玉米須果蔬復(fù)合酵素飲料的研制及其抗氧化活性

寧楚潔，趙倩，謝春陽，林柯

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

目前我國玉米種植面積約2.3×107hm2，玉米須的年產(chǎn)量約為750 萬噸，資源相當(dāng)豐富[1]。玉米須為禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩椎母稍锘ㄖ椭^[2]，富含黃酮、多糖、甾醇、皂苷以及微量元素等多種有效成分，具有抗痛風(fēng)、抗疲勞、降血糖、降血脂、抗糖尿病、抗菌消炎、抗氧化等功效[3]。玉米須黃酮是玉米須的重要活性物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化活性[4-5]。

酵素是指水果或者蔬菜在多種有益菌的自然條件下發(fā)酵產(chǎn)出的含有豐富的酶、多種維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等功能成份的發(fā)酵飲品。酵素可以加速人體內(nèi)生化反應(yīng)，但不會改變生化反應(yīng)的方向和生成產(chǎn)物的性質(zhì)。

微生物酵素是以一種或者多種新鮮水果、蔬菜等為原料，經(jīng)過多種有益菌發(fā)酵產(chǎn)生含有豐富酶、礦物質(zhì)、維生素和次生代謝產(chǎn)物等功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[6]，具有抗氧化、抗菌消炎、潤腸通便、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善消化吸收等保健功能[7]。

當(dāng)今，食用型酵素作為一種新型保健產(chǎn)品在日本已經(jīng)被大眾所認(rèn)同，形成相對較成熟的供應(yīng)鏈及市場。我國部分企業(yè)也開始關(guān)注該類產(chǎn)品的功效和產(chǎn)值，已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)研究和產(chǎn)業(yè)建設(shè)[8-9]。

此外，果蔬酵素種類繁多，但添加植物提取物復(fù)合發(fā)酵的報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)旨在以玉米須黃酮提取液和果蔬混合，采用葡萄酒酵母、乳酸菌和醋酸菌進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵[10]制備玉米須果蔬復(fù)合酵素，產(chǎn)品具有較強(qiáng)抗氧化性，為產(chǎn)品功能性研究的應(yīng)用提供依據(jù)。同時(shí)，本研究增強(qiáng)了復(fù)合酵素飲料的功能性，可促進(jìn)玉米須的加工利用，為今后果蔬酵素高端產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)，并推動中國酵素行業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

西紅柿、蘋果、大豆和玉米須：市售。

1.1.2 菌種

安琪高活性葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌（保加利亞乳桿菌）：北京川秀科技有限公司；醋酸菌：煙臺帝伯仕酵母有限公司。

1.1.3 試劑

MRS 固體培養(yǎng)基、MRS 液體培養(yǎng)基、白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；檸檬酸：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；蘆?。航靼鄄菰瓷锟萍加邢薰荆豢箟难幔嚎ǘ懮藤Q(mào)有限公司；二苯代苦味?；诫拢―PPH）甲醇：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH：北京化工廠；以上均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

HWS 恒溫培養(yǎng)箱：西安唯信檢測設(shè)備有限公司；SW-CJ 超凈工作臺：浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；HQL150C 恒溫?fù)u床：武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；DZTW 電熱恒溫水浴鍋：上海啟前電子科技有限公司；XFH-40CA 型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；752 型紫外光柵分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DR403 型酒精計(jì)：北京杰瑞恒達(dá)科技有限公司；PHS-3C 型酸度計(jì)：深圳市柯達(dá)電子有限公司；FW20TX 型糖度計(jì)：上海天壘儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 原料預(yù)處理

選擇個(gè)體均一、無機(jī)械損傷的蘋果和西紅柿清洗，切塊，用熱水預(yù)煮軟化后與少量浸泡后的黃豆打漿榨汁，得到果蔬原液備用。將玉米須烘干粉碎，稱量20 g 玉米須粉溶于800 mL 水，在70 ℃下提取3 h，過濾，得玉米須黃酮提取液[11]。

1.2.2.2 發(fā)酵基質(zhì)制備

將一定量的玉米須提取液與處理好的果蔬原液進(jìn)行混合，共同置于發(fā)酵瓶中。

1.2.2.3 接種和發(fā)酵

1）將酵母菌和乳酸菌以1 ∶1 的質(zhì)量比進(jìn)行混合，備用。在果蔬原液中接種該混合菌液，密閉置于恒溫箱中發(fā)酵一段時(shí)間后，再添加醋酸菌，搖床發(fā)酵。

2）單因素試驗(yàn)

選取發(fā)酵時(shí)間 30、35、40、45、50 h，發(fā)酵溫度 26、28、30、32、34 ℃以及接種量 1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%為單因素，以總酸含量為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

3）Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)過單因素試驗(yàn)，獲得各個(gè)因素的水平，選用該主要因素和總酸含量作為自變量與響應(yīng)值，采用Box-Behnken 試驗(yàn)方法，獲得響應(yīng)面因素與水平表，對酵素發(fā)酵的條件進(jìn)行優(yōu)化[12]。

4）調(diào)配

將發(fā)酵完成的酵素原液加入一定量的白砂糖和檸檬酸進(jìn)行調(diào)配，以達(dá)到最佳的口感和風(fēng)味。

1.2.3 果蔬酵素總酸的測定

可滴定酸按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》測得。

1.2.4 玉米須黃酮含量的測定

三氯化鋁法[13]測定濾液中黃酮含量。稱取0.010 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用30%乙醇溶解并定容至100 mL 的容量瓶中，制成0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取剛配制好的蘆丁標(biāo)液 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 分別置于50 mL 的容量瓶中，依次編號0～5，用30%乙醇補(bǔ)至10 mL 后，加入0.8 mL 的5%的NaNO2溶液搖勻，靜置 6 min 后再加入 0.8 mL 10%的 Al（NO3）3搖勻，靜置 6 min，加入 10 mL1 mol/L 的 NaOH 溶液，搖勻15 min 后顯色，在510 nm 處測定吸光度，計(jì)算黃酮含量。

1.2.5 DPPH 自由基清除能力的測定

DPPH 自由基清除能力被廣泛的應(yīng)用在評估短時(shí)間內(nèi)的抗氧化活性[14]。不同濃度下的DPPH 自由基清除能力按照添加黃酮提取物組與未添加黃酮提取物組，自然發(fā)酵組與接菌發(fā)酵組酵素所測定的結(jié)果進(jìn)行對比[15]。

準(zhǔn)確移取2 mL 濃度分別為10 %、30 %、50 %、70 %、90%的酵素樣品液于10 mL 的容量瓶中，再向容量瓶中加入2 mL 質(zhì)量濃度為80%的DPPH 乙醇溶液，混合均勻后在21 ℃的條件下靜置30 min，以無水乙醇溶液作為空白對照，在517 nm 處測定樣品的吸光度，記為A1；將體積為2 mL 的DPPH 溶液和體積同為2 mL 的無水乙醇溶液充分混合均勻，測其吸光度，記為A0；將體積為2 mL 的酵素液與體積同為2 mL 的無水乙醇溶液充分混合，測定其吸光度，記為A2，根據(jù)方式計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：A1為2 mL DPPH 乙醇水溶液和 2 mL 酵素樣品液的吸光度；A0為2 mL 酵素液與2 mL 無水乙醇混合溶液的吸光度[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須黃酮含量的試驗(yàn)結(jié)果

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

如圖1 所示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=1.454 6x+0.017 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 7，在0～0.5 mg/mL的范圍內(nèi)符合Lambert-Beer 定律。用紫外測定玉米須黃酮在510 nm 處的吸光度，代入方程進(jìn)行計(jì)算，可知玉米須提取液中黃酮含量為2.15%。

2.2 酵素發(fā)酵條件優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 接種量的確定

在30 ℃下，發(fā)酵時(shí)間為40 h 的條件下進(jìn)行接種量的單因素試驗(yàn)見圖2。

圖2 接種量對酵素總酸含量的影響Fig.2 Effect of inoculum size on total acid content of enzyme

如圖2 所示，隨著接種量的增加，使得活菌基數(shù)增加，導(dǎo)致菌數(shù)快速增加，總酸含量呈上升趨勢，當(dāng)接種量為2.0%時(shí)，達(dá)到最大，隨后開始緩慢下降。接種量太低，導(dǎo)致發(fā)酵緩慢，延長發(fā)酵時(shí)間；接種量太高，不僅總酸度變化不大，還增加成本。所以，綜上所述，選用2.0%作為最佳的接種量。

2.2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的確定

接種2%的混合菌液，在30 ℃下進(jìn)行發(fā)酵時(shí)間的單因素試驗(yàn)見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對酵素總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid content of enzyme

如圖3 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酵素的總酸含量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為40 h 時(shí)，總酸含量達(dá)到最大值，隨后趨于平緩[17]，這是由于發(fā)酵初期菌種繁殖，并大量產(chǎn)酸，而發(fā)酵后期菌種沉積于底部，次級代謝產(chǎn)物大量積累，發(fā)酵變緩。因此，選用40 h 作為最佳的發(fā)酵時(shí)間。

2.2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

接種2%的混合菌液，在發(fā)酵時(shí)間為40 h 下進(jìn)行發(fā)酵溫度的單因素試驗(yàn)見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對酵素總酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on total acid content of enzyme

如圖4 所示，不同的發(fā)酵溫度下，活菌數(shù)和產(chǎn)酸量不同。隨著發(fā)酵溫度的增加，酵素的總酸含量逐漸增加，隨后趨于平緩。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，總酸含量達(dá)到最大值，活菌數(shù)和總酸度達(dá)到最高，因此，選用30 ℃作為最佳的發(fā)酵溫度。

2.2.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表1 為Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平，根據(jù)酵素發(fā)酵的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，共17 組試驗(yàn)。

表1 酵素發(fā)酵條件Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

表2 酵素發(fā)酵條件Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design scheme experimental results of Box-Behnken

續(xù)表2 酵素發(fā)酵條件Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Design scheme experimental results of Box-Behnken

2.2.3 二次回歸模型擬合及方差分析

利用Design Export 7.0 軟件，以接種量、發(fā)酵溫度、和發(fā)酵時(shí)間為自變量，以酵素總酸含量為響應(yīng)值，對表2 中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元擬合，建立回歸模型：Y=4.15+0.096A+0.11B+0.077C-0.04AB-0.043AC-0.028BC-0.12A2-0.11B2-0.14C2

Box-Behnken 試驗(yàn)方差分析見表3。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)方差分析Table 3 Box-Behnken experimentation analysis of variance

如表3 所示，模型的顯著性P 值小于0.000 1，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)有效；而失擬項(xiàng) P=0.279 7＞0.05，說明模型與試驗(yàn)值的差異較?。籖2=0.993 1，表明試驗(yàn)誤差較小；校正系數(shù)R2adj=0.984 1，表明98.41%的響應(yīng)值變化都可以以這個(gè)模型來解釋?；谏厦娴脑囼?yàn)結(jié)果可以知道試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)合理有效。

根據(jù)表3 也可以看出，該模型的一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng) AB、AC，二次項(xiàng) A2，B2，C2的 P 值均小于 0.01，BC小于0.05，都達(dá)到了顯著的水平，說明上述幾項(xiàng)對酵素總酸含量均有顯著的影響。并得出在這3 個(gè)因素中，發(fā)酵時(shí)間是最顯著的變量，其次是接種量和發(fā)酵溫度。

2.2.4 響應(yīng)面分析

各因素之間交互作用的響應(yīng)面圖見圖5～圖7。

圖5 接種量與發(fā)酵時(shí)間對酵素總酸含量的影響Fig.5 Effect of inoculum size and fermentation time on total acid content of enzyme

圖6 接種量與發(fā)酵溫度對酵素總酸含量的影響Fig.6 Effect of inoculum size and fermentation temperature on total acid content of enzyme

圖7 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度對酵素總酸含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time and fermentation temperature on total acid content of enzyme

2.2.5 酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化和驗(yàn)證

試驗(yàn)條件加以驗(yàn)證，當(dāng)接種量為2.05%，提取溫度為41.31 h，發(fā)酵溫度為30.92 ℃，總酸含量最高，為4.18%。考慮到實(shí)際性以及儀器的限制性，將最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整，即接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間41 h，發(fā)酵溫度為31 ℃，進(jìn)行3 組驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)總酸含量是2.02%。實(shí)測值與預(yù)測值非常相近，表明這個(gè)模型可以準(zhǔn)確地分析酵素的發(fā)酵條件。

2.3 玉米須果蔬復(fù)合酵素飲料配方的調(diào)配結(jié)果

按照發(fā)酵條件制備獲得的玉米須果蔬復(fù)合發(fā)酵液用檸檬酸、白砂糖進(jìn)行口感調(diào)配。在大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過全因子試驗(yàn)[18]來確定檸檬酸和白砂糖的添加量，以感官評分為指標(biāo)。評分標(biāo)準(zhǔn)見表4，全因子試驗(yàn)水平表見表5，飲料調(diào)配全因子試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表4 發(fā)酵飲料的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory scoring criteria for fermented beverages

表5 全因子試驗(yàn)水平表Table 5 All factor test schedule horizontal table

表6 飲料調(diào)配全因子試驗(yàn)結(jié)果Table 6 All-round distribution condition for beverage distribution results

從全因子試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)白砂糖添加量為4%，檸檬酸添加量為0.06%時(shí)，玉米須果蔬復(fù)合酵素飲料的感官評分最高。

2.4 DPPH自由基清除能力

不同濃度下的DPPH 自由基清除能力按對照組和試驗(yàn)組酵素的測定結(jié)果繪制出變化曲線[19]見圖8。

由圖8 可知，對照組玉米須果蔬復(fù)合酵素飲料在樣品濃度低于30%時(shí)，DPPH 自由基清除率為23.56%，但試驗(yàn)組酵素飲料的清除率為62.88%；當(dāng)酵素濃度為50%時(shí)，對照組對DPPH 自由基的清除率為38.87%，試驗(yàn)組對DPPH 自由基清除率高達(dá)86.24%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。試驗(yàn)結(jié)果表明，添加酵母菌、乳酸菌、醋酸菌的酵素飲料對DPPH 自由基有很強(qiáng)的清除能力。

圖8 玉米須果蔬復(fù)合酵素飲料對DPPH 自由基的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of corn silk and vegetable compound enzyme beverage on DPPH·

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，酵素發(fā)酵的最佳條件為：接種量2%，發(fā)酵時(shí)間41 h，發(fā)酵溫度31 ℃；得到的果蔬復(fù)合發(fā)酵液用4%的白砂糖，0.06%的檸檬酸進(jìn)行調(diào)配，在該條件下玉米須果蔬酵素飲料的感官評分最高；同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，玉米須果蔬復(fù)合酵素飲料對DPPH 自由基具有較強(qiáng)的清除作用。本試驗(yàn)研究開發(fā)了一種新型功能性酵素飲料，為飲料產(chǎn)業(yè)提供了一定的理論依據(jù)。