三代EGFR-TKI奧希替尼(AZD9291)耐藥細(xì)胞系建立及耐藥標(biāo)志預(yù)測分析 *

苗留飛，楊 陽，余柏增，張家勛，李曉軍

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院/東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，南京 210002)

肺癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病首位[1]，約50%的亞洲非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者存在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)敏感突變[2]，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)已經(jīng)成為EGFR敏感突變陽性晚期NSCLC患者的一線治療藥物[3]。長期使用EGFR-TKI治療不可避免地產(chǎn)生獲得性耐藥[4-5]。第三代EGFR-TKI奧希替尼(osimertinib，AZD9291)針對EGFR T790M突變，被廣泛用于一代EGFR-TKI獲得性耐藥后替代治療[6]。AZD9291耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，未被完全明確，給臨床AZD9291耐藥后治療策略的選擇帶來困難。本研究通過自主構(gòu)建AZD9291耐藥細(xì)胞系PC9-OR，生物信息學(xué)挖掘GEO數(shù)據(jù)庫耐藥細(xì)胞表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選差異表達(dá)基因，構(gòu)建耐藥預(yù)測模型并評估其診斷效能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 PC9細(xì)胞系(購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)培養(yǎng)于含10 ml/dl胎牛血清(Gibco)RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)中，置于37℃，5%(v/v)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器 奧希替尼(AZD9291)購自Selleck公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；RNA提取(RNA isoplus)、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量(SYBR Green)試劑盒購自Takara公司；熒光定量PCR儀(ABI)；引物合成及Sanger測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 PC9細(xì)胞系驗(yàn)證：天根細(xì)胞DNA提取試劑盒提取PC9細(xì)胞DNA，經(jīng)相應(yīng)18，19，20，21號外顯子引物PCR擴(kuò)增后進(jìn)行sanger測序，與參考序列比對。

1.3.2 奧希替尼耐藥PC9細(xì)胞系構(gòu)建及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：奧希替尼起始濃度10 nmol/L，視細(xì)胞生長狀況隔兩周將藥物濃度翻倍，約5個(gè)月加至1 μmol/L，1 μmol/L維持兩周，CCK8檢測細(xì)胞IC50并計(jì)算耐藥指數(shù)RI(耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50)[7]。

1.3.3 利用qPCR技術(shù)檢測PC9和PC9-OR：首先RNAisoplus提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qPCR。以GAPDH為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.3.4 數(shù)據(jù)挖掘及可能耐藥基因檢測：三代EGFR-TKI耐藥細(xì)胞表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE106765[8]，GSE75602[9]和測序數(shù)據(jù)GSE103350。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行RMA標(biāo)準(zhǔn)化處理后經(jīng)過log2對數(shù)轉(zhuǎn)化。分別用limma包和DEseq2包分析差異表達(dá)基因，F(xiàn)C>2倍且P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.5 耐藥signature的構(gòu)建：利用logistics回歸構(gòu)建多個(gè)基因聯(lián)合診斷的回歸模型，ROC曲線在獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE34228中評價(jià)模型診斷效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 芯片和測序數(shù)據(jù)用R軟件分析處理，ROC曲線使用STATA軟件繪制，兩組之間計(jì)量數(shù)據(jù)使用studentttest檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC9細(xì)胞系鑒定 測序顯示，PC9細(xì)胞EGFR基因19號外顯子5個(gè)氨基酸缺失(ΔELREA)。

2.2 三代EGFR-TKI耐藥細(xì)胞系構(gòu)建 通過濃度梯度遞增加藥，構(gòu)建了對奧希替尼耐藥的細(xì)胞系PC9-OR，見圖1。PC9的IC50=0.006 1 μmol/L，PC9-OR的IC50>10 μmol/L，耐藥指數(shù)大于1 639。

圖1 PC9和PC9-OR耐藥細(xì)胞的IC50

2.3 差異表達(dá)基因的篩選與qPCR驗(yàn)證 利用GEO數(shù)據(jù)庫(GSE106765，GSE75602和GSE103350)，分析多個(gè)耐AZD9291細(xì)胞株差異基因，分別有47，372，45個(gè)表達(dá)上調(diào)基因。其中共同表達(dá)上調(diào)的3個(gè)，分別為MRAS，CTGF和ANKRD1。對在2個(gè)或者2個(gè)以上細(xì)胞數(shù)據(jù)中表達(dá)升高的基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示CTGF，MRAS，ANKRD1，IL32，DUSP1，CLIC4，PPBP和MCAM的表達(dá)上調(diào)顯著，見圖2A。同時(shí)已知的AZD9291耐藥基因FGFR1，F(xiàn)GF2和MET在我們構(gòu)建的PC-OR中表達(dá)也升高，見圖2B。

A：不同數(shù)據(jù)集共同高表達(dá)基因RNA表達(dá)量；B：已知耐藥基因的RNA表達(dá)量。

(**P<0.01；***P<0.001)

圖2PC-9和PC9-OR細(xì)胞基因表達(dá)

2.4 EGFR耐藥性預(yù)測 獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE34228中用Logistic回歸構(gòu)建不同高表達(dá)基因的耐藥預(yù)測模型，結(jié)果顯示，MRAS，MET，ANKRD1，MCAM和FGFR1具有較好的診斷效能，聯(lián)合診斷ROC曲線下面積達(dá)0.982 2，見圖3。

圖3 差異表達(dá)基因的ROC曲線

3 討論

長期使用AZD9291會出現(xiàn)腫瘤的獲得性耐藥，表現(xiàn)為出現(xiàn)EGFR下游信號分子RAS或BRAF激活突變[10-11]，Her-2及MET擴(kuò)增旁路激活EGFR下游受體酪氨酸激酶[12]，Aurora kinase[13]，PIK3C[14]，F(xiàn)GF2-FGFR1自分泌環(huán)[15]以及轉(zhuǎn)化為小細(xì)胞肺癌[16]。

我們自主構(gòu)建了三代EGFR-TKI奧希替尼耐藥細(xì)胞系PC9-OR。為了獲得非小細(xì)胞肺癌耐藥的共同基因特征，我們運(yùn)用了多個(gè)AZD9291耐藥細(xì)胞的高通量測序及芯片數(shù)據(jù)整合分析[7-8]。在PC9-OR上進(jìn)行了驗(yàn)證，獲得了11個(gè)AZD9291耐藥細(xì)胞中高表達(dá)的基因。利用獨(dú)立的EGFR-TKI耐藥細(xì)胞株，我們發(fā)現(xiàn)ANKRD1，MET，MRAS，MCAM和TGFR1等5個(gè)高表達(dá)基因?qū)θ鶨GFR-TKI耐藥具有較好地診斷效能，聯(lián)合診斷效能0.982 2。這五個(gè)基因可以作為EGFR-TKI耐藥的標(biāo)志用于預(yù)測EGFR-TKI耐藥。

同時(shí)這些基因可以為下一步細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證耐藥機(jī)制提供新的思路。MET是一個(gè)編碼酪氨酸激酶受體的原癌基因，其配體是肝細(xì)胞生長因子(human hepatocyte growth factor，HGF)，HGF/MET信號通路在組織損傷修復(fù)、促有絲分裂等過程中發(fā)揮重要作用，MET擴(kuò)增激活了細(xì)胞內(nèi)如PI3K-Akt，Ras-MAPK，STAT3等多種信號通路，可以介導(dǎo)對一代、三代EGFR-TKI耐藥[17]。MRAS編碼一個(gè)小GTPase的ras家族成員，這些膜相關(guān)蛋白在包括細(xì)胞生長和分化在內(nèi)的多個(gè)過程中作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物發(fā)揮作用，而ras信號的失調(diào)與許多類型的癌癥有關(guān)，其編碼蛋白可能在TNFα和MAPK信號通路中起作用[18]。錨蛋白重復(fù)域1(ankyrin repeat domain 1，ANKRD1)被報(bào)道與ZEB1共同參與了奧希替尼耐藥NSCLC細(xì)胞系PC9-OR，HCC827-OR細(xì)胞的EMT演變，還可能通過促進(jìn)細(xì)胞bcl-2表達(dá)起到抗凋亡作用[9]。黑色素瘤細(xì)胞黏附分子(melanoma cell adhesion molecule，MCAM)又稱CD146，與部分細(xì)胞黏附分子有同源性，介導(dǎo)細(xì)胞黏附、維持細(xì)胞形態(tài)及調(diào)控細(xì)胞增殖、運(yùn)動等。有報(bào)道MCAM通過上調(diào)干性相關(guān)基因、抑制β-catenin表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲介導(dǎo)了一代EGFR-TKI獲得性耐藥[19]。可以激活下游很多信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)控細(xì)胞發(fā)生與增殖等多種生物學(xué)過程，F(xiàn)GFR1擴(kuò)增曾被報(bào)道介導(dǎo)了一例患者的奧希替尼獲得性耐藥[15]。

建立EGFR-TKI耐藥基因標(biāo)志可以為預(yù)測腫瘤耐藥的發(fā)生提供依據(jù)，同時(shí)也可以為后期建立EGFR-TKI早期血清學(xué)標(biāo)志奠定基礎(chǔ)。目前EGFR-TKI耐藥預(yù)測表型多基于體外耐藥細(xì)胞系[20]，由于有限的三代EGFR-TKI臨床樣本的數(shù)據(jù)，給耐藥機(jī)制和耐藥表型標(biāo)志物的建立帶來了困難。本研究建立EGFR -TKI的耐藥預(yù)測基因集，結(jié)果顯示高表達(dá)耐藥基因特征的細(xì)胞具有EGFR-TKI抗性，能夠?qū)GFR-TKI耐藥有一定的提示作用。同時(shí)，腫瘤在體內(nèi)的狀態(tài)具有更復(fù)雜的表型和局部微環(huán)境，盡管我們在多株EGFR-TKI耐藥細(xì)胞株上都獲得了驗(yàn)證，但是由于腫瘤的異質(zhì)性，我們需要進(jìn)一步在腫瘤患者體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。