酶比色法和雷氏鹽分光光度法在測定嬰幼兒乳粉中膽堿的比較

劉旻雯

摘 要：關(guān)于嬰兒食品和乳品中膽堿測量的最新國家標(biāo)準(zhǔn)相比較之前的在測量方法上增加了第二法雷氏鹽分光光度法，為了研究第一法酶比色法與第二法雷氏鹽分光光度法，對這兩個方法進(jìn)行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法的試驗結(jié)果相近，酶比色法適合大批樣品，操作更簡單，但成本較高;雷氏鹽分光光度法的試驗條件以及成本條件更適合大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)。

關(guān)鍵詞：膽堿;酶比色法;雷氏鹽分光光度法

Abstract：According to the latest about the measurement of the choline in baby food and milk products national standard compared to before on the measuring method of increased light redwood salt spectrophotometry， the second method to study the method of enzyme colorimetry and the second Rays salt spectrophotometry， light to comparison of these two methods， found that the test results of two methods， enzymatic colorimetric method is suitable for a large number of samples， operating more simple， but the cost is higher; The test conditions and cost conditions of Rays salt spectrophotometry are more suitable for most production enterprises.

Key words：Choline; Enzyme colorimetry; Rays salt spectrophotometry

中圖分類號：TS207.3

膽堿是人們?nèi)粘Ｉ钪斜仨殧z入的有機(jī)堿性物質(zhì)，可為機(jī)體提供可變甲基，從而作用于合成甲基的產(chǎn)物，不但存在于卵磷脂中，也大量存在于神經(jīng)鞘磷脂中。在平時飲食中，攝入合適的膽堿有益身體健康：①降低血清膽固醇含量。②加速體內(nèi)甲基代謝。③加速脂肪代謝。④控制細(xì)胞的死亡。⑤保證信息傳遞。⑥保證腦細(xì)胞的合理的分裂、分化，同時增強(qiáng)記憶力。

胎兒大腦的海馬體在孕婦懷孕25周以后開始發(fā)育，持續(xù)到小孩4周歲。胎兒的營養(yǎng)攝入取決于孕婦的飲食習(xí)慣，為了使胎兒的大腦正常發(fā)育，在孕婦還未分娩之前，即在胎兒大腦正處于海馬體發(fā)育階段，孕婦應(yīng)根據(jù)相關(guān)的要求飲食過程中需要攝入含有一定量膽堿的物質(zhì)，如果在這階段孕婦攝入的膽堿量不夠或者沒有增加含有膽堿的物質(zhì)，則會嚴(yán)重影響胎兒的腦部發(fā)育，會使胎兒腦部細(xì)胞無法正常分裂和分化，最終會導(dǎo)致生下的幼兒存在一定的大腦缺陷，但膽堿的攝入量也不易過多[1-2]。通過查詢《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》指導(dǎo)書，可知我國孕婦在其分娩前應(yīng)保證每天需要攝入500 mg的膽堿。為了確保孕婦膽堿量的攝入量，我國也推出一款專門為孕婦飲用的奶粉。

從生物化學(xué)角度分析，膽堿屬于堿性很強(qiáng)且?guī)в姓姾傻奈镔|(zhì)，其化合價為四價，是所有生物膜的組成成分和膽堿能神經(jīng)元中乙酰膽堿的前體。膽堿性質(zhì)的穩(wěn)定性與所處的環(huán)境有關(guān)，它在空氣中遇熱容易分解，容易吸收CO2，但是它在酸性溶液中對熱穩(wěn)定，吸水能力超強(qiáng)。膽堿味辛而苦，在日常生活中的形態(tài)多為黏性液體或者結(jié)晶固體，能夠和水、醇類化學(xué)物質(zhì)相溶。

本文通過檢測原理、試劑與儀器、檢測步驟、結(jié)果比較等幾個方面，以奶粉中膽堿的測定為例，對酶比色法和雷氏鹽分光光度法進(jìn)行比較，以便食品檢測人員更好的開展奶粉中膽堿的檢測工作。

1 檢測原理

1.1 酶比色法

根據(jù)膽堿在酸性溶液中對熱穩(wěn)定的性質(zhì)，首先將其溶解在酸性溶液中，然后變成游離態(tài)的膽堿，然后在溶液中加入酶氧化劑，使其氧化的產(chǎn)物與發(fā)色劑發(fā)生反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，在合理的膽堿濃度范圍內(nèi)，生成物顏色的深淺與膽堿含量成正比的線性關(guān)系[3]。

1.2 雷氏鹽分光光度法

利用氫氧化鋇與甲醇以及三氯甲烷的混合液對需要測定的樣品進(jìn)行水解，然后利用弗羅里硅士層析凈化，然后與雷納克銨鹽溶液發(fā)生反應(yīng)，形成帶顏色的膽堿雷納克銨鹽，再利用丙酮溶液洗出其他的物質(zhì)，最后用波長為526 nm的波來測定物質(zhì)的吸收值，在合理的膽堿濃度范圍內(nèi)，生成物顏色的深淺與膽堿含量成正比的線性關(guān)系。

2 試劑與儀器

2.1 酶比色法

三羥甲基氨基甲烷、苯酚、濃鹽酸、氫氧化鈉、膽堿氧化酶、過氧化物酶、4-氨基安替比林、磷脂酶D、pH計、分光光度計[3]。

2.2 雷氏鹽分光光度法

氫氧化鋇、甲醇、三氯甲烷、弗羅里硅土、丙酮、雷納克銨鹽、冰乙酸、乙酸甲酯、分光光度計。

3 操作步驟

3.1 酶比色法

取5 g實驗樣品奶粉，將其輕輕倒入100 mL錐形瓶中，并且注入30 mL的鹽酸溶液，蓋上錐形瓶的蓋子，將錐形瓶放在70 ℃熱水中水解3 h，期間每隔30 min搖晃一次，最后冷卻。用氫氧化鈉溶液將錐形瓶中溶液的pH值調(diào)到3.5～4.0，然后將錐形瓶內(nèi)混合液倒入容量為50 mL的容量瓶中，并加入蒸餾水定容，用濾紙過濾水解液至100 mL燒杯中。取4個容量為10 mL的容量瓶，分別加入2、4、6、8 mL的膽堿氫氧化物標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別加入蒸餾水，稀釋至

10 mL，濃度分別為50、100、150、200 μg/100 mL。再取出6支試管，其中一個試管用來存放空白試劑（A），剩下5支試管，編上好試管的順序（1、2、3、4、5），分別用來存放標(biāo)準(zhǔn)溶液以及稀釋的溶液，按表1加入試劑。將每個試樣準(zhǔn)備2支試管（B、C），試管B加0.1 mL待分析濾液和3 mL蒸餾水，試管C加0.1 mL待分析濾液和3 mL發(fā)色劑。使用密封膜封住試管（1、2、3、4、5、A、B、C），把試管中的混合物搖勻，然后置試管于37 ℃的水中反應(yīng)15 min，然后冷卻到室溫。為了忽略蒸餾水吸光值的影響，在波長505 nm處單獨測量蒸餾水吸光值。測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液在

505 nm波長處的吸光值，以6支試管的膽堿溶液濃度為橫坐標(biāo)、縱吸光值減去蒸餾水吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 雷氏鹽分光光度法

量取重量為10 g的試樣裝入到錐形瓶中，然后量取50 mL的氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷提取液倒入錐形瓶中和試樣溶液進(jìn)行混合，待其混合均勻后，通過相應(yīng)膠管和回流裝置進(jìn)行連接，連接完成后，將整體放入到（79±2）℃的水浴鍋內(nèi)，水解抽提4 h并且每隔1 h需要振蕩一次，防止試樣結(jié)成塊狀。結(jié)束后，隨即取出錐形瓶并且使其冷卻到室內(nèi)溫度，進(jìn)行過濾，不可通過過濾裝置的物體使用冰乙酸甲醇混合液清洗三四次，洗滌后的溶液進(jìn)行收集，并且裝入到100 mL的容量瓶中，然后加入一定量的甲醇溶液定容，隨即搖動直到溶液均勻混合為止。在滴頭和層析柱之間使用專門的膠管連接，完成連接后，需要使用脫脂棉覆蓋到層析柱底部，并且在脫脂棉表面倒入5 cm厚度的弗羅里硅土，使用甲醇潤濕。依次把10 mL的試樣水解液和標(biāo)準(zhǔn)的膽堿溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL澆在層析柱上，待溶液完全流到柱床上時，利用5 mL和10 mL甲醇、20 mL乙酸甲酯清洗層析柱。然后在這基礎(chǔ)上加入5 mL的雷納克銨鹽溶液，再利用冰乙酸洗掉殘余的雷納克銨鹽，直到層析柱展現(xiàn)硅土原有的白色，然后再用丙酮清洗膽堿雷納克銨鹽，洗后的溶液收集在10 mL的瓶子中，測定526 nm處的吸光值，繪制曲線。其中橫坐標(biāo)為膽堿酒石酸氫鹽含量，縱坐標(biāo)為標(biāo)吸光值。

4 結(jié)果與分析

4.1 酶比色法

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

酶比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。酶比色法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.002 8x，R2=0.998 9，線性關(guān)系良好。

4.1.2 精密度試驗

對試樣奶粉重復(fù)6次測定，結(jié)果如表2。由表3實驗結(jié)果計算可得，6次檢測結(jié)果的平均值為158.64 mg/100 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.66%。

4.2 雷氏鹽分光光度法

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

雷氏鹽分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。雷氏鹽分光光度法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.037 4x，R2=0.999 2，線性關(guān)系良好。

4.2.2 精密度試驗

對試樣奶粉重復(fù)6次測定，結(jié)果如表3。由表3實驗結(jié)果計算可得，6次檢測結(jié)果的平均值為156.03 mg/100 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.32%。

5 結(jié)論

相比之下，酶比色法和雷氏鹽分光光度法對于試樣奶粉的測試結(jié)果相近，標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度試驗均能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的要求。相較于雷氏鹽分光光度法而言，酶比色法操作步驟相對更簡單，水解后，只需要配制酶顯色溶液即可上機(jī)測定，而雷氏鹽分光光度法需要制備層析柱，水解后，試樣溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液都要過柱之后才能上機(jī)測定;酶比色法水解時間相對要短，且水解時只需加蓋至于水浴內(nèi)，不需要連接回流裝置，樣品數(shù)量不受制于回流裝置，更適合大量樣品的處理。酶比色法有成批量、快捷、簡單的優(yōu)點。然而，酶比色法實驗中需要用到3種酶，且都需要進(jìn)口，對于生產(chǎn)企業(yè)而言，成本過高。而雷氏鹽分光光度法所用試劑皆為常規(guī)試劑，也不需要特殊的儀器設(shè)備，操作步驟也算簡便，一般實驗室都具備試驗條件，成本相對要低很多，更適合于大多數(shù)乳品生產(chǎn)企業(yè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉美霞，李 紅，王 佳，等.乳粉中膽堿含量檢測方法的研究[J].中外食品，2014（6）：38-43.

[2]趙紅霞，郝萬清.雷氏鹽比色法檢測嬰幼兒配方乳粉中膽堿含量[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2012，35（2）：41-43.

[3]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 5413.20-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[4]尹鳳芝，張 慧.嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定——雷氏鹽分光光度法[J].生命科學(xué)儀器，2013，11（1）：54-57.