)其對(duì)Nav1.5峰電流的抑制作用呈濃度依賴性，半數(shù)抑制濃度(IC50)為9.4 μmol/L，見圖1B，Hill系數(shù)為0.93。

Nav1.5峰電流I-V曲線顯示，在-40 ～-10 mV的去極化刺激范圍內(nèi)，藥物對(duì)鈉電流抑制增加效應(yīng)，尤其在峰值附近使電流降低更為顯著，見圖2。

A:Par對(duì)鈉電流作用的原始記錄。 B:Par對(duì)鈉電流作用的濃度依賴性

A:Par對(duì)不同電壓串刺激誘發(fā)鈉電流的作用。 B:Par對(duì)鈉電流I-V曲線的作用

2.2Par對(duì)Nav1.5電流穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響 圖3A顯示，INa的穩(wěn)態(tài)激活曲線在應(yīng)用10 μmol/L的Par后基本不變，半激活電壓(V1/2,act)分別為對(duì)照組電流(-34.2±2.5)mV，用藥組為(-36.2±2.1)mV，用藥前后穩(wěn)態(tài)激活曲線的k值變化也不大。

2.3Par對(duì)Nav1.5電流穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 圖3B顯示，應(yīng)用10 μmol/L的Par后，INa電流的穩(wěn)態(tài)失活曲線向超極化方向移動(dòng)，V1/2,inact由(-80.1±4.6)mV移至(-95.6±4.7)mV(n=10,P<0.01)，同時(shí)曲線斜率從(9.8±0.3)mV變?yōu)?-5.1±0.4)mV。提示在相同刺激電壓下，Nav1.5通道穩(wěn)態(tài)失活加速。

2.4Par對(duì)Nav1.5電流中間態(tài)失活的影響 如圖4所示，與對(duì)照組相比，應(yīng)用10 μmol/L的Par后，INa電流的中間態(tài)失活的時(shí)間常數(shù)變化不大，分別為對(duì)照組(523.7±22.4)ms和用藥組(526.0±23.9)ms。提示藥物對(duì)Nav1.5通道中間態(tài)失活的時(shí)間常數(shù)沒有影響。

A:Par對(duì)鈉電流穩(wěn)態(tài)激活的作用。 B:Par對(duì)鈉電流穩(wěn)態(tài)失活曲線的作用

2.5Par對(duì)Nav1.5電流關(guān)閉態(tài)失活的作用 如圖5所示，與對(duì)照組相比，應(yīng)用10 μmol/L的Par后，INa電流關(guān)閉態(tài)失活的時(shí)間常數(shù)明顯縮短，從對(duì)照組的(644.4±21.1)ms縮短至(521.6±15.3)ms(n=10，P<0.01)。說明用藥后Nav1.5通道關(guān)閉態(tài)失活加速。

2.6Par對(duì)Nav1.5通道失活后恢復(fù)曲線的影響 應(yīng)用10 μmol/L的Par后，INa電流的失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)從對(duì)照組的(205.7±13.4)ms延長至(251.1±16.2)ms(n=10，P<0.01)，見圖6。提示藥物使峰電流降低部分來自失活后恢復(fù)時(shí)間延長。

A:Par對(duì)鈉電流關(guān)閉態(tài)失活作用的原始記錄圖。 B:Par對(duì)鈉電流關(guān)閉態(tài)失活動(dòng)力學(xué)的作用

A:Par對(duì)鈉電流失活恢復(fù)作用的原始記錄圖。 B:Par對(duì)鈉電流失活恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的作用

3 討論

鈉離子流是參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位形成的重要離子流，鈉通道激活，鈉離子大量內(nèi)流，形成動(dòng)作電位0相，是心肌細(xì)胞許多生理功能的基礎(chǔ)。鈉電流的異常則導(dǎo)致包括BrS征、長QT綜合征、擴(kuò)張型心肌病、心臟傳導(dǎo)性疾病和早復(fù)極綜合征等多種心血管疾病。藥物致BrS的臨床研究已引起人們廣泛關(guān)注，美國www.brugadadrugs.org新近發(fā)布的警告指出，目前已有多達(dá)60余種藥物可誘發(fā)BrS樣心電圖表現(xiàn)，甚至心源性猝死的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，Par可以明顯降低鈉峰電流，這可能是其引起B(yǎng)rS樣心電圖的離子基礎(chǔ)，這為該藥物誘發(fā)BrS的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)支持。

本研究顯示，在1～100 μmol/L的實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Par對(duì)鈉峰電流抑制效應(yīng)呈現(xiàn)出濃度依賴性，且抑制濃度較低，其IC50為9.4 μmol/L。離子通道主要有靜息態(tài)、激活態(tài)和失活態(tài)三種存在狀態(tài)，其中失活態(tài)對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的興奮性尤為重要。進(jìn)一步，對(duì)于Par導(dǎo)致鈉峰電流降低的通道門控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，藥物引起鈉通道穩(wěn)態(tài)失活左移，關(guān)閉態(tài)失活增加，同時(shí)引起通道失活后恢復(fù)速率減慢，這可能是Par降低鈉峰電流的主要機(jī)制。然而該藥對(duì)通道的穩(wěn)態(tài)激活和中間態(tài)失活影響不大。進(jìn)一步的機(jī)制分析可以看出，Par對(duì)鈉通道的抑制主要作用于鈉通道失活態(tài)，可能由于藥物與失活態(tài)的鈉通道更易結(jié)合，且較低濃度的Par即可使得失活態(tài)通道數(shù)量增加，失活后恢復(fù)減慢，從而使峰鈉電流變小，0相除極速率減緩，繼而引發(fā)心律失常。

Par是一種選擇性 5-HT 再攝取抑制藥(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)，可選擇性地抑制 5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體，拮抗突觸前膜對(duì) 5-HT 的重?cái)z取，從而增加突觸間隙 5-HT 的濃度，增強(qiáng) 5-HT 的功能而發(fā)揮作用[4-5]。Par對(duì) 5-HT 再攝取的抑制作用選擇性更強(qiáng)，對(duì)其他遞質(zhì)和受體作用甚微，與三環(huán)類抗抑郁藥相比，幾乎無鎮(zhèn)靜作用，安全性高[6-7]。適用于各種類型抑郁癥，已成為第一線抗抑郁藥，并成為有心血管病抑郁癥患者的首選。但近幾年有證據(jù)表明，Par通過對(duì)多種離子通道的影響產(chǎn)生一定的心臟毒性作用，例如，Par可抑制G蛋白激活的內(nèi)向整流鉀通道和TREK鉀通道[8-9]。另有研究表明Par可通過抑制Kv1.5通道影響心房動(dòng)作電位復(fù)極化從而引發(fā)惡性心律失常[10]。前期有研究發(fā)現(xiàn)Par能夠抑制鈉電流，而本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Par通過加速通道失活、延緩失活后恢復(fù)時(shí)間來抑制鈉電流峰值，為引發(fā)diBrS、長QT綜合征等心臟毒副作用提供了一種新的研究方向，為預(yù)防及治療疾病發(fā)生提供新的思路。同時(shí)也提示，Par易引發(fā)BrS和長QT綜合征等獲得性惡性心律失常，特別是在多種原因?qū)е骡c電流降低的情況下更甚，鈉通道基因功能喪失性突變或快速心率導(dǎo)致鈉電流降低，可使Par的猝死危險(xiǎn)性現(xiàn)住增加[11]?；颊叻肞ar等抗抑郁藥物期間，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)心電圖和動(dòng)態(tài)心電圖，及早發(fā)現(xiàn)心臟不良事件。一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)立即減量或停用Par，某些患者停藥后心電圖可恢復(fù)至用藥前水平[12]，或者配合使用異丙腎上腺素等藥物可有效預(yù)防和減少該藥引起的心臟毒性[13]。

本實(shí)驗(yàn)在排除其他干擾電流的前提下，僅研究單獨(dú)表達(dá)的SCN5A電流的藥物效應(yīng)。但我們知道心臟電活動(dòng)由多種離子流共同構(gòu)成，因此，本研究存在一定的局限性。

以Par為代表的新型抗抑郁藥依然有誘發(fā)BrS等惡性心律失常的可能性，因此在臨床中應(yīng)注意合理規(guī)范用藥，對(duì)于本身存在心血管疾病或相關(guān)基因突變的患者做到定時(shí)觀察心臟功能變化。進(jìn)一步探究抗抑郁藥誘發(fā)diBrS的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，爭(zhēng)取未來能夠從分子角度評(píng)估抗抑郁藥臨床使用的安全性。