珍珠層粉氨基酸指紋圖譜的構(gòu)建及氨基酸含量測定的研究＊

喬藝涵，孟雪丹，索亞然，劉雯雪，李二文，王昭懿，馮 丹，柯尊洪，林瑞超＊＊，鄒迪新

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評價北京市重點實驗室 北京 100102；2.成都康弘制藥有限公司 成都 610036；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

珍珠層粉為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsis cumingii（Lea）、褶紋冠蚌Cristaria plicata（Leach）或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pteria martensii（Dunker）的貝殼珍珠層加工而成的粉末[1,2]，具有鎮(zhèn)靜安神、解毒生肌、美容養(yǎng)顏、明目消翳、治療潰瘍、祛除肝火等功效[3]，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第六冊）》、四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1987年版）以及福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2006年版）等標(biāo)準(zhǔn)中。貝殼珍珠層與珍珠均為貝體內(nèi)的外套膜上皮細胞分泌出的珍珠質(zhì)積累而成，經(jīng)證實貝殼珍珠層粉的確是同質(zhì)同效的珍珠粉代用品，無論內(nèi)服外用，均無任何毒性和副作用，即珍珠層粉供藥用具有可行性[4]。珍珠層粉由95% 的碳酸鈣和5% 的有機質(zhì)，以及一些微量元素等組成[5]。其中，有機質(zhì)主要為蛋白質(zhì)，水解后得到17 種氨基酸，而氨基酸是珍珠和珍珠層粉發(fā)揮特定功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[6]，因此建立珍珠層粉氨基酸的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)尤為重要?，F(xiàn)有的測定氨基酸含量文獻記載，多采用分光光度計法[7]、全自動氨基酸分析儀法[8-14]、高效液相柱前衍生測定法[15-20]及高效液相柱后衍生測定法[21]。然而，由于分光光度法靈敏度較低；全自動氨基酸分析儀價格昂貴，不能廣泛地普及；高效液相柱后衍生測定法雖然準(zhǔn)確度較高，但是消耗時間過長，靈敏度低，故選擇最為簡便、高效、準(zhǔn)確的高效液相柱前衍生化方法。柱前衍生化法也根據(jù)衍生化試劑的不同分為：鄰苯二甲醛（OPA）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）、異硫氰酸苯酯（PITC）、丹酰氯（Dansyl-Cl）、二甲胺偶氮苯磺酰氯（Dabsyl-Cl）和6-氨基喹琳-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸醋（AQC）等[22-29]。根據(jù)相關(guān)的氨基酸含量測定文獻[30,40]，艾杰爾氨基酸分析方法包具有準(zhǔn)確、高效、分離效果好等優(yōu)點。本次實驗經(jīng)過對大量文獻進行篩查，最終確定使用高效液相柱前衍生化法，將異硫氰酸苯酯（PITC）和三乙胺作為衍生化試劑，并采用艾杰爾氨基酸分析方法包。中藥指紋圖譜是一種較為成熟的質(zhì)量評價手段，該技術(shù)已被廣泛用于中藥的質(zhì)量控制領(lǐng)域，可較為全面地反映中藥材的特征[41,42]，本次研究將指紋圖譜技術(shù)首次運用到中藥珍珠層粉上，建立珍珠層粉氨基酸指紋圖譜，并進行氨基酸含量的測定，旨在為珍珠層粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建設(shè)提供依據(jù)。

表1 17批珍珠層粉信息

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀（PDA 檢測器），KQ-500DE 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），25 mL 氨基酸消解管，氨基酸分析柱Venusi1-AA（4.6 mm × 250 mm，5 μm，艾杰爾科技），鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），1000 μL 移液槍（eppendorf），200 μL 移液槍（eppendorf），20 μL 移液槍（eppendorf），十萬分之一分析天平（Mettler Toledo 公司），氮吹儀，DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），真空抽濾系統(tǒng)（IKA），抽濾瓶，燒杯，玻璃棒，容量瓶，蒸發(fā)皿，0.22 μm微孔濾膜，一次性2 mL注射器（江蘇宇陽醫(yī)療器械有限公司），離心管。

1.2 試藥

1.2.1 試劑

氨基酸分析方法包：17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（天門冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、絲氨酸Ser、甘氨酸Gly、組氨酸His、精氨酸Arg、蘇氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val、蛋氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、賴氨酸Lyb 各為2.5 μmol·mL-1，胱氨酸Cys 為1.25 μmol·mL-1）、正亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、三乙胺、異硫氰酸苯酯（PITC）等（均由艾杰爾科技提供）；純凈水，色譜乙腈（賽默飛世爾科技），無水醋酸鈉（北京化工廠）、乙酸（色譜級，賽默飛世爾科技）、濃鹽酸（37.5% ，北京化工廠）、正已烷（天津市津科精細化工研究所）。

1.2.2 溶液配制[43]

（1）三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混勻。

（2）異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL混勻。

（3）流動相A：80% 乙腈；水溶液流動相B：稱取15.2 g無水乙酸鈉，加水1850 mL，溶解后用乙酸調(diào)pH至6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過濾。

（4）正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液：稱取正亮氨酸約10 mg，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液10 mL使溶解，混勻。

1.2.3 珍珠層粉藥材

共收集了17 批珍珠層粉，來自于浙江、河南、廣東、廣西、湖南、安徽等六個省份，17 批珍珠層粉的樣品信息（表1），其中S5-6，S13-16號樣品通過公司途徑收集，其余樣品均收集于當(dāng)?shù)卣渲轲B(yǎng)殖場，收集時均為新鮮或干燥蚌體，依照文獻中記載的珍珠層粉制備方法，經(jīng)本實驗室后期加工得到[44-46]。三角帆蚌基源的珍珠層粉均為淡水珍珠層粉，而馬氏珍珠貝基源的珍珠層粉均為海水珍珠層粉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用Venusi1-AA 氨基酸分析柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），以80% 乙腈水溶液為流動相A，以乙酸鈉-乙腈-水溶液作為流動相B（pH 為6.5），柱溫：28℃，進樣量：10 μL，檢測波長：254 nm，流速：0.9 mL·min-1，樣品溫度：5℃，梯度洗脫程序（表2）。理論塔板數(shù)按正亮氨酸峰計算應(yīng)不低于2×105，所有組分均在45 min內(nèi)出峰，17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品，珍珠層粉氨基酸色譜圖（圖1）。

2.2 粗蛋白的制備

由于珍珠層粉中含有較多的鈣鹽，如果直接進行水解，將與鹽酸發(fā)生反應(yīng)，生成大量的二氧化碳氣體，致使水解無法進行，故需要先制取粗蛋白。

準(zhǔn)確稱取珍珠粉約10.0 g于1000 mL燒杯中，加水10 mL，攪拌調(diào)成糊狀，緩慢分次加入6 moL·L-1的稀鹽酸酸化4 次，每次10 mL（酸化過程中產(chǎn)生的泡沫不得有溢出等流失現(xiàn)象），在酸化的過程中，需要充分?jǐn)嚢?，讓稀鹽酸和鈣鹽充分反應(yīng)，自然放置，待泡基本消退后，取合適大小的濾紙進行抽濾，并以水洗滌使其充分轉(zhuǎn)移，抽濾近干時，續(xù)加6 moL·L-1的鹽酸適量，浸沒固體物，檢查有無氣泡產(chǎn)生，輕輕震搖10 min 使反應(yīng)充分，再抽濾，并重復(fù)上述浸泡操作，直至無氣泡產(chǎn)生，最后以水洗滌至洗液呈中性，得橙黃色或桔黃色粗蛋白質(zhì)。進行干燥和稱重，計算粗蛋白產(chǎn)率[47]。

2.3 供試品衍生溶液的制備

精密稱取含量測定項下粗蛋白質(zhì)10 mg，置于25 mL 耐高溫氨基酸消解管中，準(zhǔn)確加入6 moL·L-1的鹽酸5 mL，加蓋密封，置于110℃下，水解24 h，取出，放冷，開瓶，將水解液過濾并轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣以0.1 mol·L-1稀HCl溶解，移入5 mL容量瓶中，定容，搖勻，微孔濾膜精濾（0.22 μm），取續(xù)濾液200 μL至2 mL 小瓶中，依次準(zhǔn)確加入14% 的三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液各100 μL，并準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液20 μL 加蓋，混勻，置于室溫下衍生90 min，加正已烷400 μL，振搖，靜置約10 min，取下層溶液，用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液200 μL，加入800 μL水稀釋，搖勻，于高效液相小瓶中待用[17]。

2.4 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液的制備

按2.3 所述，取混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL 至2 mL 小瓶中，自“依次準(zhǔn)確加入14% 的三乙胺乙腈溶液”起，至“高效液相小瓶中待用”即得空白溶液。

表2 梯度洗脫程序

圖1 氨基酸對照品色圖譜（A）、珍珠層粉氨基酸色圖譜（B）

2.5 空白衍生溶液的制備

按2.3 所述，取純凈水200 μL 至2 mL 小瓶中，自“依次準(zhǔn)確加入14% 的三乙胺乙腈溶液”起，至“高效液相小瓶中待用”即得空白溶液（空白衍生溶液中含有正亮氨酸）。

2.6 線性關(guān)系考察

取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（除胱氨酸Cys 為1.25 μmol·mL-1外，其余氨基酸濃度均為2.5 μmol·mL-1），分別將其稀釋至濃度為1.25、0.625、0.25、0.125、0.0625、0.03125 μmol·mL-1的6 個不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.4項下制備方法制取不同濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液，按照2.1項下的色譜條件進行測定，以混合標(biāo)準(zhǔn)品中各氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)，以各氨基酸峰面積與正亮氨酸內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)建立線性回歸方程，回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表3，由表3可知，除了胱氨酸Cys外，其余的16種氨基酸線性方程的R2均>0.99。

表3 線性關(guān)系實驗結(jié)果

表4 精密度實驗（n=6）

表5 重復(fù)性試驗（n=6）

2.7 精密度試驗

取17 種氨基酸混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，17種氨基酸中除了胱氨酸Cys 外，16 種氨基酸的峰面積RSD 值均<3% （表4），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取編號為14的廣東湛江產(chǎn)馬氏珍珠貝珍珠層粉，精密稱定，按2.2 和2.3 項下的方法平行制6 份供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進行HPLC 分析，結(jié)果17 種氨基酸中除組氨酸His 外，峰面積的RSD 值均< 3% （表5），表明方法的重復(fù)性較好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取編號為14的廣東湛江產(chǎn)馬氏珍珠貝珍珠層粉，精密稱定，按2.2和2.3項下的方法制備供試品溶液，分別再溶液制備后0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h 按2.1 項下色譜條件進行HPLC 分析，結(jié)果17 種氨基酸中除組氨酸His 外，峰面積的RSD 值均<3% ，如表6 所示，結(jié)果表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 回收率試驗

將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋至8倍，使各氨基酸（除胱氨酸Cys為0.15625 μmol·mL-1外），各氨基酸的濃度均為0.3125 μmol·mL-1，將稀釋8倍的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照按2.4 項下的方法平行制備6 份氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液，按2.1 項下色譜條件進行HPLC 分析，按照2.6項下的線性回歸方程計算回收率，16種氨基酸（胱氨酸Cys 除外）的回收率均在95% -105% 之間，回收率的RSD值均<3% （表7）。

表6 穩(wěn)定性試驗（n=6）

表7 回收率實驗（n=6）

2.11 珍珠層粉氨基酸指紋圖譜的建立及共有峰的鑒定

取17 批珍珠層粉藥材按2.2、2.3 項下方法制備供試品衍生溶液，按2.1 項色譜條件下檢測，記錄色譜圖。將所有數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版本）”軟件進行處理。選取S1作為參照圖譜，選擇中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度設(shè)為0.2，運用自動峰匹配進行全譜峰匹配（圖2），并生成對照指紋圖譜（圖3）。17批珍珠層粉指紋圖譜自動匹配共得到24 個共有峰，其中有一個峰為正亮氨酸內(nèi)標(biāo)，所以一共得到23 個共有峰，與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行對比，指認(rèn)出15個氨基酸，另外兩個氨基酸，由于部分批次中的含量太低，未被“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”匹配為共有峰。

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 珍珠層粉氨基酸指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

3.1.1 指紋圖譜的相似度評價

圖2 17批層粉珍珠藥材色譜峰匹配圖

圖3 珍珠層粉藥材的共有模式圖譜

利用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版本）”軟件對17 批不同基源和產(chǎn)地的珍珠層粉藥材進行相似度評價（表8）。17批珍珠層粉藥材圖譜與對照指紋圖譜的相似度范圍為0.881-0.996，說明珍珠層粉藥材的質(zhì)量存在一定差異。除了S1 號樣品（浙江諸暨2017 年）和S11 號樣品（浙江諸暨2018 年）圖譜與對照圖譜的相似度小于0.90 以外，其他各批次藥材圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.90，相似度在0.90 以上的藥材占88.24% ，可見大部分藥材質(zhì)量比較接近，說明藥材中氨基酸成分相似度較高，但可能由于珍珠層粉藥材生產(chǎn)過程中受到氣候、水質(zhì)、環(huán)境等因素以及采收加工過程中諸多因素的影響，表現(xiàn)出一定的差異。

3.1.2 聚類分析

運用SAS統(tǒng)計學(xué)軟件，對17批珍珠層粉樣品進行聚類分析，采用離差平方和法[48]，以歐氏距離作為樣品相似度的測度，以23個共有峰的峰面積為變量（圖4），當(dāng)歐式距離如虛線1所示時，可以將17批珍珠層粉分為兩類；當(dāng)歐式距離為虛線2所示時，可以將17批珍珠層粉分為6 類，第一類為S1（浙江諸暨2017 年）和S11（浙江諸暨2018年），第二類為S14（廣東湛江），S15（廣東湛江），S16（廣東湛江），第三類為S3（浙江諸暨阮市2017 年），S8（湖南常德2018 年），S9（浙江諸暨2018年），S17（浙江諸暨阮市2017年），第四類為S5（廣東澳珍藥業(yè)170802批次），S6（廣東澳珍藥業(yè)170803批次），S12（浙江諸暨2018 年），第五類為S2（浙江諸暨江薄2017 年），S4（河南信陽羅山2018 年），S10（安徽黃山2018年），第六類為S7（廣東湛江2017年）和S13（廣西北海）。

聚類分析結(jié)果與相似度評價保持一致，根據(jù)聚類分析結(jié)果可知，第一類均為浙江諸暨三角帆蚌基源，為淡水珍珠層粉；第二類均為廣東湛江所產(chǎn)馬氏珍珠貝基源，為海水珍珠層粉；第三類有浙江和湖南兩個地區(qū)三角帆蚌基源，為淡水珍珠層粉；第四類為浙江和廣東兩個地區(qū)三角帆蚌基源，為淡水珍珠層粉；第五類為浙江，河南，安徽三個地區(qū)三角帆蚌基源，為淡水珍珠層粉；第六類為廣東和廣西兩個地區(qū)馬氏珍珠貝，為海水珍珠層粉，通過相似度評價可知，珍珠層粉所含氨基酸成分相似度較高，藥材質(zhì)量比較接近，但是通過聚類分析，可以明顯地看出，不同產(chǎn)地的珍珠層粉氨基酸成分差異不大，但是不同基源（即三角帆蚌和馬氏珍珠貝）的珍珠層粉氨基酸成分之間存在明顯差異。

3.1.3 主成分分析

用SPSS 20.0 軟件對各共有峰的峰面積進行處理，對17 批珍珠層粉藥材指紋圖譜所得23 個共有峰進行主成分分析，求出相關(guān)矩陣的特征值及其方差（表9），共提取出6個主成分，前6個因子的累積方差貢獻率達到99.16% ，前6 個主成分即可代表珍珠層粉指紋圖譜共有峰的大部分信息。并通過SPSS 20.0 進一步將各特征向量中心化和標(biāo)準(zhǔn)化后，得到17 批樣品主成分三維得分圖[49]（圖5），根據(jù)主成分三維得分圖可知，主成分分析結(jié)果與相似度評價和聚類分析保持一致，不同產(chǎn)地的珍珠層粉氨基酸成分區(qū)別不大，但是不同基源（三角帆蚌和馬氏珍珠貝）的珍珠層粉氨基酸成分有明顯的差異。

表8 珍珠層粉指紋圖譜相似度評價

圖4 17批珍珠層粉藥材聚類分析樹狀圖

表9 主成分特征值及方差

圖5 主成分三維得分圖

圖6 17批珍珠層粉對3個主成分的排序坐標(biāo)圖

圖7 23個共有峰對3個主成分的排序坐標(biāo)圖

主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小和作用方向[50]。由于變量諸多不易分析，因此提取前三個主成分，根據(jù)主成分載荷矩陣得到17批珍珠層粉對3個主成分的排序坐標(biāo)圖（圖6）及23個共有峰對3個主成分的排序坐標(biāo)圖（圖7）。

由圖6可見，海水珍珠層粉和淡水珍珠層粉對3個主成分的貢獻值有很大差異，主要體現(xiàn)在對主成分2的貢獻上，批次號為S7，S13，S14，S15，S16的海水珍珠層粉對主成分2 的貢獻值最大，說明海水珍珠層粉和淡水珍珠層粉氨基酸成分的差異主要體現(xiàn)在主成分2上，通過分析“23 個共有峰3 個主成分的排序坐標(biāo)圖”來表示（圖7），23個變量對主成分1和主成分3成正相關(guān)，而對主成分2有正相關(guān)和負相關(guān)，其中，對主成分2呈現(xiàn)正相關(guān)，并且貢獻率達到0.4 以上的有2（天門冬氨酸Asp）、3、8（精氨酸Arg）、10（丙氨酸Ala）、17（胱氨酸Cys）、19（亮氨酸Leu）、23 號峰，對主成分2 呈現(xiàn)負相關(guān)，并且貢獻率達到0.4 以上的有6（絲氨酸Ser）、9（蘇氨酸Thr）、16、20（苯丙氨酸Phe）號峰，說明了海水珍珠層粉和淡水珍珠層粉之間差異較大的氨基酸應(yīng)當(dāng)是這些氨基酸，其中天門冬氨酸Asp、精氨酸Arg、丙氨酸Ala、胱氨酸Cys 和亮氨酸Leu 對主成分2 呈現(xiàn)正相關(guān)，所以推測這5 個氨基酸在海水珍珠層粉中的含量應(yīng)當(dāng)高于淡水珍珠層粉中的含量；而絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr和苯丙氨酸Phe對主成分2呈現(xiàn)負相關(guān)，推測這3個氨基酸在海水珍珠層粉中的含量應(yīng)當(dāng)?shù)陀诘渲閷臃壑械暮俊?/p>

3.2 珍珠層粉氨基酸含量測定數(shù)據(jù)分析

取不同產(chǎn)地和基源的珍珠層粉藥材適量，按2.2、2.3 項下方法制備供試品衍生溶液，在2.1 項色譜條件下進行含量測定測定，采用Venusil AA 氨基酸分析方法包中的計算方法得到17 批珍珠層粉中17 種氨基酸的含量以及總氨基酸含量（表10）。

Venusil AA 氨基酸分析方法包氨基酸含量計算方法：

樣品溶液中各種氨基酸濃度（μg·mL-1）=f1/f2×C，其中：f1=樣品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積，f2=混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積，C=氨基酸對照品濃度（μg·mL-1）。

樣品中總氨基酸含量（% ）=樣品溶液中所有氨基酸濃度總和（μg·mL-1）× V × 10-6× 100/W，其中：V =樣品溶液的定容體積（mL），W=樣品質(zhì)量（g）

由3.1.3 項下的主成分分析推測天門冬氨酸Asp、精氨酸Arg、丙氨酸Ala、胱氨酸Cys 和亮氨酸Leu 在海水珍珠層粉中的含量應(yīng)當(dāng)高于其在淡水珍珠層粉中的含量；絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr和苯丙氨酸Phe在海水珍珠層粉中的含量應(yīng)當(dāng)?shù)陀谄湓诘渲閷臃壑械暮?，?jīng)過含量測定，將正相關(guān)和負相關(guān)氨基酸在海水珍珠層粉和淡水珍珠層粉的含量平均值列于表11、12中，含量測定的結(jié)果與主成分分析完全一致，海水珍珠層粉和淡水珍珠層粉的氨基酸成分存在明顯差別。

4 結(jié)論

本次研究收集了來自6個省份、兩種基源（馬氏珍珠貝和三角帆蚌）的17 批珍珠層粉，首次建立了珍珠層粉的氨基酸指紋圖譜，并較為全面地分析和測定了珍珠層粉中氨基酸的含量。

表10 珍珠層粉中氨基酸的含量測定結(jié)果（n=3，mg·g-1）

珍珠層粉氨基酸指紋圖譜確認(rèn)了23個共有峰，并與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品對比，指認(rèn)出其中15 個共有峰，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)分析得17 批珍珠層粉藥材圖譜與對照指紋圖譜的相似度范圍為0.881-0.996，相似度在0.9以上的藥材占比為88.24% ，說明珍珠層粉藥材的質(zhì)量存在一定差異；通過聚類分析，將17批珍珠層粉分為6類，通過聚類分析結(jié)果，可以明顯地看出，不同產(chǎn)地的珍珠層粉氨基酸成分差異不大，但是不同基源（即三角帆蚌和馬氏珍珠貝）的珍珠層粉氨基酸成分之間存在明顯的差異；運用主成分分析，建立主成分三維得分圖，其結(jié)果與聚類分析高度一致，進一步建立“不同批次珍珠層粉對主成分的排序坐標(biāo)圖”，發(fā)現(xiàn)海水珍珠層粉對主成分2的貢獻最大且均呈現(xiàn)正相關(guān)性，通過分析“17 種氨基酸對主成分的排序坐標(biāo)圖”，發(fā)現(xiàn)天門冬氨酸Asp、精氨酸Arg、丙氨酸Ala、胱氨酸Cys 和亮氨酸Leu 對主成分2 呈現(xiàn)正相關(guān)，并且貢獻率達到0.4以上，推測正相關(guān)氨基酸在海水珍珠層粉中的含量應(yīng)當(dāng)高于淡水珍珠層粉中的含量，發(fā)現(xiàn)絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr和苯丙氨酸Phe對主成分2 呈現(xiàn)負相關(guān)，并且貢獻率達到0.4 以上，推測負相關(guān)氨基酸在海水珍珠層粉中的含量應(yīng)當(dāng)?shù)陀诘渲閷臃壑械暮?；通過珍珠層粉中氨基酸的含量測定證實了主成分分析中的推測。

表11 正相關(guān)氨基酸在海水珍珠層粉和淡水珍珠層粉中的含量平均值（mg·g-1）

以上結(jié)果表明，珍珠層粉氨基酸指紋圖譜可以反映珍珠層粉藥材中氨基酸成分的特征性和整體性，所建立的珍珠層粉氨基酸含量測定方法具有簡便易行、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢，不僅能為珍珠層粉的質(zhì)量評價提供依據(jù)，同時更有待為中國藥典收載珍珠層粉提供參考。