同時(shí)檢測茶葉中5種兒茶素和咖啡因的QuEChERS-HPLC方法研究

嚴(yán)開芹 曾小平 向君毅

摘 要：建立了一種同時(shí)測定茶葉中5種兒茶素兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）以及表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和咖啡因的QuEChERS-HPLC方法。茶葉樣品用70%甲醇水在70 ℃條件下水浴提取，混合使用25 mg乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、200 mg十八烷基硅烷（C18）作為吸附劑，凈化2 min;凈化液過膜后采用Thermo Fisher Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離。以甲醇-1.25%乙酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1 mL/min，測定波長278 nm。結(jié)果表明，5種兒茶素和咖啡因在各自相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)0.999 0～0.999 8），樣品加標(biāo)回收率為93.87%～107.37%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.45%～11.85%。該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，可滿足茶葉中兒茶素和咖啡因的分析要求。

關(guān)鍵詞：QuEChERS;高效液相色譜法;兒茶素;咖啡因

1 引言

茶多酚和生物堿是茶葉中重要的活性成分，兒茶素是茶多酚的主要成分，占茶多酚含量的60%～80%，也是主要的藥理活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用[1-4]，其中兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與表兒茶素沒食子酸酯（ECG）是影響茶葉品質(zhì)和質(zhì)量的重要指標(biāo)，國家標(biāo)準(zhǔn)[5]對(duì)綠茶中以上5種兒茶素的含量進(jìn)行了規(guī)定?？Х纫蚴巧飰A的主要組成成分，是茶葉重要的風(fēng)味物質(zhì)和生理活性成分，具有消除疲勞、興奮神經(jīng)的作用[6]，但人體過量攝入會(huì)產(chǎn)生不良影響[7]，同時(shí)，咖啡因也是影響茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，因而建立一種快速測定茶葉中兒茶素類和咖啡因的檢測方法很有必要。

目前，國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的兒茶素類和咖啡因的檢測方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[8-12]，但國家標(biāo)準(zhǔn)和一些文獻(xiàn)報(bào)道的方法存在流動(dòng)相復(fù)雜[13]、分析時(shí)間長和缺少樣品凈化步驟[14-15]等問題。而茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，除茶多酚和生物堿外，還含有色素、蠟質(zhì)等成分，這些成分不僅影響兒茶素類和咖啡因的檢測效果，還容易在色譜柱上殘留，造成柱壓升高、色譜柱污染、柱效降低等問題，影響儀器的后續(xù)使用;有些文獻(xiàn)報(bào)道了基于固相萃取的前處理凈化方法[16]，但該前處理方法存在商品化小柱價(jià)格昂貴、處理時(shí)間長、不能批量處理等缺點(diǎn)。而QuEChERS作為一種較新的前處理方法，具有快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全的特點(diǎn)，其原理是利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)的相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。本文針對(duì)國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中檢測兒茶素和咖啡因方法存在的缺陷，首次采用QuEChERS方法結(jié)合HPLC，建立了茶葉中兒茶素類和咖啡因的檢測方法，此方法具有操作簡單、準(zhǔn)確性高、流動(dòng)相系統(tǒng)簡單與分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，并能滿足分析的要求，能夠?yàn)椴枞~的等級(jí)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供更準(zhǔn)確的科學(xué)數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒 食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）與咖啡堿（CAF）購于中國廣州分析測試中心（規(guī)格均為20 mg/盒）;甲醇（色譜純），迪馬公司;乙二胺-N-丙基硅氧烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、氧化鋁（Al2O3）、石墨化炭黑（GCB），Agela Technologies公司;其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀（配有PDA檢測器）、Syncronis C18色譜柱（4.6 mm

×250 mm，5 μm），賽默飛公司;恒溫水浴鍋，上海精宏;離心機(jī)，長沙湘智。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品前處理

稱取0.2 g（精確到0.000 1 g）均勻磨碎的茶葉樣品試樣于50 mL離心管中，加入70 ℃下預(yù)熱過的70%甲醇溶液5 mL，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆驖駶櫍⒓匆迫?0 ℃水浴中浸提10 min（隔5 min攪拌一次），浸提后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入離心機(jī)，在3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min[17]，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中。殘?jiān)? mL的70%甲醇水溶液提取一次，重復(fù)上述操作，合并提取液，于容量瓶中定容至50 mL，搖勻。取上清液5 mL置于另一50 mL離心管中，加入吸附劑PSA 25 mg和C18 200 mg，渦旋2 min，3 500 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾待上機(jī)。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Syncronis C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-1.25%乙酸溶液;梯度洗脫程序（見表1）;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測波長：278 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.3 提取和凈化條件的優(yōu)化

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選取對(duì)兒茶素類和咖啡因含量影響最大的4個(gè)因素做正交實(shí)驗(yàn)，分別為：吸附劑的種類、含量、水浴溫度與提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以兒茶素類和咖啡因含量為指標(biāo)，采用L9（34），找出最佳的提取凈化條件。因素水平表見表2。

2.2.4 方法學(xué)考察

在上述優(yōu)化后的最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括線性關(guān)系、方法檢出限、方法定量限、加標(biāo)回收率、精密度。

回收率的計(jì)算公式如式（1）。

（1）

式（1）中：Z—回收率（%）;X—樣品中兒茶素類和咖啡因的含量（mg/kg）;M—空白樣品中兒茶素類和咖啡因的含量（mg/kg）;Y—樣品的加標(biāo)量（mg/kg）。

樣品中兒茶素類和咖啡因含量的計(jì)算公式見式（2）。

（2）

式（2）中：C—兒茶素類和咖啡因的含量，%;ρ—樣品中兒茶素類和咖啡因的濃度，μg/mL;m—樣品的稱樣量，g。

精密度的計(jì)算公式見式（3）（4）。

（3）

CV=（SD/X）×100（4）

式（3）（4）中：SD—標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）;X—樣品中兒茶素類和咖啡堿含量的平均值;N—測量次數(shù);CV—相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

3.1.1 提取溶劑的選擇

分別選取甲醇、乙醇、水對(duì)茶葉中的兒茶素類組分和咖啡因進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用純水作提取溶劑時(shí)，樣品提取不充分，兒茶素類組分和咖啡因提取含量僅為甲醇提取含量的60%;用乙醇作提取溶劑時(shí)，樣品提取液中有雜質(zhì)干擾，目標(biāo)峰峰型不呈正態(tài)分布;用甲醇作提取溶劑時(shí)，樣品中兒茶素類組分和咖啡因提取率更高，且各組分峰型均呈正態(tài)分布。

3.1.2 提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

分別選取20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇與100%甲醇對(duì)樣品中的兒茶素類組分和咖啡因進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～80%時(shí)，樣品中兒茶素類和咖啡因的含量隨著甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到100%時(shí)，樣品中兒茶素類和咖啡因的含量有降低趨勢。這可能是因?yàn)橄鄬?duì)于純甲醇溶劑，兒茶素和咖啡因更容易溶于甲醇水溶液。

3.1.3 提取溶劑的pH值的選擇

分別選取pH為2.5的80%甲醇、pH為4的80%甲醇、pH為6的80%甲醇與pH為7.5的80%甲醇對(duì)樣品中的兒茶素類組分和咖啡因進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH在4～6時(shí)，樣品中的5種兒茶素類和咖啡因較穩(wěn)定，當(dāng)pH<4時(shí)，EGC含量降低較多，pH>6時(shí)，EGC和EGCG含量降低明顯。

3.1.4 凈化劑種類和含量的選擇

分別選取PSA、C18、Al2O3、GCB 4種凈化劑，在4個(gè)用量水平（50、100、200 mg與400 mg）下對(duì)樣品進(jìn)行凈化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用GCB和Al2O3凈化時(shí)，隨著用量的增加，對(duì)5種兒茶

素和咖啡因的吸附均越來越強(qiáng)，5種兒茶素和咖啡因提取量下降明顯。C18對(duì)5種兒茶素和咖啡因的吸附作用較弱，當(dāng)C18含量為200 mg時(shí)，凈化液顏色較淺，C18含量小于200 mg時(shí)，凈化液顏色較深;PSA在50 mg時(shí)對(duì)5種兒茶素和咖啡因的吸附作用較低，且隨著PSA含量的增加對(duì)5種兒茶素和咖啡因的吸附作用有遞增趨勢，見圖1;因此本實(shí)驗(yàn)選取C18和PSA作為凈化劑。

3.1.5 提取條件和凈化劑用量的優(yōu)化

采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)茶葉中5種兒茶素和咖啡因的提取條件和凈化劑用量進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)L9（34），以5種兒茶素和咖啡因的平均含量為考察指標(biāo)，結(jié)果見表2。

由R值大小可知，影響5種兒茶素和咖啡因回收率的因素順序?yàn)锳（甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）>C（PSA）>B（pH）>D（C18）。選擇各因素k值最大的水平，確定出茶葉最佳的提取和凈化條件為A3B1C1D2，即甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，pH值為4，PSA為25 mg，C18為200 mg，此時(shí)平均回收率為98.31%。

3.2 流動(dòng)相的選擇

采用梯度洗脫分別比較了國家標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)相[18]、甲醇-水、甲醇-1.25%乙酸銨溶液作為流動(dòng)相對(duì)6種目標(biāo)物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用國家標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)相[19]、甲醇-水時(shí)，6種目標(biāo)物不能完全分離，且有些物質(zhì)峰缺失，不能進(jìn)行有效洗脫;用甲醇-1.25%乙酸獲得的色譜圖見圖2。從圖2可以看出，5種兒茶素和咖啡因的分離效果好，分析時(shí)間短，各物質(zhì)峰分離度均大于1.5，且峰型較好。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系和方法檢出限

對(duì)5種兒茶素和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配制成濃度為1、5、20、50、100、200、500、800 μg/mL與1 000 μg/mL的工作液，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。由表3可知，5種兒茶素和咖啡因的線性現(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.999。

3.3.2 加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在0.2 g茶葉樣品中添加適量5種兒茶素和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加量設(shè)置3個(gè)平行，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見圖3和表4 。

結(jié)果表明，3份平行樣品中，5種兒茶素和咖啡因的平均回收率均大于93%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.45%～1.85%。

4 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)市售的茶葉（紅茶和綠茶）中的5種兒茶素和咖啡因進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表5。

從表5可看出，紅茶和綠茶均檢出5種兒茶素和咖啡因，其中兩類茶葉咖啡因含量相當(dāng)，紅茶在發(fā)酵過程中兒茶素發(fā)生氧化，5種兒茶素總量，尤其是EGCG明顯低于紅茶;此外同類品種不同等級(jí)的茶葉因加工工工藝不同，5種兒茶素含量也有較大差異。

5 結(jié)論

建立了茶葉中5種兒茶素（C、EC、EGC、EGCG、ECG）和咖啡因的QuEChERS-HPLC檢測方法，相比于國家標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法中采用的流動(dòng)相更簡單、分析時(shí)間更短，而且僅需12 min即可完成對(duì)樣品的分析，且分離度更好。該方法通過提高甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從而提高了兒茶素的含量，通過控制提取液pH，增加了兒茶素組份的穩(wěn)定性;與文獻(xiàn)報(bào)道的商品化固相萃取前處理凈化相比，QuEChERS方法可批量處理樣品、節(jié)約人力、且成本更低，優(yōu)勢明顯。因此本文所建立的方法具有快速、簡單、適用于批量處理及實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，為監(jiān)控茶葉質(zhì)量和為消費(fèi)者合理選擇提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]楊新，陳莉，盧紅梅，等.茶多酚提取與純化方法及其功能活性研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2019，40（5）：322-328，332.

[2]包蓉，谷欣瑩，陳佳.茶多酚提取純化及其功能特性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2018，24（10）：109-110，156.

[3]李軍，辛勤，楊雁.綠茶多酚藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2014，

14（1）：128-130.

[4]張曉夢，倪艷，李先榮.茶多酚的藥理作用研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2013，36（2）：157-160.

[5]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 14456.3-2016 綠茶 第3部分：中小葉種綠茶[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社.

[6]趙卉，杜曉.低咖啡堿茶的研究進(jìn)展[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008

（4）：564-568.

[7] Nawrot P， Jordan S， Eastwood J， Rotstein J， et al. Effects of caffeine on human health[J]. Food Additives & Contaminants： Part A，2003，20（1）.

[8][13][17][18][19]國家市場監(jiān)督管理總局.GB/T 8313-2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[9]段聯(lián)勃，李娟，徐杰，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定武夷巖茶中咖啡堿、茶氨酸和兒茶素[J].中國茶葉，2019，41（7）：38-42.

[10]支紅峰，楊璐，胡中豪，等.超高效液相色譜同時(shí)測定綠茶中10種活性物質(zhì)[J].食品工業(yè)，2019，40（2）：306-309.

[11]Rahim A A， Nofrizal S， Saad B. Rapid tea catechins and caffeine determination by HPLC using microwave-assisted extraction and silica monolithic column[J]. Food Chemistry，2014（147）：262-268.

[12] Dilanka C， Preethi S. Simple isocratic method for simultaneous determination of caffeine and catechins in tea products by HPLC[J]. SpringerPlus，2016，5（1）：970.

[14]高俊，夏濤，朱博，等.HPLC-PDA對(duì)茶葉中茶氨酸、兒茶素和生物堿的同時(shí)分離檢測研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（3）：324-328.

[15]劉臣，張雷，劉婧，等.反相高效液相色譜法同時(shí)測定碧螺春茶中4種兒茶素類化合物及咖啡因含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（12）：7425-7427.

[16]朱媛，施梅，陳昌云.固相萃取-高效液相色譜法測定茶葉中兒茶素[J].南京曉莊學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（3）：46-48，60.