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    miR-146a對(duì)甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8 的調(diào)節(jié)作用

    2019-10-21 09:28:55李凱軍陳俊
    關(guān)鍵詞:可抑制眼病眼眶

    李凱軍 陳俊

    摘要:目的:探討miR-146a對(duì)甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8的調(diào)節(jié)作用。方法:本研究設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組,通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得體外培養(yǎng)眼眶成纖維細(xì)胞,再利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細(xì)胞,過(guò)表達(dá)或抑制眼眶成纖維細(xì)胞miR-146a的表達(dá)水平,進(jìn)而通過(guò)ELISA法檢測(cè)IL-6和IL-8的表達(dá)水平。結(jié)果:TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞48h上清液中IL-6和IL-8水平明顯升高,結(jié)果與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞中,上調(diào)miR-146a表達(dá)水平,IL-6和IL-8水平下降(P<0.05);同時(shí),下調(diào)miR-146a表達(dá)水平,IL-6和IL-8水平升高(P<0.05)。結(jié)論:過(guò)表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá),同時(shí)抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)。

    關(guān)鍵詞:甲狀腺相關(guān)性眼病,眼眶成纖維細(xì)胞,miR-146a,IL-6,IL-8

    【中圖分類號(hào)】R581.3??? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A??? 【文章編號(hào)】2107-2306(2019)03-022-02

    引言

    甲狀腺相關(guān)性眼?。═hyroid-associated ophthalmopathy, TAO),是一種器官特異性自身免疫性疾病[1]。眼眶成纖維細(xì)胞是甲狀腺相關(guān)眼病的自身免疫靶點(diǎn)和效應(yīng)細(xì)胞[2]。IL-6是主要的促炎細(xì)胞因子[3]。成纖維細(xì)胞中IL-8的產(chǎn)生參與甲狀腺相關(guān)眼病炎癥進(jìn)展[4]。

    miR-146a是典型的多功能miRNA,參與免疫調(diào)節(jié),細(xì)胞增殖,分化,凋亡,細(xì)胞外基質(zhì)代謝和其他生命過(guò)程[5]。楊文娟等[6]發(fā)現(xiàn),甲狀腺相關(guān)眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量較正常人明顯下降。然而,miR-146a對(duì)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的影響仍不清楚。本研究旨在通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲取純化的眼眶成纖維細(xì)胞,利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細(xì)胞,過(guò)表達(dá)或抑制miR-146a的表達(dá)水平,進(jìn)而利用ELISA法檢測(cè)IL-6和IL-8的表達(dá)水平,探討miR-146a對(duì)甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8的調(diào)節(jié)作用。

    方法

    1.實(shí)驗(yàn)材料

    實(shí)驗(yàn)組:因暴露性角膜炎、壓迫性視神經(jīng)病變或限制性眼外肌病變行眼眶減壓術(shù)或斜視矯正術(shù)的甲狀腺相關(guān)眼病患者6例,術(shù)中取眼眶球后結(jié)締組織。

    對(duì)照組:因眼外傷等原因引起眼球萎縮行眼球摘除術(shù)及義眼座植入術(shù)以及二期義眼座植入術(shù)6例,術(shù)中取眼眶球后結(jié)締組織。

    1.慢病毒的構(gòu)建及慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細(xì)胞的條件

    本實(shí)驗(yàn)需要的含目的基因的重組慢病毒載體由上?;鶆P基因公司協(xié)助構(gòu)建完成,根據(jù)上?;鶆P基因公司所提供的慢病毒感染實(shí)驗(yàn)手冊(cè)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

    2.轉(zhuǎn)染后ELISA檢測(cè)眼眶成纖維細(xì)胞Il-6和IL-8的表達(dá)水平

    取生長(zhǎng)良好的眼眶成纖維細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,各組眼眶成纖維細(xì)胞按4x104/ml接種6孔板,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后,收集各組上清液,參照ELISA試劑盒使用說(shuō)明,檢測(cè)細(xì)胞上清液中Il-6和IL-8的表達(dá)水平。

    3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié)果轉(zhuǎn)染后ELISA檢測(cè)眼眶成纖維細(xì)胞Il-6和IL-8的表達(dá)水平

    TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞較正常眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8水平明顯升高,結(jié)果與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞中,上調(diào)miR-146a表達(dá)水平,IL-6和IL-8水平下降(P<0.05);同時(shí),下調(diào)miR-146a表達(dá)水平,IL-6和IL-8水平升高(P<0.05)。在正常人眼眶成纖維細(xì)胞,上調(diào)miR-146a表達(dá)水平,IL-6和IL-8水平下降(P<0.05);下調(diào)miR-146a表達(dá)水平,IL-8水平升高(P<0.05)。

    討論

    miR-146a是典型的多功能miRNA,參與免疫調(diào)節(jié),細(xì)胞增殖,分化,凋亡,細(xì)胞外基質(zhì)代謝和其他生命過(guò)程[7]。Sun等[8]通過(guò)qPCR比較甲狀腺相關(guān)眼病和非甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶脂肪組織中miR-146a的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)眼眶成纖維細(xì)胞中的炎性應(yīng)激能使miR-146a上調(diào)。楊文娟等[6]發(fā)現(xiàn),甲狀腺相關(guān)眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量較正常人明顯下降。然而,本實(shí)驗(yàn)研究TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞較正常眼眶成纖維細(xì)胞IL-6和IL-8水平明顯升高。由此可見,在自身免疫性疾病中,miR-146a的表達(dá)可能有不同的復(fù)雜機(jī)制。

    IL-6在甲狀腺相關(guān)眼病中也有重要的作用。已有研究表明,眼眶容量與IL-6mRNA的表達(dá)呈正相關(guān),與IL-4mRNA、IL-10mRNA呈負(fù)相關(guān)[9]。相較于非活動(dòng)性甲狀腺相關(guān)眼病患者,活動(dòng)性甲狀腺相關(guān)眼病患者血清IL-6和可溶性型IL-6受體濃度明顯升高[3]。Ning等[10]發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,甲狀腺相關(guān)眼病患者外周血的miR-146a的相對(duì)表達(dá)顯著增加,而Notch2的相對(duì)表達(dá)明顯降低,且 Notch2可以被miRNA-146a直接作為靶向目標(biāo)。外源性miRNA-146a模擬物可下調(diào)Notch2的表達(dá)和上調(diào)IL-6。抑制miRNA-146可以導(dǎo)致Notch2的表達(dá)升高和IL-6的表達(dá)降低。這些結(jié)果說(shuō)明miR-146a可通過(guò)直接靶向作用Notch2增加IL-6水平,從而促進(jìn)甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)展。在我們的研究中,過(guò)表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6的表達(dá),同時(shí)抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。

    IL-8是促炎趨化因子,具有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞沿著血管壁的聚集的作用[11]。在甲狀腺相關(guān)眼病中,各種類型的成纖維細(xì)胞以及這些細(xì)胞中IL-8的大量產(chǎn)生參與疾病炎癥進(jìn)展[12]。在眼眶炎癥中,眼眶成纖維細(xì)胞在一些細(xì)胞因子的刺激下,如IL-1β、TNF-α、脂多糖和IFN-γ,產(chǎn)生劑量依賴的IL-8和MCP-1[13]。在我們的研究中,過(guò)表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-8的表達(dá),同時(shí)抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-8的表達(dá)。

    過(guò)表達(dá)miR-146a可抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá),抑制miR-146a可促進(jìn)眼眶成纖維細(xì)胞中IL-6和IL-8的表達(dá)。提示miR-146a可能與甲狀腺相關(guān)眼病疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

    參考文獻(xiàn)

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