超高效液相色譜法測定楊梅中喹啉銅殘留

付巖，王全勝，張亮，朱勇，趙健，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

喹啉銅是一種喹啉類保護(hù)性廣譜、高效殺菌劑，屬有機銅鰲合物[1]。喹啉銅對霜霉病、炭疽病等由真菌、細(xì)菌引起的疾病具有良好的預(yù)防和治療作用，但喹啉銅使用不當(dāng)可能會污染環(huán)境，并危及人類健康[2]。楊梅為楊梅科楊梅屬，是中國南方的特色水果，具有較高的藥用和食用價值，但栽培中病蟲害較多且發(fā)生情況復(fù)雜[3-4]。楊梅褐斑病(MycosphaerellaMyricaeSaw.)是葉部系統(tǒng)性侵染病害，在浙江省楊梅產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重的果園葉發(fā)病率達(dá)80%以上，引起早期大量落葉，影響楊梅樹勢和果實產(chǎn)量[5]。在生產(chǎn)中喹啉銅被用來防治楊梅褐斑病[6]。我國及其他國家和組織尚未制定喹啉銅在楊梅上的最大殘留限量值(MRL)。我國規(guī)定了喹啉銅在番茄、黃瓜和蘋果上的MRL均為2 mg·kg-1(臨時限量)[7]。目前已有對楊梅中三唑類、有機磷、生物農(nóng)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑等農(nóng)藥殘留檢測的相關(guān)報道[8-12]，但是楊梅中喹啉銅殘留量的測定方法尚未見文獻(xiàn)報道。本研究采用草酸溶液提取，固相萃取柱凈化，建立了準(zhǔn)確、靈敏的楊梅中喹啉銅超高效液相色譜(UPLC)分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC及Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm, 1.7 μm，美國Waters公司)；KS4000ic恒溫振蕩器(德國IKA 公司)；3K15高速離心機(德國Sigma公司)；GENIUS3旋渦混合器(德國IKA公司)；萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；pH計(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 試劑與材料

喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品(98.2%)購于德國Dr.Ehrensorfer公司。甲醇(色譜純，德國Merck公司)；二水合草酸、氫氧化鈉均為分析純(國藥集團(tuán)，中國)；HLB固相萃取柱(200 mg，6 mL，美國Waters公司)，試驗用水為Milli-Q超純水。

1.3 樣品前處理

提取。稱取5 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL塑料離心管中，加入15 mL 1%草酸溶液(V/V)，振蕩提取30 min，9 500 r·min-1離心3 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL塑料離心管中，用1%草酸溶液定容至20 mL混勻，用定性濾紙過濾后，取10 mL用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3，待凈化。

凈化。HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，加入10 mL上述待凈化液，流出后加入5 mL淋洗液(甲醇∶水為1∶9)，舍棄流出液，抽干固相萃取柱，再加3 mL洗脫液(10 g·L-1草酸甲醇溶液)，收集洗脫液于15 mL聚丙烯試管中，置于40 ℃水浴中氮氣吹至近干，加2 mL 1%草酸溶液，漩渦1 min溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜測定。

1.4 儀器條件

色譜柱：Acquity BEH C18(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相：A相為10 mmol·L-1草酸溶液，B相為甲醇；梯度洗脫條件：B相在10 min內(nèi)保持5%后，在3.0 min內(nèi)線性增至90%，保持1.0 min，然后在2 min內(nèi)降至5%，保持4.0 min；流速0.20 mL·min-1；柱溫40 ℃；樣品室溫度25 ℃；進(jìn)樣體積10.0 μL；檢測波長為252 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

在參考文獻(xiàn)[1-2]的基礎(chǔ)上，采用光電二極管陣列PDA檢測器對喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，分析其3D圖譜。結(jié)果顯示，喹啉銅在252 nm處有最大紫外光吸收，故選擇252 nm作為檢測波長。

2.2 流動相

經(jīng)過色譜條件試驗發(fā)現(xiàn)，選擇甲醇為有機相時，同樣梯度洗脫條件下雖然出峰時間比乙腈晚，但雜質(zhì)的干擾較?。槐容^10 mmol·L-1的草酸溶液和乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)節(jié)pH值至4)2種水相顯示，10 mmol·L-1草酸溶液峰型更好。因此，最終確定流動相為10 mmol·L-1草酸溶液-甲醇梯度洗脫，流速為0.2 mL·min-1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。采用外標(biāo)法定量。將100 mg·L-1的喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用1%草酸溶液稀釋配制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按1.4節(jié)條件進(jìn)行測定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。分析結(jié)果表明，喹啉銅在0.1～10.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=548 778x+8 198，R2=1.000。

圖1 喹啉銅的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

在上述條件下，喹啉銅檢出限為1.0×10-9g，靈敏度較高。取楊梅的空白樣品進(jìn)行回收率試驗，添加喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平分別為0.2、2.0、5.0 mg·kg-1，按前述前處理步驟進(jìn)行處理，每個濃度處理重復(fù)5次，外標(biāo)法定量。如表1所示，喹啉銅在楊梅中平均添加回收率為74%～101%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.44%～9.03%。說明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較好，符合農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。

表1 喹啉銅在楊梅中的添加回收率

2.5 喹啉銅在楊梅中的消解動態(tài)

33.5%喹啉銅懸浮劑按施藥劑量1 005 mg·kg-1(有效成分)于楊梅長到一半大小時噴藥，試驗小區(qū)楊梅樹為2棵，設(shè)3個重復(fù)。浙江、云南、福建試驗點楊梅中的殘留消解曲線如圖2所示。施藥后2 h，楊梅中喹啉銅初始沉積量為1.86～4.41 mg·kg-1，之后楊梅中喹啉銅的殘留量逐漸減少。消解曲線均符合一級動力學(xué)方程。王華弟等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在浙江的臺州、衢州和溫州試驗點，楊梅中喹啉銅的半衰期為3.6～13.6 d。筆者發(fā)現(xiàn)，喹啉銅在浙江、云南、福建試驗點楊梅中的消解半衰期為3.5～8.3 d，相比之前報道差異不大?？傮w而言，喹啉銅在楊梅上屬于易降解性農(nóng)藥。

圖2 喹啉銅在楊梅中的消解

3 小結(jié)與討論

目前對于喹啉銅在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留檢測已有相關(guān)報道。肖浩等[1]采用高效液相色譜法測定稻田樣品中喹啉銅殘留；姚杰等[14]以乙二胺四乙酸(EDTA)作為競爭配體，將喹啉銅轉(zhuǎn)化為8-羥基喹啉，采用氣相色譜-氮磷檢測器(GC-FTD)檢測其在蘋果中的殘留；周夢春等[15]采用酸性乙腈提取，正己烷凈化，用高效液相色譜法測定黃瓜和土壤中的喹啉銅殘留量。姚杰等[14]研究認(rèn)為，喹啉銅在蘋果中的半衰期為4.4～7.4 d；范珺等[16]認(rèn)為，喹啉銅在黃瓜中半衰期為2.6～4.1 d，可見喹啉銅在不同作物上消解半衰期有一定差異，說明不同作物對喹啉銅降解有一定影響。此外，氣候、栽培管理等因素也會對農(nóng)藥降解速度產(chǎn)生一定的影響。本文通過對色譜條件及樣品前處理條件的優(yōu)化，建立了楊梅中喹啉銅殘留的UPLC分析方法，其回收率、精密度和檢出限等參數(shù)均能滿足農(nóng)藥殘留量分析的技術(shù)要求。本研究中，喹啉銅在楊梅中的消解半衰期為3.5～8.3 d。