孔道關(guān)鍵氨基酸殘基對電壓門控鉀離子通道Kv2.1和Kv2.2離子選擇性的調(diào)控

劉翠云，胡長龍

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

哺乳動(dòng)物電壓門控鉀離子通道(Kv)由12個(gè)亞家族(Kv1-12)構(gòu)成,包括40個(gè)亞型.它們在膜電位維持以及介導(dǎo)神經(jīng)元和肌肉的興奮性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用,并且與多種神經(jīng)和心血管疾病密切相關(guān)[1-3].從果蠅到脊椎動(dòng)物,電壓門控鉀離子通道的結(jié)構(gòu)高度保守[4].電壓門控鉀離子通道是四聚體結(jié)構(gòu),通過4個(gè)α亞基形成一個(gè)對鉀離子具有選擇性的孔道,每一個(gè)α亞基由6個(gè)跨膜螺旋(S1～S6)構(gòu)成,且S5和S6之間通過P環(huán)連接,它們構(gòu)成螺旋孔以及離子選擇區(qū)域.電壓門控鉀離子通道在去極化時(shí)被打開,隨著去極化時(shí)間的延長,隨后進(jìn)入失活狀態(tài).

電壓門控鉀離子通道的Kv2亞家族包括Kv2.1和Kv2.2兩種亞型,它們對神經(jīng)元電興奮性和膜電位維持起重要的調(diào)控作用[5-6].Kv2.1普遍存在于哺乳動(dòng)物大腦中,它通過控制膜電位的去極化和超極化來調(diào)控神經(jīng)元的興奮性[7-8];Kv2.2主要在前腦基底斜方體的中間核中表達(dá)[9],相比于Kv2.1,它的功能和生物學(xué)作用有待充分的探索.研究表明Kv2.1與多種病理和生理功能有關(guān).例如，Kv2.1可以調(diào)控人體胰島中胰島素的分泌,即促進(jìn)胰島素的胞吐作用,揭示了該通道結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致人體胰島素分泌途徑受損,引發(fā)糖尿病[10-11];正常的衰老過程以及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生伴隨著Kv2.1的氧化[12];Kv2.1可以介導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡[13-14];Kv2.1功能的缺失會(huì)增加阿爾茨海默病小鼠模型中海馬神經(jīng)元的興奮性,最終促成興奮性毒性損傷[15].另外,越來越多的研究表明Kv2.2與睡眠周期的調(diào)控有關(guān)[16];Kv2.2參與胰島對胰島素和生長抑素釋放的調(diào)控[17];對噪音引起的聽力損傷也具有保護(hù)作用[18].Kv2通道的功能與通道失活特性及離子選擇性高度相關(guān).

電壓門控鉀通道有兩種失活類型： N-type和C-type[19].這兩種類型的主要失活機(jī)制是不同的,與N-type有關(guān)的結(jié)構(gòu)域位于胞質(zhì)中的氨基末端,N-type的失活機(jī)制可以用ball-and-chain模型來解釋[20-21].目前認(rèn)為C-type失活與選擇性濾器周圍的構(gòu)象變化以及與其靠近的部分胞外結(jié)構(gòu)有關(guān)[22-25],且在C-type失活的過程中,4個(gè)亞基都會(huì)參與其中,共同協(xié)作,使孔道外口收縮[26].通道所處的離子環(huán)境也會(huì)影響C-type的特性,在哺乳動(dòng)物電壓門控鉀離子通道中細(xì)胞內(nèi)陽離子的種類和濃度可以調(diào)控C-type外向電流失活的速率和幅度[27].在正常的情況下,鉀離子通道可以特異性地允許鉀離子通過,而不允許其他離子通過[28],已有研究結(jié)果表明,Kv通道孔道中的一段保守氨基酸序列-VGYGD-與通道對鉀離子的高度專一選擇性有關(guān),該序列中的V和Y與跨膜區(qū)的W之間的氫鍵和范德華力是調(diào)控的關(guān)鍵[29].Kv通道的失活與離子選擇性高度耦合,從晶體結(jié)構(gòu)上看,Kv2.1和Kv2.2通道中保守序列-VGYGD-中的Y可能與孔道失活相關(guān)結(jié)構(gòu)域中的W之間形成氫鍵.本文通過點(diǎn)突變以及膜片鉗的方法,對這兩個(gè)位點(diǎn)的相互作用對通道離子選擇性的影響進(jìn)行研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果將會(huì)為Kv2家族相關(guān)疾病的治療提供重要的理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎HEK293細(xì)胞,購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海,中國);大鼠Kv2.1(由Kcnb1基因編碼),Kv2.2(由Kcnb2基因編碼)通過酶切位點(diǎn)XhoⅠ和EcoRⅠ連入表達(dá)載體pEGFP-N1.所用質(zhì)粒突變試劑盒QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit購買自Agilent Technologies公司.基因測序及引物合成服務(wù)由上海睿迪生物公司提供.所用轉(zhuǎn)染試劑盒jetPRIME購買自Polyplus公司.

1.2 方法

1.2.1 點(diǎn)突變與質(zhì)粒擴(kuò)增

根據(jù)NCBI上的Kcnb1(NM_013186.1),Kcnb2(NM_054000.2)基因序列分別設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

點(diǎn)突變按照質(zhì)粒突變試劑盒中的步驟進(jìn)行,突變產(chǎn)物通過熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α,挑選單克隆測序,確定測序結(jié)果正確后,大量擴(kuò)增,使用質(zhì)粒中抽試劑盒(由Axygen提供)抽提質(zhì)粒并測濃度.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)液中,置于CO2濃度為5%的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)HEK293細(xì)胞的生長密度達(dá)到60%到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染步驟按轉(zhuǎn)染試劑盒中提供的說明書進(jìn)行,加入的目的質(zhì)粒的量為2μg,轉(zhuǎn)染24h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

表2 實(shí)驗(yàn)所用內(nèi)液/外液配方

1.2.3 電生理記錄

HEK293細(xì)胞的全細(xì)胞電流記錄使用Axon 200B放大器(美國Axon Instruments公司)和pClamp10.2軟件進(jìn)行記錄.記錄電極(德國Brand公司)經(jīng)垂直拉制儀(Narishige公司Model PC-10 Puller)兩步拉制而成,保證電極充滿內(nèi)液后的阻值范圍是4～6MΩ,記錄時(shí)的采樣頻率是10kHz,并以2kHz 濾波器減噪,實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)中所用的內(nèi)外液配方見表2.

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

電流數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)軟件使用Clampfit10.7和Origin8.0;作圖軟件使用PyMOL 2.2和CorelDRAW12.

2 結(jié)果與分析

2.1 Kv2.1關(guān)鍵位點(diǎn)W366的突變改變通道離子選擇性

Kv1.2/Kv2.1的嵌合通道結(jié)構(gòu)(PDB ID： 2R9R)包括S5到S6的跨膜螺旋以及S4到S5的鏈接螺旋結(jié)構(gòu),通道大小被縮減,孔道區(qū)域結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化,使用PyMOL 2.2軟件分析,顯示在該結(jié)構(gòu)中W363和Y373之間存在距離為2.84?的氫鍵(圖1(a));另外,結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究也表明,W366和Y376(Kv2.1的氨基酸編碼)之間可能會(huì)形成氫鍵[30],這組氫鍵很可能影響通道選擇性過濾器的功能,本研究通過實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證了氫鍵的存在.Kv通道亞型眾多,孔道區(qū)域的氨基酸種類高度保守,圖1(b)是本研究涉及的通道亞型及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn).

圖1 W366位點(diǎn)突變對Kv2.1的影響Fig.1 Effect of W366 mutation on Kv2.1

實(shí)驗(yàn)中激活電流的記錄方法為： 將細(xì)胞鉗制于-100mV,以200ms的間隔時(shí)間,從-100mV開始,每次遞增10mV給予去極化刺激直到+40mV.野生型Kv2.1的電流記錄結(jié)果如圖1(c),外向鉀電流在+40mV去極化電壓刺激下可達(dá)到2000pA左右.將W366突變成A,電流記錄結(jié)果如圖1(d),結(jié)果顯示,在同樣的去極化電壓刺激條件下,突變通道的外向鉀電流幾乎消失,出現(xiàn)200pA左右的內(nèi)向電流,說明該位點(diǎn)的突變改變了通道的離子選擇性.由于氨基酸間的氫鍵和氨基酸結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)都可能是造成通道離子選擇性變化的原因,為探究芳香環(huán)結(jié)構(gòu)對通道離子選擇性變化的影響,隨后將W突變成同樣有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的F,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通道依然出現(xiàn)離子選擇性變化(圖1(e)),這說明芳香環(huán)結(jié)構(gòu)不是造成通道離子選擇性變化的原因,而氫鍵的破壞是通道功能發(fā)生變化的主要原因.取不同去極化指令電壓下內(nèi)向電流峰值的均值做I-V曲線(圖1(f)),可得到該內(nèi)向電流是電壓依賴性的,隨著電壓的增大,內(nèi)向電流先增大后減小,當(dāng)刺激電壓是0mV時(shí)電流達(dá)到最大.

2.2 Kv2.2關(guān)鍵位點(diǎn)W374的突變改變通道離子選擇性

將Kv2.2的相同位點(diǎn)突變,激活電流的記錄方法同圖1,野生型Kv2.2的電流記錄結(jié)果如圖2(a),外向鉀電流在+40mV去極化電壓刺激下可達(dá)到4000pA左右.將W374突變成A,電流記錄結(jié)果如圖2(b),結(jié)果顯示,在同樣的去極化電壓刺激條件下,突變通道的外向鉀電流幾乎消失,出現(xiàn)200pA左右的內(nèi)向電流,說明該位點(diǎn)的突變改變了通道的離子選擇性.為探究芳香環(huán)結(jié)構(gòu)對Kv2.2離子選擇性變化的影響,將W374突變成F,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與W374A類似(圖2(c)),說明芳香環(huán)對Kv2.2離子選擇性變化不產(chǎn)生影響,氫鍵的破壞是Kv2.2通道功能變化的主要原因.I-V曲線(圖2(d))表明,突變通道W374A/W374F的內(nèi)向電流也是電壓依賴性的,隨著電壓的增大,電流先增大后減小,電壓為0mV時(shí)電流達(dá)到最大.圖1和圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該位點(diǎn)突變引起的通道離子選擇性變化在Kv2亞家族中具有普遍性.

圖2 W374位點(diǎn)突變對Kv2.2的影響Fig.2 Effect of W374 mutation on Kv2.2

2.3 內(nèi)向電流是鈉離子內(nèi)流產(chǎn)生的

根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用外液配方(見表2)分析可知,外液中的鈉離子和鈣離子內(nèi)流都可以產(chǎn)生內(nèi)向電流,隨后實(shí)驗(yàn)中通過控制外液中的離子種類來確定內(nèi)向電流的組成.激活電流的記錄方法同圖1,取+10mV鉗制電壓下的記錄電流.如圖3(a)～(b)所示,當(dāng)把外液中2.5mmol的鈣離子替換成等濃度的NMDG+,而保持鉀離子和鈉離子濃度不變時(shí),Kv2.1 W366A/W366F內(nèi)向電流相較于對照組沒有顯著性變化,當(dāng)把外液中140mmol的鈉離子替換成等濃度的NMDG+,而保持鉀離子和鈣離子的濃度不變時(shí),內(nèi)向電流消失.這一結(jié)果表明,突變通道Kv2.1 W366A/W366F產(chǎn)生的內(nèi)向電流主要是鈉離子內(nèi)流造成的.突變通道Kv2.2 W374A/W374F在同樣外液條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3(c)～(d)，見第600頁)，也說明通道突變后產(chǎn)生的內(nèi)向電流主要是鈉離子內(nèi)流造成的.

2.4 突變通道對其他一價(jià)陽離子通透性的研究

圖3 不同外液離子條件對內(nèi)向電流的影響Fig.3 The influence of ion condition of external liquid on the inward current

圖4 Kv2.2突變型通道對其他一價(jià)陽離子的通透性Fig.4 The permeability to other univalent cations of Kv2.2 mutant channel

2.5 關(guān)鍵位點(diǎn)Y376,Y384的突變也會(huì)改變通道離子選擇性

如果W363與Y373(Kv1.2/Kv2.1嵌合通道的氨基酸編碼)之間存在氫鍵,則Y376,Y384的突變也會(huì)導(dǎo)致氫鍵的破壞,產(chǎn)生和W366,W374突變相似的現(xiàn)象.實(shí)驗(yàn)中我們將Kv2.1的Y376位點(diǎn)和Kv2.2的Y384位點(diǎn)均突變成F,激活電流的記錄方法同圖1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通道突變后,外向鉀電流消失,出現(xiàn)內(nèi)向電流(圖5(a),(b)).這一結(jié)果表明在在Kv2.1的W366與Y376之間,Kv2.2的W374與Y384之間可能會(huì)形成氫鍵,W366和Y376(Kv2.1的氨基酸編碼)分別對通道功能產(chǎn)生影響.根據(jù)不同去極化電壓指令下內(nèi)向電流峰值的均值做I-V曲線(圖5(c),(d)),可得到Kv2.1和Kv2.2該位點(diǎn)突變產(chǎn)生的內(nèi)向電流也具有電壓依賴性,隨著電壓的增大,內(nèi)向電流先增大后減小,當(dāng)刺激電壓是0mV或10mV時(shí)電流達(dá)到最大.

圖5 Y376F,Y384F突變對Kv2.1和Kv2.2通道功能的影響Fig.5 The influence of the mutation of Y376F, Y384F on the function of the Kv2.1 and Kv2.2 channels

3 討 論

電壓門控鉀離子通道廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞中,參與靜息電位的維持以及動(dòng)作電位的產(chǎn)生,在神經(jīng)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,對電壓門控的鉀離子通道的研究意義深遠(yuǎn).電壓門控鉀離子通道亞型眾多,但是孔道區(qū)域氨基酸的種類在不同物種間保守,本研究主要利用點(diǎn)突變以及膜片鉗記錄的方法對鉀離子通道的孔道區(qū)域的關(guān)鍵保守氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行研究.研究發(fā)現(xiàn),除序列-TVGYG-外,在哺乳動(dòng)物大鼠鉀離子通道Kv2.1和Kv2.2中,W366與Y376(Kv2.1的氨基酸編碼)之間形成的氫鍵也是調(diào)控鉀離子通道離子選擇性的關(guān)鍵,它的破壞使通道失去鉀離子通透能力,而主要通透鈉離子.

TVGYG序列在電壓門控的鉀離子通道中高度保守,也是電壓門控鉀離子通道的特征序列，早期通過點(diǎn)突變以及缺失突變的方法發(fā)現(xiàn)這一序列尤其是GYG序列在Shaker通道的離子選擇性中起著關(guān)鍵性作用[29,36-37].后續(xù)的晶體結(jié)構(gòu)以及計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)的研究從多方面證實(shí)了這一特性序列對電壓門控鉀離子通道離子選擇性的重要性，并進(jìn)一步探討了其影響離子選擇性的作用機(jī)理[38-41].本研究中的突變位點(diǎn)Y376和Y384正是對應(yīng)特征序列TVGYG中的關(guān)鍵Y位點(diǎn),我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下突變通道的離子選擇性發(fā)生顯著改變,進(jìn)一步說明了從果蠅到哺乳動(dòng)物大鼠,Y位點(diǎn)在電壓門控鉀離子通道的離子選擇性中的重要作用.

在非生理?xiàng)l件(內(nèi)液中無K+)下,Shaker通道的突變型W434F會(huì)使通道失活,同時(shí)會(huì)通透鈉離子[42-43].同時(shí)有研究結(jié)果表明,Shaker通道的突變型W435F對通道的失活和離子選擇性不產(chǎn)生影響[44].本研究發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下,Kv2.1孔道關(guān)鍵氨基酸W366(等同于Shaker的W435)和Y376發(fā)生突變后,外向鉀電流消失,說明通道突變后失活.類似于Shaker的突變型通道W434F,Kv2.1失活后也能記錄到電壓敏感性的內(nèi)向鈉電流,與之不同的是該內(nèi)向鈉電流是在生理?xiàng)l件(內(nèi)液中有K+)下記錄到的.Y376F對Kv2.1通道的影響與W366位點(diǎn)突變后的現(xiàn)象相同.通道關(guān)鍵位點(diǎn)突變后的現(xiàn)象在Kv2.1和Kv2.2中具有普遍性.這說明W366和Y376以及W374和Y384之間的氫鍵對哺乳動(dòng)物電壓門控鉀離子通道的失活和離子選擇性的調(diào)控發(fā)揮關(guān)鍵作用.

前人研究表明電壓門控鉀離子通道的C-type失活在結(jié)構(gòu)上與靠近胞外側(cè)選擇性濾器的結(jié)構(gòu)相關(guān)(見前言部分),有研究發(fā)現(xiàn)通道外孔和孔螺旋區(qū)域的氨基酸殘基的相互作用對C-type失活過程中選擇性濾器功能的維持起關(guān)鍵作用[45-46],另外,孔螺旋區(qū)域的氨基酸殘基也可以和選擇性濾器結(jié)構(gòu)相互作用,影響孔道的慢失活[42,45].同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)電壓門控鉀離子通道Shaker和Kv2.1在C-type失活過程中表現(xiàn)為對鉀離子的通透性變?nèi)?對鈉離子的通透性變強(qiáng)[47-48],與本研究的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象相似,Shaker的突變型通道W434,在非生理?xiàng)l件下發(fā)生永久失活及通道離子選擇性的顯著變化[42],本研究中通道的失活及離子選擇性因關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸突變也發(fā)生顯著改變,我們推測在哺乳動(dòng)物大鼠Kv中,決定C-type失活和通道離子選擇性的結(jié)構(gòu)在位置上靠近,功能上相偶聯(lián),具體的機(jī)理有待于進(jìn)一步的探索.

本研究中關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的突變很可能會(huì)引起選擇性過濾器結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和構(gòu)象的變化.已有研究發(fā)現(xiàn),在Kv通道C-type失活過程中選擇性濾器及其胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化會(huì)影響離子的通透[46],鏈霉菌鉀離子通道KcsA選擇性濾器結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)影響離子的通透[49-50].Kv2.1和Kv2.2孔道區(qū)域關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的突變使原有氫鍵破壞，很可能降低孔道區(qū)域結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或構(gòu)象改變，使通道傾向于通透半徑較小的離子.結(jié)構(gòu)方面微觀層次的變化有待于進(jìn)一步研究.