HPLC法測(cè)定截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量方法探討

庫(kù)麗扎達(dá)·木拉提

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊 830063）

獸藥在保證動(dòng)物源性食品供應(yīng)方面發(fā)揮著巨大作用。隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題變得日益嚴(yán)重，多藥耐藥菌感染已成為威脅人類健康的重要問(wèn)題，截短側(cè)耳素類是具有較好抗菌活性的抗生素家族，對(duì)大部分革蘭氏陽(yáng)性菌以及部分革蘭氏陰性菌有良好的抑菌效果。截短側(cè)耳素發(fā)酵液具有毒性較低，對(duì)環(huán)境影響小等特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent1260(美國(guó)Agilent公司)；十萬(wàn)分之一天平（Mettler xs105）；5 mL一次性注射器。

1.2 試劑和試藥

甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司），乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司），水（超純水），高氯酸（分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司），碳酸銨（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為20170314，含量為99.7%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，截短側(cè)耳素發(fā)酵液（發(fā)酵放罐樣品）。

1.3 溶液的制備

1.3.1 高氯酸溶液（6%）

量取400 mL超純水置于500 mL容量瓶中，再用刻度吸管移取41.7 mL高氯酸（分析純）置于該容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻。

1.3.2 碳酸銨緩沖溶液（1%）

精確稱量10 g碳酸銨（分析純）置于1 000 mL容量瓶中，加入800 mL超純水溶解，用刻度吸管移取6%高氯酸溶液24 mL加入其中，再用超純水稀釋至刻度混勻，過(guò)濾，待用。

1.3.3 流動(dòng)相溶液

按照碳酸銨緩沖溶液（1%）：色譜級(jí)乙腈：色譜級(jí)甲醇28：23：49的比例混合均勻，再用0.45 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾，濾液置于所配體積的容量瓶中，超聲15 min脫氣，備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

精確稱量截短側(cè)耳素工作標(biāo)準(zhǔn)品適量（約0.1 g）（精確至0.0001 g）于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，超聲15 min，使之充分溶解，冷卻，定容，配成濃度為2 mg/mL的溶液，待用。

1.5 樣品溶液的制備

根據(jù)發(fā)酵周期，預(yù)估含量稱重，放入50 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相30 mL左右溶解，振蕩超聲15 min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相定容至50 mL，用微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾。

式中：m1—標(biāo)準(zhǔn)品重量（g）； a—標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 C18，4.6 mm×250 mm，5 μm,流動(dòng)相為碳酸銨緩沖溶液（1%）：色譜級(jí)乙腈：色譜級(jí)甲醇 28：23：49的比例混合均勻，再用0.45 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾，濾液置于所配體積的容量瓶中，超聲15 min脫氣，備用，流速為1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm，柱溫為30±3℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 檢測(cè)方法

首先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液兩針（1.4），記錄相關(guān)峰面積，再進(jìn)樣品溶液兩針（1.5），記錄相關(guān)峰面積，計(jì)算截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量（發(fā)酵350 h以上的效價(jià)，應(yīng)≥10 000 μg/g）。計(jì)算公式為

式中：S1—待測(cè)溶液色譜圖峰面積；S0—標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖峰面積；m0—標(biāo)準(zhǔn)品重量 （g）；m1—待測(cè)溶液重量（g）；A—標(biāo)準(zhǔn)品的含量（%）。 (結(jié)果見(jiàn)圖1、圖 2)

圖1 截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 截短側(cè)耳素發(fā)酵液樣品色譜圖

2.3 檢測(cè)結(jié)果

含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表1。

表1 含量測(cè)定結(jié)果表

2.4 精密度試驗(yàn)

取1.5項(xiàng)下截短側(cè)耳素樣品20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)6次，記錄色譜圖峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2，截短側(cè)耳素峰面積的RSD為0.13%，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)表

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取按1.5項(xiàng)制備的6份供試品，按2.1色譜條件分析，記錄色譜圖，計(jì)算含量，平均值為17 973.7 μg/mL，RSD為0.1%，表明該方法中截短側(cè)耳素的重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)表

3 討論

用該方法測(cè)定截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量，同一樣品平行測(cè)定6次，平均含量值為17976.6 μg/g，峰面積的RSD為0.13%；經(jīng)測(cè)定6個(gè)樣品含量平均值為17 973.7 μg/g；RSD為0.10%；截短側(cè)耳素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果RSD均在規(guī)定的范圍內(nèi)，靈敏度高，前處理簡(jiǎn)便，樣品較穩(wěn)定，符合規(guī)定。

用HPLC法測(cè)定截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量，適用范圍廣，方法合理、操作便捷，大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間。適合于截短側(cè)耳素發(fā)酵液的檢測(cè)，并控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，可作為截短側(cè)耳素發(fā)酵液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用于截短側(cè)耳素的含量測(cè)定，以控制、保證產(chǎn)品質(zhì)量。