針刺對(duì)腦出血模型大鼠腦組織自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1 表達(dá)的影響

劉 昊 杜 嘉 馮培培 阮 晨 張偉波 朱仲華 周 馳 李新偉

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種常見且具有較高的死亡率和發(fā)病率的卒中亞型，每年占全球腦卒中的10%～15%[1]。幸存患者多因血腫引起神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損[2]。隨著對(duì)ICH 腦損傷機(jī)制研究的日益深入，防治腦損傷、提高神經(jīng)細(xì)胞存活率、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能已成為ICH 機(jī)理研究和探索治療方法的重要突破點(diǎn)。ICH后細(xì)胞死亡主要有三種類型，包括細(xì)胞壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡[3]。研究表明，血腫周邊組織細(xì)胞中存在大量自噬小體結(jié)構(gòu)，證實(shí)腦出血可以誘導(dǎo)自噬的激活[4]。自噬的激活很可能是細(xì)胞為了清除胞質(zhì)中受損的細(xì)胞器和有害物質(zhì)而發(fā)生的自我保護(hù)機(jī)制[5]。本研究通過建立自體血ICH 大鼠模型，運(yùn)用免疫印跡、Western Blot 技術(shù)，以自噬相關(guān)蛋白p62、Beclin-1 為切入點(diǎn)，探究針刺對(duì)ICH 大鼠腦組織自噬表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 本研究所有研究流程遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定，符合浙江省立同德醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（編號(hào)：XMSB20180007）。80只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley 大鼠（250～300g）購置于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（浙）2014-0001。飼養(yǎng)在室溫和濕度人工可控條件下，光照周期12h/12h，給予自由標(biāo)準(zhǔn)飲食飲水。

1.2 主要儀器與試劑 立體定位儀（STW-3X，中國成都儀器廠）；石蠟切片機(jī)（CUT5062，德國SELL）；生物組織包埋機(jī)（TKY-BMB，湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司）；華佗牌針灸針（0.35mm×40mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)（TKY-BMB，常州郝思琳醫(yī)用儀器有限公司）；電泳儀（B1650001，上海迪申生物技術(shù)有限公司）；微量注射器（0406-029K，上海高鴿）；顯微鏡（BX50，日本Oympus）；低溫離心機(jī)（002421，美國Thermo）。多聚甲醛（批號(hào)AR1068，武漢博士德生物有限公司）；PBS 緩沖液（批號(hào)AR0030，武漢博士德生物有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號(hào)P0012S，碧云天試劑盒）；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010，德國Millipore）；兔抗p62 多克隆抗體（批號(hào)ab56416，英國Abcam）；兔抗Beclin-1多克隆抗體（批號(hào)ab62557，英國Abcam）；兔抗GAPDH 多克隆抗體（批號(hào)ab8245，英國Abcam）；羊抗兔IgG（批號(hào)ab6721，英國Abcam）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腦出血模型制備方法 根據(jù)大鼠立體定位圖譜[6]（見插頁圖1）制備大鼠腦出血（ICH）模型[7]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉。將其俯臥位固定于腦立體定向儀上，頭皮中線切口以暴露顱骨和前囟點(diǎn)，在右側(cè)前囟點(diǎn)后0.24mm，旁開3.5mm 鉆直徑1mm 的孔洞。50μL 自體血通過微量注射器注入到尾狀核（坐標(biāo)：AP：-0.24mm，L：3.5mm，D：6mm），以10μL/min 的速度緩慢注入自體血，留針5min 后緩慢退針（見插頁圖1）。切口縫合消毒。假手術(shù)組中大鼠僅接受ICH 模型的各項(xiàng)手術(shù)過程但不注血。

圖1 大鼠立體定位圖譜確定自體血注入位置

2.2 動(dòng)物分組 將80 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、非穴位組、針刺組，每組20 只。假手術(shù)組：僅接受ICH 模型制備手術(shù)過程，但不注血；模型組：50μL 自體血注入到尾狀核制備ICH 模型，但不進(jìn)行任何干預(yù)；非穴位組：模型組基礎(chǔ)上針刺患側(cè)非穴位；針刺組：模型組基礎(chǔ)上針刺患側(cè)“百會(huì)”透“曲鬢”。

2.3 針刺干預(yù)方法 針刺組：大鼠完全蘇醒后，選擇0.35mm×40mm 華佗牌一次性針灸針，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]選取患側(cè)“百會(huì)”、“曲鬢”穴位（見插頁圖2）。采用“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法，透刺深度：1.5cm。留針30min，留針期間每5min 以180～200r/min 速度捻轉(zhuǎn)1 次，共捻轉(zhuǎn)3 次，每12h 1 次，連續(xù)針刺7 天；非穴位組：大鼠完全蘇醒后，取患側(cè)非穴位（定位：平行中線距“百會(huì)”穴1cm 處，見插頁圖2）采用透刺法，針刺透刺1.5cm，其他操作同針刺組。

圖2 針刺示意圖

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 行為學(xué)評(píng)分 針刺干預(yù)7 天后進(jìn)行行為學(xué)[7]評(píng)估：前肢放置試驗(yàn)（也稱觸須誘導(dǎo)前肢放置試驗(yàn)），輕輕抓起大鼠軀干，緩慢移動(dòng)使之肌肉放松。通過接觸桌子邊緣來觸碰大鼠觸須，正常大鼠在刺激同側(cè)觸須時(shí)會(huì)將前肢放在桌子邊緣。此過程重復(fù)10 次。前肢放置試驗(yàn)評(píng)分=前肢成功放置次數(shù)/總次數(shù)×100%。拐角試驗(yàn)，大鼠被置于一個(gè)由兩面相連的木板組成的30°拐角中，為了離開拐角，大鼠必須左轉(zhuǎn)或右轉(zhuǎn)。評(píng)估10 次大鼠轉(zhuǎn)動(dòng)情況，每次間隔至少30s。拐角試驗(yàn)評(píng)分=左轉(zhuǎn)數(shù)/全轉(zhuǎn)數(shù)×100%。

2.4.2 大鼠腦組織p62 免疫組化檢測 大鼠行為學(xué)評(píng)分結(jié)束后，腹腔注射倍量戊巴比妥鈉麻醉大鼠，摘取腦出血半暗帶區(qū)腦組織，用4%多聚甲醛固定，切成4μm 薄片進(jìn)行免疫組化染色。切片脫蠟到水，將組織切片置于0.1mol/L 的枸櫞酸溶液（pH=6.0）中修復(fù)，水浴20min，用組化筆圈定組織周圍，滴加雙氧水孵育20min，再加入封閉液封閉1h，加入兔抗一抗（p62，1：1000；Beclin-1，1:1500）在37℃孵育2h，再用山羊抗兔IgG 二抗（1：2000），在37℃下孵育30min，洗滌、復(fù)染、脫水、透明、封片。在400×顯微鏡下拍攝5 個(gè)視野。Image-Pro Plus 6.0 圖像軟件計(jì)算平均光密度值（n=10）。

2.4.3 大鼠腦組織Western blot 檢測 用混合的RIPA 裂解緩沖液從腦出血半暗帶區(qū)腦組織中提取總蛋白。蛋白濃度用BCA 蛋白檢測試劑盒定量。離心后，用SDS-PAGE 電泳分離，將等量的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到0.45μm 的PVDF 膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入兔抗p62 一抗（1：1500）4℃過夜，再用HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗（1:2000）在室溫下孵育2h。蛋白信號(hào)檢測采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，使用ImageJ 軟件測量蛋白質(zhì)條帶的密度（n=10）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0 軟件分析，組間比較采用ANOVA 方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組ICH 大鼠行為學(xué)評(píng)分比較 造模后7 天，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損體征（P＜0.01）。針刺非穴位未改善ICH 大鼠神經(jīng)功能缺損體征。與模型組比較，針刺干預(yù)能夠明顯提高ICH 大鼠行為學(xué)評(píng)分（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（%，±s）

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（%，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與非穴位組比較，▲P＜0.01；假手術(shù)組：模擬ICH 制備過程但不注血；模型組：自體血誘導(dǎo)ICH 模型；非穴位組：模型組基礎(chǔ)上予針刺非穴位干預(yù)；針刺組：模型組基礎(chǔ)上予針刺“百會(huì)”透“曲鬢”干預(yù)

3.2 各組ICH 大鼠腦組織p62 蛋白表達(dá)量比較 免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，腦出血模型大鼠p62 蛋白表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）。非穴位組與模型組p62 蛋白表達(dá)量相似。與模型組比較，針刺組大鼠腦組織p62 蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。見表2、插頁圖3。

圖3 各組大鼠出血半暗帶區(qū)腦組織p62 蛋白表達(dá)量比較（免疫酶標(biāo)染色法，n=10，×400）

表2 各組ICH 大鼠腦組織p62 蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 各組ICH 大鼠腦組織p62 蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與非穴位組比較，▲P＜0.01；假手術(shù)組：模擬ICH 制備過程但不注血；模型組：自體血誘導(dǎo)ICH 模型；非穴位組：模型組基礎(chǔ)上予針刺非穴位干預(yù)；針刺組：模型組基礎(chǔ)上予針刺“百會(huì)”透“曲鬢”干預(yù)；ICH：腦出血

3.3 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，腦出血模型大鼠p62、Beclin-1 蛋白表達(dá)量明顯增高（P 均＜0.01）。非穴位組與模型組p62、Beclin-1 蛋白表達(dá)量相似。與模型組比較，針刺組ICH 大鼠腦組織p62 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），Beclin-1 蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)（P 均＜0.01）。見表3、插頁圖4。

圖4 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達(dá)量比較（n=10）

表3 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達(dá)量比較（±s ）

表3 各組ICH 大鼠腦組織p62、Beclin-1 蛋白表達(dá)量比較（±s ）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與非穴位組比較，▲P＜0.01；假手術(shù)組：模擬ICH 制備過程但不注血；模型組：自體血誘導(dǎo)ICH 模型；非穴位組：模型組基礎(chǔ)上予針刺非穴位干預(yù)；針刺組：模型組基礎(chǔ)上予針刺“百會(huì)”透“曲鬢”干預(yù)；ICH：腦出血

4 討論

在氧化應(yīng)激或營養(yǎng)不足的情況下，細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)是通過降解受損的細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)的成分來維持的[9]。哺乳動(dòng)物Beclin-1 通過與III 型磷脂酰肌醇3-激酶相互作用，促進(jìn)磷脂酰肌醇3-磷酸的合成，從而促進(jìn)脂膜的延伸、貨物的募集和自噬小體的成熟，在自噬的形成中起著重要的作用[10-11]。p62 作為一種胞質(zhì)蛋白，是鏈接泛素化蛋白與自噬機(jī)制的重要調(diào)控分子[12]。當(dāng)自噬被激活時(shí)，溶酶體與自噬體結(jié)合，將自噬泡中自噬底物p62 以及其他蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解，使得p62 水平降低；反之，p62 水平升高[13]。

腦出血后的腦損傷與炎癥反應(yīng)、凋亡激活和氧化應(yīng)激有關(guān)，可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)元死亡[14]。近年研究表明，自噬途徑在腦出血后的損傷中也起著重要的作用，自噬的調(diào)節(jié)可能成為腦出血治療的新靶點(diǎn)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，ICH 后血腫周圍組織自噬被激活，從6h 開始，12～24h 達(dá)到高峰，3 天開始下降，7 天時(shí)自噬囊泡在神經(jīng)元內(nèi)高度聚集[16]。因此，自噬的激活可能在神經(jīng)細(xì)胞死亡和腦出血的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，自體血誘導(dǎo)ICH 大鼠能夠引起較嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損體征，并上調(diào)腦組織Beclin-1蛋白和p62 蛋白表達(dá)，提高自噬的水平。薈萃分析表明，基于百會(huì)穴針刺干預(yù)急性腦出血大鼠能改善神經(jīng)功能缺損評(píng)分，降低腦水含量[17]。與前期研究相一致，針刺干預(yù)可改善大鼠神經(jīng)功能缺損體征，同時(shí)提高ICH 后自噬水平（上調(diào)Beclin-1，下調(diào)p62）。此研究結(jié)果驗(yàn)證了針刺能夠上調(diào)ICH 大鼠自噬水平，并發(fā)揮其保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞作用。

綜上所述，腦出血后能夠引起自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的增高，而針刺干預(yù)能夠上調(diào)腦組織Beclin-1 蛋白，下調(diào)p62 蛋白表達(dá)，提高自噬水平，進(jìn)而改善大鼠神經(jīng)功能缺損體征。