基于莖環(huán)法的RT-qPCR檢測哺乳動物抗病毒siRNA的表達

李衛(wèi)振，任嚴新，李 楊

(復(fù)旦大學 生命科學學院，上海 200438)

病毒入侵會迅速激活宿主的抗病毒免疫反應(yīng)，被感染的細胞能迅速發(fā)現(xiàn)病毒并作出反應(yīng).RNAi是植物系統(tǒng)性抵御病毒入侵的重要途徑[1].RNAi在進化過程中高度保守，由內(nèi)源或外源雙鏈RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生,能夠高效特異性降解同源mRNA[2]，產(chǎn)生大量長21～23bp的雙鏈小RNA，切割后的siRNA 3′末端往往含有2個堿基的粘性末端[3].RNAi現(xiàn)已被證實在植物、真菌、昆蟲、果蠅等無脊椎生物中廣泛存在[4-6].研究發(fā)現(xiàn)，在已分化的哺乳動物細胞中甚至小鼠中也存在抗病毒RNAi作用[7-9].最新研究發(fā)現(xiàn)，寨卡病毒感染人類神經(jīng)前體細胞能夠產(chǎn)生大量病毒來源的siRNA，證明人類病毒感染能夠有效激發(fā)抗病毒RNAi機制[10].

與植物不同，病毒dsRNA同樣可以非特異性激活哺乳動物的干擾素(IFN)反應(yīng)，IFN反應(yīng)可能會掩蓋或抑制宿主的RNAi抗病毒功能[9,11-12].此外，許多病毒還能夠編碼蛋白抑制宿主的RNAi活動致使不易觀察到RNAi現(xiàn)象[13-15].如野田村病毒NoV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白B2能夠靶向結(jié)合雙鏈RNA(dsRNA)抑制Dicer蛋白切割病毒dsRNA或siRNA組裝進RISC，從而抑制宿主的抗病毒RNAi功能[16-18]，相反，B2蛋白功能缺陷的NoVΔB2感染宿主后能夠引起更明顯的抗病毒RNAi反應(yīng)[7-8].

如今，RNAi已成為哺乳動物特異性抗病毒感染的研究熱點之一[8,10,12,16].攻毒后病毒基因組拷貝數(shù)量、病毒蛋白表達水平或者病毒粒子的裝配水平可以用來評價宿主的抗病毒效果，檢測病毒來源的siRNA也越來越受到重視[19].20世紀90年代，植物學家在植物中偶然發(fā)現(xiàn)RNA沉默現(xiàn)象[20]；1998年Fire等人在線蟲中發(fā)現(xiàn)外源導(dǎo)入的RNA可以抑制線蟲肌肉蛋白的表達[21]；2013年，我們課題組發(fā)現(xiàn)野田村病毒感染哺乳動物細胞后產(chǎn)生大量長度為21～23nt達到可檢測水平的病毒特異性siRNA，最近有研究揭示了人類神經(jīng)前體細胞中的抗病毒RNAi[10]，表明抗病毒RNAi在哺乳動物中可能保守存在[7-8].病毒源siRNA是宿主抗病毒RNAi的小分子標志，同時也是宿主防御機制的特異性決定因素[21].RNAi通過病毒基因組同源序列靶向病毒基因組，引導(dǎo)RISC靶向結(jié)合病毒基因組，由Dicer蛋白特異性切割病毒雙鏈RNA(dsRNA).病毒源siRNA作為宿主抗病毒RNAi切割病毒基因組的標志性產(chǎn)物，既能反映宿主降解病毒基因組的效率[9,22]，還可作為引物合成子代dsRNA，新合成的dsRNA經(jīng)Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而放大RNAi的效應(yīng)[23].以RNAi通路為靶標設(shè)計抗病毒藥物，為病毒性疾病的治療提供了契機.研究表明，當病毒來源小RNA的加工被阻斷時，宿主抵抗病毒感染的能力受到極大削弱[9-24].研究指出，針對CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白基因構(gòu)建的siRNA載體可有效抑制CSFV的復(fù)制，但抗性細胞中siRNA片段的表達檢測制約了RNAi效果的評價[19]，因此亟需建立一種簡單準確的病毒源siRNA檢測方法.

目前檢測宿主抗病毒RNAi反應(yīng)主要依靠小RNA測序技術(shù)或放射性同位素標記，但單個樣本的小RNA測序費用昂貴，且周期較長，尤其是需要進行大規(guī)模樣品測序時花費巨大，對經(jīng)費相對有限的課題組是個不小的挑戰(zhàn).放射性同位素標記實驗雖然方法簡便，靈敏度高，但容易對人體造成輻射損傷，對安全性要求極高.而國內(nèi)相關(guān)法律法規(guī)還不成熟，同時大多數(shù)實驗室并不具備相關(guān)實驗條件與資質(zhì)，可操作性差.因此尋找比較經(jīng)濟的病毒源siRNA檢測的可替代方案或在測序前對宿主體內(nèi)病毒源siRNA進行有效監(jiān)測與評價具有重要研究價值.

目前已有多種小RNA檢測方法，用于檢測小干擾RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)等，而選擇合適的檢測方法是實驗成功的關(guān)鍵.Northern blot是小RNA檢測的重要方法[25]，但特異性小RNA的篩選要求對每種小RNA單獨設(shè)計探針，步驟繁瑣，而且靈敏性有限，樣品需求量大，嚴重制約了小RNA的高通量檢測.熒光定量PCR是基因表達定量分析的金標準，盡管siRNA長度不足是一大挑戰(zhàn)，基于RT-qPCR仍然開發(fā)出多種定量檢測方法，比較常用的有Poly(A)加尾法[26]和莖環(huán)引物法[27].Poly(A)加尾法適用于高通量篩選小RNA，但特異性較差[26]；由于堿基堆積和莖環(huán)結(jié)構(gòu)造成的空間約束，莖環(huán)引物相較于線性引物更耐高溫，特異性和靈敏度也更高[27].TaqMan miRNA矩陣分析可特異性識別成熟的miRNA而不受其前體干擾，準確區(qū)分高度同源的小RNA，甚至可精確分辨單個核苷酸的差別[28].Cheng等成功開發(fā)出可用于定量檢測人工合成的未經(jīng)修飾或有限修飾的siRNA的操作系統(tǒng)以評估外源siRNA在細胞系或小鼠體內(nèi)的傳遞效率與分布特征[27]，但仍未有設(shè)計莖環(huán)狀引物在哺乳動物體內(nèi)或細胞水平特異性檢測病毒源siRNA方面的研究.

在前期研究中，我們曾對PR8ΔNS1感染的293T細胞及NoVΔB2感染的乳鼠RNA樣品進行小RNA測序，構(gòu)建了比較完備的病毒源siRNA文庫[8,15].在本研究中，我們從PR8ΔNS1病毒來源的siRNA文庫[15]中選取2個豐度最高的病毒源siRNA，分別來自NS1片段的正鏈和負鏈(16768和3280)，同時從NoVΔB2來源的siRNA文庫[8]中選取8個siRNAs進行篩選.發(fā)現(xiàn)莖環(huán)法RT-qPCR檢測小鼠病毒源(流感病毒和野田村病毒)siRNA簡單方便，易于操作，可以特異性檢測病毒源siRNA的豐度，兼具較高的準確性與靈敏度，可以為哺乳動物抗病毒RNAi效價評估提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞(293T)為本實驗室保存，Balb/c小鼠購買自上海斯萊克實驗動物有限公司.RNAi抑制子缺陷的流感病毒(PR8ΔNS1)和野田村病毒(NoVΔB2)為實驗室自有[17,29].T載體(pMD20)購買自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司(Takara中國)，大腸桿菌感受態(tài)購買自上海唯地生物技術(shù)有限公司，DMEM(Gibco)、PBS(Gibco)與TRIzol裂解液(Ambion)購買自Thermo公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買自Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑盒購買自Bio Rad公司.

1.2 細胞培養(yǎng)與病毒感染

293T細胞使用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10%胎牛血清(FBS)及1%的青霉素-鏈霉素雙抗，于CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng).

鋪板24h后待細胞密度達到80%左右時感染PR8ΔNS1.感染前棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用3mL PBS沖洗一遍；棄去PBS后加入3mL不完全培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS),并加入100μL PR8ΔNS1病毒[15]；37℃ 培養(yǎng)1h后補加3mL完全培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)；細胞培養(yǎng)24h后收細胞.細胞用1mL TRIzol消化并按說明書提取總RNA，以正常未感染細胞作對照.

1.3 動物感染

新生Balb/c小鼠6～8日齡接種NoVΔB2病毒，腹腔注射(i.p.)50μL，病毒滴度為每組7×106個RNA1片段的拷貝[7]，對照組接種相同體積的PBS.3dpi取乳鼠后腿肌肉組織樣品并提取總RNA.

1.4 內(nèi)參基因的選擇

恰當?shù)臉藴驶椒ㄊ腔虮磉_定量分析的關(guān)鍵.本研究參考相關(guān)文獻確定3個候選內(nèi)參基因： β-actin,miR-191-3p和miR-103a-3p.其中β-actin是常用內(nèi)參基因，線性引物擴增產(chǎn)物約200bp.Peltier等發(fā)現(xiàn)miR-191-3p和miR-103a-3p在13種正常組織和5對不同的腫瘤/正常鄰近組織中的表達高度一致，在統(tǒng)計學上優(yōu)于常用的參考基因[30]，因此作為候選參考基因之一.miR-191-3p和miR-103a-3p僅22bp，因此設(shè)計莖環(huán)狀引物以便于反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)擴增，引物序列見表1.

表1 siRNA及引物序列

(續(xù)表)

1.5 特異性病毒源siRNA的選擇

選取293T細胞抗PR8ΔNS1感染產(chǎn)生的表達豐度較高的2個病毒源siRNAs片段(16768和3280)[15]，其中16768來自NS1片段的正鏈，3280來自NS1負鏈RNA.同樣選取Balb/c乳鼠感染NoVΔB2后病毒源siRNA片段，包括不同豐度的小RNA，共8個siRNAs片段[8].

1.6 引物設(shè)計與合成

參考Cheng等方法[28]針對PR8ΔNS1和NoVΔB2來源的siRNAs設(shè)計引物： 首先，反轉(zhuǎn)錄引物由兩部分構(gòu)成，5′端為通用的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，序列為(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGAC)，3′端由與siRNA反向互補的序列組成，與siRNA互補配對的寡核苷酸數(shù)量為6nt(表1).其次，RT-qPCR下游引物為莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的保守序列，引物序列為GTGCAGGGTCCGAGGT；上游引物分為兩部分： 引物3′端為病毒siRNA同源序列，5′端為隨機序列(表1)，隨機序列用于平衡上下游引物退火溫度.所用引物均由擎科生物技術(shù)有限公司合成.

1.7 莖環(huán)法RT-PCR檢測病毒來源的siRNAs

圖1 莖環(huán)法實時熒光定量檢測vsiRNA流程圖(參考文獻[28])Fig.1 Schematic depiction of the protocol for the quantification of vsiRNA by stem-loop primer (Reference from paper[28])

參考文獻[28]設(shè)計實驗方案，病毒來源的siRNAs的檢測采取兩步法.首先，特異性莖環(huán)狀引物與病毒源siRNA退火并反轉(zhuǎn)錄，然后使用病毒源siRNA特異性的上下游引物擴增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(圖1).

1.8 總RNA反轉(zhuǎn)錄

將提取的293T及乳鼠后腿組織總RNA稀釋至1μg/μL，特異性反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參基因與病毒源siRNA.

反轉(zhuǎn)錄體系為： 1μL莖環(huán)引物(2pmol/μL)，1μL RNA模板(1μg/μL),1μL dNTPs(10mM),4μL 5×First-strand Buffer,1μL DTT(0.1M),0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶(200units/μL)，用無酶水補至20μL.

反應(yīng)條件為： 反應(yīng)體系混合均勻，85℃變性5min，16℃退火30min，50℃反轉(zhuǎn)錄30min，70℃ 15min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶，最后4℃保存.同時每組反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)無反轉(zhuǎn)錄酶組作對照，用無酶水補足反應(yīng)體系.

1.9 熒光定量檢測

取上游反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，作為RT-qPCR模板置于冰上.實時熒光定量體系為20μL，其中SYBR Green Supermix(2×)10μL，上下游引物分別0.5μL，無酶水7μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL.RT-qPCR每組3個重復(fù)，加內(nèi)參作對照，同時每組設(shè)無模板對照組.

1.10 PCR擴增目的基因，載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

PCR反應(yīng)體系為： Takara Ex Taq酶0.25μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，4μL dNTPs(10mmol/L)，上下游引物各2μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物100ng，用無酶水補足至50μL.

反應(yīng)條件為： 反應(yīng)體系混合均勻后98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，36個循環(huán).PCR擴增產(chǎn)物核酸膠電泳鑒定，目的片段連接T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞.感受態(tài)細胞經(jīng)涂板、過夜培養(yǎng)后挑單克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒、送測序.

2 結(jié)果與分析

表2 RNA質(zhì)量檢測

2.1 RNA質(zhì)量檢測

收取PR8ΔNS1感染24h和未感染的293T細胞，NoVΔB2感染和未感染組Balb/c乳鼠第3天收取乳鼠后腿肌肉組織，利用TRIzol法抽提細胞RNA并檢測RNA質(zhì)量.檢測結(jié)果表明，病毒感染組與對照組所提取得RNA樣品純度較高，A260/A280在2.0左右，表明蛋白污染較少；部分樣品A260/A230較小(293T mock)，表明該樣品RNA中可能含有少量有機試劑殘留.

2.2 內(nèi)參基因的選擇

以提取的總RNA為模板，加入特異性莖環(huán)狀引物反轉(zhuǎn)錄候選內(nèi)參基因，取稀釋10倍后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行RT-qPCR，結(jié)果如圖2所示.

PR8ΔNS1感染293T組miR-191-3p的Ct值為31.5左右，與對照組Ct值差異極顯著(22.2)，因此不適合作為內(nèi)參基因；而β-Actin的Ct值為22.5左右，與對照組ΔCt為2.1；miR-103a-3p的Ct值為24.5，ΔCt小于1(圖2(a)).考慮到miR-103a-3p長22nt，與病毒源siRNA的特征更加相似，因此選擇miR-103a-3p作為內(nèi)參基因檢測PR8ΔNS1來源的siRNA.

NoVΔB2感染乳鼠組miR-191-3p,miR-103a-3p和β-Actin的絕對Ct值分別為24.7,25.9和23.5左右.感染組與對照組相比，miR-191-3p的Ct值無顯著性差異(P=0.43)；miR-103a-3p和β-Actin的Ct值雖然差異顯著，但ΔCt均在1左右(圖2(b)).本研究優(yōu)先選擇miR-191-3p作為內(nèi)參基因.

圖2 內(nèi)參基因熒光定量結(jié)果Fig.2 RT-qPCR results of reference genes

2.3 熒光定量檢測病毒源siRNA

PR8ΔNS1感染293T細胞24h后提取RNA，以miR-103a-3p為內(nèi)參基因，檢測病毒源siRNA，結(jié)果如圖3所示.與對照組相比，PR8ΔNS1感染組內(nèi)參基因miR-103a-3p ΔCt為0.7；病毒源siRNA的Ct值與表達水平有極顯著性差異(圖3(a)).其中16768的表達水平是對照組的800倍左右，3280表達量是對照組的700倍(圖3(b))，因此16768和3280均可以作為目標基因評價宿主抗病毒RNAi效率.

NoVΔB2感染Balb/c乳鼠3天后收樣提取RNA，以miR-191-3p為內(nèi)參基因，檢測病毒源siRNA，結(jié)果如圖4所示.與對照組相比，NoVΔB2感染組病毒源siRNA 24～45,2841～2862,2807～2828和111～132的絕對Ct值有顯著性差異(圖4(a))，表達水平經(jīng)內(nèi)參基因標準化后24～45有顯著性差異(圖4(b))，因此將24～45作為目標基因評價乳鼠抗病毒RNAi的效率.

圖3 病毒源siRNA熒光定量結(jié)果Fig.3 RT-qPCR results of virus-derived siRNA

圖4 病毒源siRNA熒光定量結(jié)果Fig.4 RT-qPCR results of virus-derived siRNA

2.4 RT-qPCR重復(fù)數(shù)據(jù)的一致性

熒光定量PCR每組3個重復(fù)(部分數(shù)據(jù)，表3)，293T和Balb/c乳鼠的感染組與空白對照組組內(nèi)偏倚較小，所有數(shù)據(jù)的方差均小于0.5，大多數(shù)在0.0至0.2之間，表明數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，結(jié)果一致，該方法穩(wěn)定可靠.293T對照組病毒源特異性小干擾RNA片段3280和16768的平均Ct值分別為40.0和35.1，遠大于感染組Ct值(分別為31.1和26.4)，說明檢測背景低，可通過Ct值的差異有效區(qū)分陰性和陽性結(jié)果，具有很高的特異性.

表3 熒光定量PCR重復(fù)數(shù)據(jù)一致性比較

2.5 PCR擴增病毒源siRNAs

病毒源siRNAs擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測并測序，結(jié)果如圖5所示.未加模板的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及PCR擴增產(chǎn)物無明顯條帶，表明引物未形成引物二聚體或多聚體；反轉(zhuǎn)錄時不加反轉(zhuǎn)錄酶，熒光定量PCR不能擴增出有效條帶，說明RNA樣品中無DNA污染，正常實驗組條帶明亮且單一，無雜帶，引物特異性高(圖5(a)).PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明擴增序列與PR8ΔNS1源的siRNA序列完全一致(圖5(b))，該方法可以用來快速鑒定宿主體內(nèi)的病毒源的siRNA，且具有較高的準確性.

圖5 PCR擴增293T抗PR8ΔNS1 vsiRNAsFig.5 PCR amplify 293T anti-PR8ΔNS1 vsiRNAs

2.6 病毒源siRNA RT-PCR結(jié)果分析

PR8ΔNS1感染組病毒源siRNA 16768和3280絕對Ct值分別為26.4和31.1，即16768基因表達量是3280的32倍(圖3(a))；與對照組相比,16768和3280相對Ct值均為9，根據(jù)內(nèi)參標準化后，基因表達量亦接近1∶1(圖3(b)).而病毒源siRNA文庫數(shù)據(jù)則顯示，16768的豐度是3280的5倍[15]，與RT-PCR結(jié)果有一定差異.

同樣，NoVΔB2感染組病毒源siRNAs 24～45,2841～2862,2807～2828和111～132的絕對Ct值分別為32.0,33.4,34.7,36.2(圖4(a))；與對照組相比，相對Ct值分別為8,3,2,2，基因表達量比值接近于50∶1∶1∶1(圖4(b)).而NoVΔB2的siRNA文庫數(shù)據(jù)則顯示，24～45,2841～2862,2807～2828和111～132的豐度比值接近于160∶40∶1∶1[8],雖然RT-PCR與小RNA測序結(jié)果中病毒源siRNAs豐度存在差異，但總趨勢一致，即高豐度的siRNA標準化后的表達量也比較高.

3 討 論

RNA病毒感染植物、昆蟲、線蟲、哺乳動物等均能激活宿主的RNAi抗病毒功能，宿主識別病毒dsRNA并將其切割成siRNA[31].RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內(nèi).RNAi的效率非常高，少量的雙鏈RNA分子通過宿主的信號級聯(lián)放大效應(yīng)就能引起系統(tǒng)性的RNA干擾，抑制相應(yīng)基因的表達[23].研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA可以越過細胞間的屏障，在不同細胞間遠距離傳遞并維持信號，甚至傳播至整個有機體[32].RNA病毒感染后提取總RNA進行小RNA測序，分析RNA樣品中的小RNA含量、大小及分布特征是否與RNAi產(chǎn)物特征一致，以判斷病毒是否激活了宿主的抗病毒RNAi功能.Northern blot是檢測小RNA片段的重要方法，但哺乳動物切割Nov或流感病毒產(chǎn)生的小RNA片段reads總數(shù)較低.通常，低豐度的小RNA在克隆、RNA印記或陣列分析中往往檢測不到，檢測結(jié)果難以排除假陰性，同時不利于開展大批量小RNA片段的篩選工作.而更為靈敏的放射性同位素標記試驗在國內(nèi)尚未普及，大多數(shù)實驗室也不具備操作條件(本課題組曾在國外應(yīng)用該方法成功檢測到病毒源小RNA).小RNA測序結(jié)果準確，但費用高，周期長，因此選擇siRNA檢測的可替代方案具有重要研究價值.

RT-qPCR是基因表達定量的重要標準[33-34]，但如何設(shè)計實驗方案檢測小RNA是個重大難題.傳統(tǒng)的熒光定量引物對RNA片段長度有一定要求，不能擴增長度過短的RNA片段，如siRNA，miRNA，發(fā)卡RNA(shRNA)，與PIWI相互作用的RNA(piRNA)，重復(fù)相關(guān)小干擾RNA(rasiRNA)等.而莖環(huán)狀引物通過反轉(zhuǎn)錄在小RNA的基礎(chǔ)上添加了數(shù)十個堿基從而解決了病毒源siRNA長度過短的問題.莖環(huán)狀引物的堿基堆積可以有效改善引物的熱穩(wěn)定性，特異性和靈敏度也更高.

恰當?shù)臉藴驶椒ㄊ腔虮磉_定量分析的關(guān)鍵，但常常被忽視.本研究參考相關(guān)文獻確定3個候選內(nèi)參基因，其中β-actin是常用內(nèi)參基因，miR-191-3p和miR-103a-3p則在哺乳動物多種組織或細胞系中穩(wěn)定表達[30].我們發(fā)現(xiàn)293T細胞感染PR8ΔNS1對miR-103a-3p產(chǎn)生的影響基本可控，ΔCt值僅0.67，甚至略優(yōu)于β-actin，因此選擇miR-103a-3p作為內(nèi)參基因檢測PR8ΔNS1感染293T產(chǎn)生的siRNA.NoVΔB2感染Balb/c乳鼠后miR-191-3p的表達未產(chǎn)生顯著性變化(P=0.43)，因此我們選擇miR-191-3p作為內(nèi)參基因檢測NoVΔB2感染Balb/c乳鼠后產(chǎn)生的siRNA.

目前已發(fā)表的相似的研究中，大多通過體外轉(zhuǎn)錄制備病毒源siRNA標準品，繪制標準曲線，建立定量標準曲線Ct值與模板拷貝數(shù)對數(shù)之間的線性關(guān)系，篩選兼具特異性和靈敏度的siRNA[18].本研究采用相對定量技術(shù)，通過將病毒RNA樣品梯度稀釋至1000倍，建立了病毒拷貝數(shù)對數(shù)與Ct值之間良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.9979，擴增效率為95%(數(shù)據(jù)未展示)，表明該系統(tǒng)穩(wěn)定性高，結(jié)果可信.

本實驗針對流感病毒和野田村病毒來源的不同的siRNAs設(shè)計多組莖環(huán)狀引物及上下游引物，檢測病毒源siRNAs，成功篩選出能夠顯著區(qū)分病毒感染組與對照組的siRNAs，可以作為靶基因驗證宿主抗病毒RNAi功能的啟動.由于siRNA和miRNA長度均為21nt左右，且細胞內(nèi)源性有高達數(shù)百種高表達的miRNA，因此，排除宿主細胞對檢測結(jié)果的影響非常必要.在本研究中，所有熒光定量PCR試驗均進行3次重復(fù)，重復(fù)樣品病毒源小RNA的Ct值差異不顯著，ΔCt值趨向一致，偏倚較小.而對照組病毒源特異性小干擾RNA片段均超過35，遠大于感染組vsiRNA的Ct值，表明該體系非特異性擴增低，受小鼠或293T細胞內(nèi)源性miRNA的干擾較小，具有較高的檢測特異性，可通過Ct值的差異有效區(qū)分病毒來源的特異性siRNA.Chiang等[27]應(yīng)用莖環(huán)法設(shè)計了多達100個siRNA檢測體系，結(jié)果94.4%的陰性對照組Ct值在35以上，Ct值在30～35之間的不到5%，而陽性結(jié)果均小于30.可見該體系中細胞miRNA造成的背景影響非常小，并不會干擾目的基因的檢測.293T mock組A260/A230略低于其他組，但實時熒光定量PCR溶解曲線提示只有單一峰，表明該樣品質(zhì)量不會影響熒光定量的檢測.PR8ΔNS1感染293T時，病毒源siRNA 16768和3280基因表達量接近1∶1(圖3(b))，與siRNA測序文庫中的檢測量有一定差異(5∶ 1)[13].這可能是由不同的檢測方法造成的系統(tǒng)誤差.小RNA測序基于第二代測序技術(shù)，易受多種因素影響導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)偏差.反轉(zhuǎn)錄時所用的隨機引物可能會引起前幾位核苷酸的組成具有一定的偏好性；通常序列前端堿基錯誤率較高，而隨著測序序列的延伸，序列末端的錯誤率也大大提升.同樣，經(jīng)內(nèi)參標準化后NoVΔB2感染組病毒源siRNAs中的24～45,2841～2862,2807～2828和111～132的基因表達量比值接近于50∶1∶1∶1(圖4(b))，雖然與小RNA測序結(jié)果中病毒源siRNA豐度有一定差異(160∶ 40∶1∶1)[8]，但趨勢一致，即高豐度的siRNA標準化后的表達量高于低豐度siRNA.測序結(jié)果也證實莖環(huán)法RT-qPCR擴增序列與病毒源siRNA序列完全一致(數(shù)據(jù)未展示)，Cheng等[28]采用Northern blot與基于放射性同位素標記的探針法RT-qPCR檢測miRNA結(jié)果做對比.結(jié)果，基于Northern blot的miRNA分析重復(fù)性低且一致性差，小鼠組織不同miRNA熒光信號強度與Ct值相關(guān)系數(shù)有較大波動(0.751～0.916).此外，由于工作原理的限制，導(dǎo)致Northern blot無法準確區(qū)分同源序列.然而，TaqMan miRNA矩陣分析卻可以特異性識別成熟的miRNA而不受其前體干擾，可以準確區(qū)分高度同源的小RNA，甚至精確分辨單個核苷酸的差別，顯示出該方案優(yōu)異的特異性.在本研究中，我們通過設(shè)計莖環(huán)引物特異性擴增病毒源小RNA取得了較好結(jié)果.該系統(tǒng)可以檢測低豐度的siRNA，siRNA序列經(jīng)測序驗證無誤.RT-qPCR結(jié)果與小RNA序列文庫中病毒源siRNA豐度進行比較，兩種檢測結(jié)果顯示高豐度的siRNA標準化后的表達量高于低豐度siRNA，而豐度值在同一級別的siRNA表達量亦接近1∶1.近年來，有研究[35]針對登革病毒3′端非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和基孔肯雅病毒5′端非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)設(shè)計引物和探針，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)建立定量標準曲線Ct值與病毒拷貝數(shù)的對數(shù)值之間的線性關(guān)系，并將其應(yīng)用至臨床檢測300多份血清標本中病毒來源的RNA片段.結(jié)果顯示，用該方法檢測登革熱患者血清，靈敏度達到100%，特異度89.3%，陽性和陰性預(yù)測值分別為92.1%和100%；基孔肯雅熱患者的靈敏度、特異性及陰、陽性預(yù)測值均達到100%，為早期篩查、鑒別病毒感染提供了重要依據(jù)[35].這一研究與本文研究思路有異曲同工之處.在我們的研究系統(tǒng)中，通過參考病毒siRNA文庫的豐度，病毒特異性RNA片段的選擇更加科學，針對性和特異性更強，表明熒光定量檢測技術(shù)不僅簡單易操作，同時具有較高的特異性和準確性.但該系統(tǒng)是否可以直接應(yīng)用到其他細胞系或哺乳動物組織中還需要更多的研究結(jié)果支持.