新型骨髓誘導支架對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的體外評價

陳碩 陳昌禮 陳玲

【摘 ?要】背景：以往研究已經(jīng)證實，脫鈣骨基質(zhì)（Demineralized bone matrices， DBM）是骨修復重建一種很好的選擇。然而，DBMs有限的骨誘導能力不足以更好地修復骨缺損。成骨細胞（Osteoblasts， OBs）是骨組織的主要細胞成分，在新骨的形成中起著重要作用。 OB的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）是骨形成的主要成分之一。目的：本研究的目的是將DBM與OB的ECM相結(jié)合，以構(gòu)建可用于骨重建的新型支架材料。方法：本研究將OBs在DBMs的表面上培養(yǎng)10天后制備OBs-ECM-DBMs（OEDBMs）。評估了一系列材料特征，例如OB和ECM的殘留，OEDBMs的細胞毒性和骨誘導能力。結(jié)果：在OEDBMs中觀察到較低的細胞殘留和較低的DNA含量。與DBM相比，OEDBM具有更多的骨組織有機基質(zhì)蛋白，如骨鈣蛋白，骨橋蛋白和膠原蛋白I。當在兩種材料上培養(yǎng)時，大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSC）都具有良好的生存能力。與DBMs組相比，OEDBMs組中rBMSCs的成骨基因明顯上調(diào)。結(jié)論：上述結(jié)果表明OEDBMs用于骨組織工程中，具有很好的使用前景。

【關(guān)鍵詞】細胞外基質(zhì);骨誘導性;去礦質(zhì)骨基質(zhì);骨髓間充質(zhì)干細胞;成骨分化

【中圖分類號】R68???????【文獻標識碼】A??????【文章編號】1004-7484（2019）07-0116-02

引言

骨缺損是臨床常見的問題。由于脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrices， DBMs）具有較好的骨誘導潛能，其已成為修復骨缺損的研究熱點^[1]。然而在臨床骨缺損修復過程中，常常發(fā)現(xiàn)單獨使用DBM的效果十分有限^[2]。在更多的研究中，DBM通常與人體外源性細胞因子聯(lián)合作用于骨缺損的修復^[3]。然而，單個細胞因子對于骨形成并無特異性^[4]。已有的研究報道了特定細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）對干細胞分化的影響作用^[5]。作為骨骼的主要細胞成分，成骨細胞（osteoblasts， OBs）在骨骼發(fā)育中起著重要作用^[6]。OBs可以分泌大量有機基質(zhì)，如I型膠原（ collagen type I， COL I），骨橋蛋白（osteopontin， OPN）和骨鈣素（osteocalcin， OCN）等，這些胞外基質(zhì)成分已被證實與新骨形成有著十分緊密的聯(lián)系^[7]。因此，我們提出本研究的假設，OB所分泌的特定ECM是否能作為一種表面修飾的手段，從而增強DBM的成骨誘導潛能。為了驗證該假設，我們制備了ECM修飾后的DBM（OBDBMs），并評價了其一系列生物學特征，包括OBDBM所保留的基質(zhì)蛋白，細胞相容性以及其對于大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rat bone mesenchymal stem cells， rBMSCs）成骨分化的影響。

1?材料和方法

1.1 DBM的制備

根據(jù)已有的研究方法^[8]，我們制備了來源于牛皮質(zhì)骨的DBM。步驟如下：將骨條在室溫下置于0.6M HCl中處理72小時，得到DBM。然后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌DBM數(shù)次，直至pH為中性。完成洗滌后，采用冰凍切片機將所有樣品切成200μm并凍干。進行后續(xù)細胞實驗之前，所有樣品均采用環(huán)氧乙烷進行滅菌。

1.2 修飾后DBM的制備

為了制備修飾后的DBM（OBDBM），本研究將OBs以4.0×10⁴個細胞/ cm²的濃度接種于DBM的表面，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)。為了降低基質(zhì)材料的免疫原性，在培養(yǎng)10天后，我們采用含有20mM 氫氧化銨的0.5%Triton X-100處理5分鐘（37℃），脫掉OB ^[9]再用PBS洗滌3次以除去試劑殘留物。

1.3 dsDNA檢測

為評價OBDBM中的細胞殘留情況，本研究將DBMs（n = 5），OBs-DBMs（n = 5）和OBDBMs（n = 5）的樣品剪碎，經(jīng)金屬蛋白酶K消化后，采用酚抽提法獲得含有dsDNA的上清液。然后通過ds DNA試劑盒檢測DBMs，OBs-DBMs和OBDBMs的DNA含量。

1.4 細胞相容性評價

為了評估DBM和OBDBM的細胞相容性，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSC）接種于兩種基質(zhì)材料表面。分別于1天，2天，，3天采用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天，中國）對每組樣本行細胞毒性檢測。接種于孔板中的rBMSCs為對照組。

1.5 SDS-PAGE

為檢測OBDBM是否保留了部分OB分泌的ECM，本研究采用RIPA裂解液（碧云天，中國）提取了DBM（n=3）與OBDBM（n=3）的總蛋白。所提取總蛋白均通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（碧云天，中國）定量后，與5×SDS-PAGE樣品上樣緩沖液（碧云天，中國）混合，并在100℃下加熱5分鐘，以使所有蛋白質(zhì)變性。隨后，進行SDS-PAGE電泳。步驟如下：所有樣品均采用10%SDS-PAGE預制凝膠分離。電泳結(jié)束后，用考馬斯藍染色液對凝膠進行染色。采用凝膠成像儀（伯樂，美國）對DBM與OBDBM的蛋白條帶進行觀察和對比。

1.6 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction （RT-PCR）

為了評估OBDBM的骨誘導性，本研究將rBMSC（1.0×10^?5個細胞/ cm^?2）分別接種于DBM和OBDBM表面，培養(yǎng)7天。檢查rBMSCs中骨相關(guān)特異性基因的表達。本研究采用TRIzol提取各樣本的總RNA，并用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（百奧萊博，中國）完成逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應。相關(guān)特異性引物（表1），包括骨橋蛋白（osteonectin， ON），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）由生工生物科技合成（中國）。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀（伯樂，美國）下觀察目的基因條帶。

2?統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±S.D（標準偏差）表示，并使用SPSS 22.0進行分析。對于兩組比較，應用雙尾two-tailed Student t檢驗。對于多組比較，應用單因素方差分析。 P <0.05則差異有統(tǒng)計學意義。

3?結(jié)果

3.1 脫細胞效果

三組（圖1）的DNA含量分別為19.70±2.40 μg/ ng（DBM），153.77±10.93 μg/ ng（OBs-DBM）和23.10±2.12μg/ ng（OBDBM）。與OBs-DBM相比，DBM和OBDBM均有較低的DNA含量（p <0.01）。結(jié)果表明，兩次脫細胞處理均成功地去除了細胞。

3.2 細胞相容性評估

在所有的檢測時間點，三組的rBMSC均表現(xiàn)出良好活力，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖明顯（圖2），且組間未見顯著差異。這一結(jié)果表明兩種材料均具有良好的細胞相容性。

3.3 基質(zhì)蛋白的保留評估

通過SDS-PAGE檢測DBM和OBDBM的總蛋白情況可以發(fā)現(xiàn)，在保證樣品上樣量相同的條件下，OBDBM比DBM呈現(xiàn)更多的蛋白質(zhì)條帶（圖3）。在OBDBM中，可以在15kDa至170kDa的范圍內(nèi)清楚地觀察到豐富的蛋白質(zhì)條帶。相反，在DBM中僅顯示少量蛋白質(zhì)條帶（> 40kDa）。這一結(jié)果表明OBDBM在低細胞殘留的情況下保留了豐富的ECM。

3.4 OBDBM的骨誘導潛力

為了評估OBDBM的骨誘導能力，我們分析了接種于DBM和OBDBM表面7天后，rBMSC的ON，RUNX2和ALP的表達水平。從結(jié)果來看，與DBM組相比，OBDBM組的ALP與ON的表達水平均顯著上調(diào)（圖4）。

4?討論

在本研究中，我們制備了OBDBM。它具有低細胞殘留，良好的細胞相容性，豐富的基質(zhì)蛋白和更強的骨誘導潛力。

在OBDBM的制備過程中，存在兩個關(guān)鍵點：細胞殘留和ECM的保留。低免疫原性是良好支架的重要生物學特征。這種生物學特性依賴于有效的脫細胞處理^[10]。盡可能多的保留ECM可以部分模擬干細胞分化的特定微環(huán)境^[11]。本研究制備的DBM表現(xiàn)出非常低的細胞殘留，這與已有的相關(guān)研究結(jié)果一致^[12]。不同的是，在本研究中，我們?yōu)榱俗孫Bs分泌的ECM與DBM共同模擬骨形成的微環(huán)境，將OBs接種在DBM的表面。在此過程中，OB顯示出優(yōu)異的增殖能力并分泌豐富的ECM蛋白，但同時也再次帶來了免疫原性的風險，因此需要再次進行脫細胞處理。再次脫細胞處理后，H&E染色和DNA含量檢測的結(jié)果證明OBDBM中的細胞幾乎被完全除去。同時，SDS-PAGE結(jié)果顯示OB-ECM也被很好的保留了下來。

此外，細胞相容性也是本研究中OBDBM的生物學特性評價指標之一。以前的研究表明，DBM細胞毒性低，可以促進細胞增殖^[13]。在本研究中，MTT實驗的結(jié)果也證實了DBM和OBDBM具有相似的，良好的細胞相容性。

OBs分泌的基質(zhì)蛋白被認為是骨發(fā)育的重要成員。通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)DBM和OBDBM之間總蛋白有明顯的差異。 DBM僅保留了具有高分子量的蛋白質(zhì)，從條帶位置來看，可以判斷DBM中主要是膠原蛋白，而OBDBM含有更為豐富的蛋白質(zhì)條帶，具有更寬的分子量范圍。我們可以猜測OBDBM具有更多非膠原類蛋白，也正是這些大量的非膠原類蛋白模擬了骨發(fā)育的微環(huán)境。

BMSCs是一種多潛能的非造血骨髓細胞，通常被用作受損骨再生的種子細胞^[14]。以前的研究表明，在DBMs上培養(yǎng)的BMSCs有成骨分化的能力^[15]。值得注意的是，由于保留了大量的ECM蛋白，OBDBMs組在rBMSCs中表現(xiàn)出更高的ON和ALP表達水平。而這些基因是干細胞成骨的必需標志^[16]。因此，我們認為OBDBM在模擬骨發(fā)育微環(huán)境及促進干細胞成骨分化方面可能具有更大的優(yōu)勢。

綜上所述，我們制備了OBDBM并證實了其具備一系列良好的生物學特性，如低細胞殘留，保存完好的ECM蛋白，良好的細胞相容性和更強的骨誘導性。然而，在這項工作中尚未分析植入體內(nèi)后OBDBM的性能表現(xiàn)。因此，后續(xù)的研究將關(guān)注OBDBM用于骨缺損的修復的效果。

5?結(jié)論

本研究證實，OBDBM可保留較多的OB-ECM，具有低的細胞殘留。與DBM相比，對于rBMSC的成骨分化促進作用更強。因此，本研究認為OB-ECM可以用作修飾支架材料的工具，OBDBM也有望作為骨重建的生物支架應用于骨組織工程研究中。

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