兩種重組蛋氨酸酶表達(dá)條件優(yōu)化及其對人肺腺癌細(xì)胞GLC的抑制作用研究

羅沈強(qiáng) 田長富

摘 要 目的：優(yōu)化兩種重組蛋氨酸酶表達(dá)的誘導(dǎo)條件，并探討其對宣威人肺腺癌細(xì)胞GLC的抑制作用。方法：將重組蛋氨酸酶表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T1-4A1-MGL和PGEX-4T1-3B8-MGL轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)。以目標(biāo)蛋白表達(dá)量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對誘導(dǎo)前菌液起始光密度（OD600 nm）值、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。采用親和層析法對所得重組蛋氨酸酶4A1-MGL、3B8-MGL進(jìn)行純化；采用考馬斯藍(lán)法檢測其質(zhì)量濃度，十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測其純度，分光光度法檢測其活性。采用MTT法檢測經(jīng)低、中、高劑量重組蛋氨酸酶（4A1-MGL和3B8-MGL分別均為0.1、0.2、0.4 U/mL）作用24、48、72 h后的細(xì)胞增殖情況，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。結(jié)果：兩種重組蛋氨酸酶表達(dá)的最優(yōu)誘導(dǎo)條件為菌液起始OD600 nm值0.9、培養(yǎng)溫度37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間5 h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，4A1-MGL、3B8-MGL的蛋白表達(dá)量分別為1.52±0.04、1.28±0.03（RSD<3%，n=3）。經(jīng)純化后，4A1-MGL的質(zhì)量濃度為（0.70±0.02）mg/mL，純度為（96.42±3.15）%，活性為（0.45±0.02）U/mg；3B8-MGL的質(zhì)量濃度為（0.56±0.02）mg/mL，純度為（97.43±2.96）%，活性為（0.91±0.03）U/mg。經(jīng)低、中劑量4A1-MGL和3B8-MGL作用48、72 h，高劑量4A1-MGL和3B8-MGL作用24、48、72 h后，GLC細(xì)胞的抑制率均顯著升高，且高劑量組作用72 h時(shí)顯著高于同時(shí)間點(diǎn)低、中劑量組（P<0.05）。結(jié)論：本研究成功優(yōu)化了重組蛋氨酸酶表達(dá)的誘導(dǎo)條件，所得4A1-MGL和3B8-MGL可劑量依賴性地抑制GLC細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞 重組蛋氨酸酶；誘導(dǎo)條件；單因素試驗(yàn)；GLC細(xì)胞；抑制作用

Study on Expression Condition Optimization of Two Recombinant Methioninases and Their Inhibitory Effects on Human Lung Adenocarcinoma Cells GLC

LUO Shenqiang1，TIAN Changfu2[1. Dept. of Pharmacy， the Third Affiliated Hospital of Chongqing Medical University（Gener Hospital）， Chongqing 401120， China； 2. Scientific Research and Experiment Center， Kunming Medical University， Kunming 650500， China]

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the expression induction condition of two recombinant methioninases， and to investigate their inhibitory effects on the proliferation of human lung adenocarcinoma cells GLC. METHODS： Recombinant methioninases expression plasmid PGEX-4T1-4A1-MGL and PGEX-4T1-3B8-MGL were transfected into competent Escherichia coli Dh5α， and induced by isopropyl-β-D-thiogalactoside. Using the expression level of target protein as index， the initial OD600 nm value before induction， culture temperature and induction time were optimized by single factor test. The recombinant methioninase 4A1-MGL and 3B8-MGL were purified by affinity chromatography. The concentration of recombinant methioninase was detected by Coomassie blue method. The purity of the product was detected by sodium lauryl benzene sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis； its activity was detected by spectrophotometry. The proliferation of cells was detected by MTT assay after treated with low-dose， medium-dose and high-dose of recombinant methioninases （4A1-MGL or 3B8-MGL was 0.1， 0.2， 0.4 U/mL） for 24， 48， 74 h. Inhibitory rate of cells were calculated. RESULTS： The optimal induction condition of two recombinant methioninases included that initial OD600 nm of 0.9， culture temperature of 37 ℃， induction time of 5 h. The results of validation test showed that protein expression level of 4A1-MGL was 1.52±0.04， that of 3B8-MGL was 1.28±0.03 （RSD<3%，n=3）. After purification， the concentration， purity and activity of 4A1-MGL were （0.70±0.02）mg/mL， （96.42±3.15）% and （0.45±0.02） U/mg； and those of 3B8-MGL were （0.56±0.02）mg/mL， （97.43±2.96）% and （0.91±0.03）U/mg. After treated with low-dose and medium-dose of 4A1-MGL and 3B8-MGL for 48 and 72 h， treated with high-dose of 4A1-MGL and 3B8-MGL for 24， 48 and 72 h， inhibitory rate of GLC cell was increased significantly， and high-dose group for 72 h was significantly higher than low-dose and medium-dose groups at same time point （P<0.05）. CONCLUSIONS： The induction conditions of recombinant methioninase expression are successfully optimized in this study. The obtained 4A1-MGL and 3B8-MGL could inhibit the proliferation of GLC cells in a dose-dependent manner.

KEYWORDS Recombinant methioninase； Induction condition； Single factor test； GLC cells； Inhibitory effect

蛋氨酸（Methionine）是哺乳類動物正常發(fā)育和成長所必需的氨基酸，且不能自身合成，必須從食物中攝?。煌瑫r(shí)，蛋氨酸也是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞生長所必需的氨基酸[1]。絕大部分腫瘤細(xì)胞（包括乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、腎癌、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌等）的一個(gè)共同特點(diǎn)是對蛋氨酸的絕對需求，這種現(xiàn)象被稱為“蛋氨酸依賴”[2]。蛋氨酸的代謝受蛋氨酸酶（Methionase）的調(diào)控，后者可消除機(jī)體內(nèi)的蛋氨酸；當(dāng)該酶活性受到抑制時(shí)，正常細(xì)胞還能通過高半胱氨酸甲基化途徑獲取蛋氨酸，而腫瘤細(xì)胞則不能，可見蛋氨酸酶的抑制不會影響正常細(xì)胞，但可影響腫瘤細(xì)胞的增殖，故有望成為新一代的抗腫瘤藥物[3]。

蛋氨酸酶具有旋光性，在動物體內(nèi)L型易被腸壁吸收，而D型需轉(zhuǎn)化為L型才能參與蛋白質(zhì)的合成[4]。其中，L-蛋氨酸酶γ-裂解酶（L-methionine-γ-lyase，MGL）包括真核和原核兩種類型，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[5]。本課題組前期通過分子克隆技術(shù)，將陰道毛滴蟲中兩種真核類型的蛋氨酸酶基因片段（4A1和3B8）分別連接至以谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)記的原核表達(dá)載體PGEX-4T1中，成功構(gòu)建了兩種真核類型的重組蛋氨酸酶表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T1-4A1-MGL和PGEX-4T1- 3B8-MGL[6]。本研究在此基礎(chǔ)上，擬將這兩種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感受態(tài)大腸桿菌Dh5α中，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析法純化，得到兩種重組蛋氨酸酶4A1-MGL和3B8-MGL；通過檢測上述兩種重組蛋氨酸酶的濃度、純度、活性以及其對宣威人肺腺癌細(xì)胞GLC的抑制率，初步探討其對肺腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，以期為后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)的深入開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

ND-1000型微量核酸蛋白定量儀（美國NanoDrop公司）；PectraMax190型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；VCX130型超聲波組織粉碎儀（美國Sonic公司）；Universal Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio Rad公司）；U3010型紫外分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；5702型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）；DYY-8C型電泳儀、DYCP-31D型垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）；TS-8型搖床（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠）；PH100-2A41L-A型顯微鏡（美國Pherix公司）；DM2500型熒光顯微鏡（德國Leica公司）；TP-2101型精密天平（美國Denver Instrument公司）。

1.2 藥品與試劑

蛋氨酸酶對照品（批號：M2570-1VL，純度：>99.9%）、Maker（批號：D531A D）、L-蛋氨酸均購自日本Takara公司；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA，北京華美生科生物技術(shù)有限公司，批號：CSB-E08633h）；10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：130412-140）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：C11875500B）；注射用氨芐西林鈉（哈爾濱制藥總廠，批號：16030902-1，規(guī)格：按C16H19N3O4S計(jì)算1.0 g）；IPTG（批號：927C054）、考馬斯亮藍(lán)R250染色液（批號：201205412）、考馬斯亮藍(lán)脫色液（批號：201203785）均購自上海索萊寶生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽（批號：EC05BA0037）、LB培養(yǎng)基（批號：EB13KA0181）、苯甲基磺酰氟裂解保護(hù)液（批號：D120BA0007）、MTT檢測試劑盒（批號：D410FA0001）、GST Resin型凝膠純化柱（1 cm×0.6 cm，50 μm）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液、3-甲基-2-苯并噻唑腙（MBTH）、磷酸吡哆醛均購自美國Sigma公司；pH 7.4磷酸鹽緩沖液[PBS，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司]；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 原核表達(dá)載體、菌株與細(xì)胞

原核表達(dá)載體PGEX-4T1由香港中文大學(xué)孔祥後教授惠贈；感受態(tài)大腸桿菌Dh5α（編號：D9017A）購自寶生物工程科技有限公司；宣威人肺腺癌GLC細(xì)胞株由昆明醫(yī)科大學(xué)郝萍教授惠贈。

2 方法與結(jié)果

2.1 重組蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

2.1.1 重組蛋氨酸酶的轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)表達(dá) 參考本課題組前期研究，將陰道毛滴蟲中兩種真核類型的蛋氨酸酶基因片段（4A1和3B8）分別連接至GST標(biāo)記的PGEX- 4T1中，構(gòu)建重組蛋氨酸酶表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T1-4A1- MGL和PGEX-4T1-3B8-MGL。分別將上述兩種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌DH5α中，挑取單個(gè)菌落置于含氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)基7 mL中，置于搖床中，于適宜溫度下以180 r/min培養(yǎng)過夜；隨后將菌落轉(zhuǎn)移至LB培養(yǎng)基100 mL中，使用紫外分光光度計(jì)于600 nm波長處檢測其光密度（OD）值（即菌液起始OD600 nm值），然后加入IPTG適量（終濃度為0.6 mmol/L），誘導(dǎo)適宜時(shí)間，直至菌液OD600 nm值約等于2，收集菌液，于4 ℃保存。將上述菌液以3 000 r/min離心10 min，沉淀用PBS重懸（每0.1克沉淀使用PBS 6 mL）于試管中，并加入0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟裂解保護(hù)液適量，在冰浴中超聲（功率：200 W，頻率：25 kHz）裂解，每超聲3 s停止4 s，共循環(huán)30次。使用顯微鏡觀察直至無桿狀菌體出現(xiàn)（即破碎率達(dá)90%以上）。將菌液于4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，直至上清液清亮且無黑色碳化物出現(xiàn)時(shí)，收集上清液，備用。

2.1.2 重組蛋氨酸酶表達(dá)量的檢測 參考文獻(xiàn)[7]方法檢測重組蛋氨酸激酶的表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。取待測蛋白上清液、Marker（1.0 mg/mL）各10 μL，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（濃縮膠電壓：80 V，分離膠電壓：100 V），以考馬斯亮藍(lán)R250染色60 min后，以考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色90 min，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像。使用Image Lab 3.0軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與Marker條帶的灰度值比值來表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

2.1.3 誘導(dǎo)條件優(yōu)化 參考文獻(xiàn)[8]，以目標(biāo)蛋白（重組蛋氨酸酶4A1-MGL）表達(dá)量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對誘導(dǎo)前菌液起始OD600 nm值、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化（該優(yōu)化條件也適用于3B8-MGL[9]）。

①菌液起始OD600 nm值：將誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)為5 h，培養(yǎng)溫度設(shè)為37 ℃，其余操作同“2.1.1”項(xiàng)，考察不同起始OD600 nm值（0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6）對4A1-MGL蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)起始OD600 nm值為0.9時(shí)，4A1-MGL蛋白的表達(dá)量最高；而當(dāng)起始OD600 nm值≥1.0時(shí)，4A1-MGL蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢，詳見圖1、表1。故最終選擇菌液起始OD600 nm值為0.9。

②培養(yǎng)溫度：將菌液起始OD600 nm值設(shè)為0.9，誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)為5 h，其余操作同“2.1.1”項(xiàng)，考察不同培養(yǎng)溫度（35、37、39、41 ℃）對4A1-MGL蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，4A1-MGL蛋白的表達(dá)量最高；而當(dāng)溫度>37 ℃時(shí)，4A1-MGL蛋白的表達(dá)量有所減少，詳見圖2、表1。故最終選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃。

③誘導(dǎo)時(shí)間：將菌液起始OD600 nm值設(shè)為0.9，培養(yǎng)溫度設(shè)為37 ℃，其余操作同“2.1.1”項(xiàng)，考察不同誘導(dǎo)時(shí)間（2、3、4、5、6 h）對4A1-MGL蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為2 h時(shí)，4A1-MGL蛋白的表達(dá)量最低；而當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為5 h時(shí)，4A1-MGL蛋白的表達(dá)量最高，詳見圖3、表1。故最終選擇誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述最優(yōu)條件（即起始OD600 nm值為0.9、培養(yǎng)溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為5 h）平行操作3次，按“2.1.2”項(xiàng)下方法檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。結(jié)果，4A1- MGL蛋白的表達(dá)量為1.52±0.04（RSD=2.63%，n=3），3B8-MGL蛋白的表達(dá)量為1.28±0.03（RSD=2.34%，n=3）。

2.2 重組蛋氨酸酶的純化

按“2.1”項(xiàng)下最優(yōu)條件誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋氨酸酶4A1- MGL和3B8-MGL后，取上清液各適量，以0.45 μm微孔濾膜濾過后，采用親和層析法以凝膠純化柱純化，加入洗脫緩沖液（pH 8.0；含20 mmol/L還原型谷胱甘肽、50 mmol/L Tris-鹽酸溶液，用水定容至50 mL）2 mL，以500 r/min離心1 min，即得純化后的重組蛋氨酸酶4A1-MGL和3B8-MGL溶液。上述產(chǎn)物均于4 ℃保存，待用。

2.3 重組蛋氨酸酶的濃度和純度測定

采用考馬斯亮藍(lán)法檢測重組蛋氨酸酶的質(zhì)量濃度[10]，試驗(yàn)重復(fù)3次。取標(biāo)準(zhǔn)BSA適量，用水配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以PBS為對照，取上述不同質(zhì)量濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL至96孔板中，依次加入PBS 5 μL和待測蛋氨酸酶溶液10 μL，隨后加入考馬斯亮藍(lán)R250染色液285 μL，顯色5 min后，以酶標(biāo)儀于595 nm波長處檢測其OD595 nm值。以標(biāo)準(zhǔn)BSA的質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、其OD595 nm值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸；精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性試驗(yàn)等方法學(xué)考察內(nèi)容見本課題組前期研究[11]。結(jié)果，回歸方程為y=0.350 0+1.484 0x（R2=0.951 6），表明標(biāo)準(zhǔn)BSA檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.1～1 mg/mL。根據(jù)回歸方程計(jì)算得4A1- MGL蛋白的質(zhì)量濃度為（0.70±0.02）mg/mL（RSD=2.86%，n=3），3B8-MGL蛋白的質(zhì)量濃度為（0.56±0.02）mg/mL（RSD=3.57%，n=3）。

重組蛋氨酸酶按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，采用Image Lab 3.0軟件分析目標(biāo)蛋白的純度[目標(biāo)蛋白純度=（目標(biāo)蛋白條帶的平均灰度值/目標(biāo)蛋白所在泳道各條帶的平均灰度值之和）×100%]，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果，測得4A1-MGL蛋白的純度為（96.42±3.15）%；3B8-MGL蛋白純度為（97.43±2.96）%。

2.4 重組蛋氨酸酶的活性測定

采用分光光度法檢測重組蛋氨酸酶的活性[12]，試驗(yàn)重復(fù)3次。取蛋氨酸酶對照品適量，以水為溶劑配制活性分別為1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 U/mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取待測蛋氨酸酶溶液50 μL，加至酶底液[每200 mL含100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）、25 mmol/L L-蛋氨酸、10 μmol/L磷酸吡哆醛]500 μL中，于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，后以4.5%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，于4 ℃下以10 000 r/min離心5 min；取上清液400 μL，加入1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.2）0.8 mL和0.05%MBTH溶液0.3 mL，混勻，于50 ℃水浴中反應(yīng)40 min，冷卻至室溫后，以紫外分光光度計(jì)于315 nm波長處檢測其OD315 nm值?？瞻讓φ战M把加入酶底液和三氯乙酸溶液的順序調(diào)換，其余操作同上。以蛋氨酸酶對照品的活性值（x，U/mg）為橫坐標(biāo)、其OD315 nm值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸；精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性試驗(yàn)等方法學(xué)考察內(nèi)容見本課題組前期研究[13]。結(jié)果，回歸方程為y=5.744 3x-0.005 3（R2=0.993 0），表明蛋氨酸酶檢測活性的線性范圍為0.062 5～1.0 U/mg。取兩種待測蛋白溶液各50 μL，同法測定OD315 nm值，并根據(jù)上述回歸方程計(jì)算，測得4A1- MGL蛋白的活性為（0.45±0.02）U/mg（RSD=4.44%，n=3），3B8-MGL蛋白的活性為（0.91±0.03）U/mg（RSD=3.30%，n=3）。

2.5 重組蛋氨酸酶對GLC細(xì)胞抑制率的檢測

采用MTT法檢測兩種重組蛋氨酸酶對GLC細(xì)胞的抑制作用，并計(jì)算細(xì)胞抑制率[14]，試驗(yàn)重復(fù)3次。將GLC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（下同）。取對數(shù)生長期的GLC細(xì)胞適量，以完全培養(yǎng)基重懸后，按5×103個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板（每孔100 μL）中，培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組（無細(xì)胞、無藥物）、對照組（有細(xì)胞、無藥物）和4A1-MGL、3B8- MGL不同劑量組（均設(shè)置低、中、高劑量，分別為0.1、0.2、0.4 U/mL，以完全培養(yǎng)基為溶劑；劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[15]），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。空白組、對照組分別加入完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基100 μL，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min。以酶標(biāo)儀于490 nm處測定各孔OD490 nm值，以空白組OD490 nm值調(diào)零后，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率[抑制率=（1-試驗(yàn)組平均OD490 nm值/對照組平均OD490 nm值）×100%]。采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)低、中劑量4A1-MGL和3B8-MGL作用48、72 h，高劑量4A1-MGL和3B8-MGL作用24、48、72 h后，GLC細(xì)胞的抑制率均顯著升高，且高劑量組作用72 h時(shí)顯著高于同時(shí)間點(diǎn)低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表2。

3 討論

蛋氨酸依賴是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的顯著特征，這種依賴是一種代謝缺陷，也是腫瘤選擇性治療的靶點(diǎn)之一，因此利用重組蛋氨酸酶去減少體內(nèi)蛋氨酸的生產(chǎn)已成為抗腫瘤基因治療藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一[16]。蛋氨酸酶是調(diào)控蛋氨酸表達(dá)的關(guān)鍵酶，本研究在重組蛋氨酸酶的基礎(chǔ)上，對其表達(dá)的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)以腫瘤細(xì)胞蛋氨酸依賴為原理，初步探討了重組蛋氨酸酶對GLC細(xì)胞的體外抑制作用。

有研究表明，不同的菌液起始OD600 nm值、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等條件對目的蛋白表達(dá)量的影響較大[7，17]：（1）誘導(dǎo)前的菌液濃度是影響蛋白表達(dá)量的主要因素之一，而起始OD600 nm值是反映其濃度的有效指標(biāo)；而且，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期也有利于蛋白的表達(dá)。（2）適宜的培養(yǎng)溫度可有利于蛋白產(chǎn)率的提高。（3）誘導(dǎo)時(shí)間是影響蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，其過短或過長均可導(dǎo)致蛋白產(chǎn)率偏低。鑒于此，本結(jié)果對上述3項(xiàng)因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)菌液起始OD600 nm值為0.9、培養(yǎng)溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為5 h時(shí)，重組蛋氨酸酶的表達(dá)量最多，為最優(yōu)誘導(dǎo)條件；驗(yàn)證試驗(yàn)所得4A1-MGL和3B8-MGL的蛋白表達(dá)量分別為1.52±0.04、1.28±0.03（RSD<3%）。

有研究指出，經(jīng)破碎離心后，重組蛋氨酸酶同時(shí)存在于包涵體沉淀和上清液中，若從沉淀中獲取所需蛋白，則存在包涵體沉淀不易復(fù)溶、復(fù)性效率不高、目標(biāo)蛋白得率偏低等問題[18]。本課題組在研究過程中發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒PGEX-4T1-4A1-MGL和PGEX-4T1-3B8-MGL表達(dá)的蛋氨酸酶主要以游離形式存在，故本研究選用了上清液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。隨后，本研究采用親和層析法以凝膠純化柱對重組蛋氨酸酶進(jìn)行了純化。其原理為：含目標(biāo)蛋白的上清液從凝膠純化柱中經(jīng)過，標(biāo)記的GST會被吸附在純化柱表面，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白與標(biāo)記蛋白的分離，減少了后者對目標(biāo)蛋白純度的影響[19]。經(jīng)純化后，本研究采用考馬斯亮藍(lán)法和SDS-PAGE電泳法分別檢測了重組蛋氨酸酶的濃度和活性。其中，考馬斯亮藍(lán)法的原理為：在酸性條件下，染料與待測蛋白結(jié)合，最大吸收波長將由465 nm變?yōu)?95 nm；且在檢測的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，待測蛋白和染料復(fù)合物的OD595 nm值與待測蛋白質(zhì)量濃度呈正比[10]。結(jié)果，所得4A1-MGL蛋白的質(zhì)量濃度為（0.70±0.02）mg/mL、純度為（96.42±3.15）%，3B8-MGL蛋白的質(zhì)量濃度為（0.56±0.02）mg/mL、純度為（97.43±2.96）%。本研究采用分光光度法檢測了所得重組蛋氨酸酶的活性。其原理為：蛋氨酸、蛋氨酸酶和磷酸吡哆醛反應(yīng)后可生成巰基甲烷、α-酮丁酸和氨，后兩者均可用以評價(jià)蛋氨酸酶的活性；同時(shí)考慮到α-酮丁酸在315 nm波長處有強(qiáng)烈的吸收峰，故本研究通過定量檢測α-酮丁酸的生成量來計(jì)算蛋氨酸酶的活性[20]。結(jié)果，所得4A1-MGL蛋白的活性為（0.45±0.02）U/mg，3B8-MGL蛋白活性為（0.91±0.03）U/mg。

本研究采用MTT法初步考察了兩種重組蛋氨酸酶對GLC細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)低、中劑量4A1-MGL和3B8-MGL作用48、72 h，高劑量4A1-MGL和3B8-MGL作用24、48、72 h后，GLC細(xì)胞的抑制率均顯著升高，且高劑量組作用72 h時(shí)顯著高于同時(shí)間點(diǎn)低、中劑量組。這提示經(jīng)不同劑量的3B8-MGL和4A1-MGL作用后，GLC細(xì)胞的增殖受到了不同程度的抑制，且這種作用具有一定的劑量依賴性。

綜上所述，本研究成功優(yōu)化了重組蛋氨酸酶表達(dá)的誘導(dǎo)條件，并純化得到4A1-MGL和3B8-MGL蛋白；兩種重組蛋氨酸酶對GLC細(xì)胞具有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。本研究可為后續(xù)蛋氨酸酶的抗腫瘤作用及機(jī)制分析奠定基礎(chǔ)。但本研究通過上清液途徑獲取的目標(biāo)蛋白表達(dá)總量較少，后續(xù)需解決包涵體沉淀不易溶解、復(fù)性效率不高等問題，從包涵體沉淀途徑獲取更多的所需蛋白；此外，蛋氨酸酶對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用還與其本身的活性、純度直接相關(guān)[21]，故后續(xù)研究仍需進(jìn)一步提高重組蛋氨酸酶的活性及純度。

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（收稿日期：2018-11-25 修回日期：2019-04-18）

（編輯：張?jiān)拢?/p>