竹葉超聲提取工藝的優(yōu)化

張 永， 韓衛(wèi)麗， 郭 靜， 許海良， 張 彤， 丁 越*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203；2.無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無錫214002；3.上海海中實(shí)業(yè)有限公司，上海201103）

竹葉是一種藥食同用的清熱解毒中藥，因其營養(yǎng)價(jià)值豐富及良好的保健作用越來越受到人們重視，常被開發(fā)成各種功能性產(chǎn)品［1］，它以清心火兼利尿見長，大多用于治療熱病煩渴等癥狀，對(duì)心血管疾病有很好的防治作用［2］。近年來研究表明，竹葉中含有大量對(duì)人體有益的成分，如黃酮及其苷類、多糖類、微量元素等［3-4］，具有較高的生物活性，作為一種廉價(jià)無毒的可再生資源，其使用價(jià)值有待進(jìn)一步開發(fā)［5］。

黃酮類成分為竹葉中最主要的保健成分，具有抗氧化、防治心腦血管疾?。?-7］等功效，以葒草苷、異葒草苷、異牡荊素、牡荊素等碳苷黃酮為代表［8-9］，該類成分親水性強(qiáng)，有相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，有利于開發(fā)成保健產(chǎn)品［10］。本實(shí)驗(yàn)以提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為影響因素，葒草苷、異葒草苷總含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過HPLC 指紋圖譜結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化竹葉提取工藝，以期為其開發(fā)利用提供參考。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀 （美國Agilent 公司）；SB-3200D 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BSA124S 分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；TG18W 臺(tái)式高速離心機(jī)（博科集團(tuán)）。葒草苷、異葒草苷對(duì)照品（安徽西青果生物科技公司，批號(hào)238011-201712、238016-201712）。竹葉（產(chǎn)地浙江長興煤山鎮(zhèn)，批號(hào)17032401，編號(hào)S1～S9） 經(jīng)專家鑒定為禾本科植物毛竹Phyllostachys pubescens 的干燥葉子。乙腈為色譜純（美國Sigma 公司）；甲酸為色譜純（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司，批號(hào)NC300330）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取葒草苷、異葒草苷對(duì)照品適量，加甲醇分別制成含兩者0.112 4、0.248 7 g／L 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末1.0 g，置于50 mL錐形瓶中，25 mL 80%乙醇超聲30 min，加水稀釋1 倍，15 000 r／min 離心10 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱 （4.6 mm×250 nm，5 μm）；流動(dòng)相水（含0.025%甲酸） -乙腈，梯度洗脫，程序見表1；檢測(cè)波長350 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 線性關(guān)系考察 將葒草苷、異葒草苷對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程分別為Y ＝25 967X ＋0.645（r＝0.999 9）、Y ＝30 701X＋6.155（r ＝1.000 0），分別在0.9～112.4、1.9～248.7 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

2.3.3.1 日內(nèi)精密度 精密吸取對(duì)照品溶液，同1 d 內(nèi)在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得葒草苷、異葒草苷峰面積RSD 均小于0.9%，表明日內(nèi)精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3.3.2 日間精密度 精密吸取對(duì)照品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 d，每天1 次，測(cè)得葒草苷、異葒草苷峰面積RSD 均小于3.1%，表明日間精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，同1 d 內(nèi)于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得葒草苷、異葒草苷峰面積RSD 分別為1.2%、2.5%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材粉末6 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得葒草苷、異葒草苷含有量RSD 分別為2.0%、2.1%，表明本該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的藥材粉末0.5 g，精密加入低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，每批3 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，紅草苷、異葒草苷平均加樣回收率分別為102.1%、 98.2%， RSD 分別為2.0%、2.4%。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立 將提取液色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》 2.0 版，以平均數(shù)方法生成對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見圖2，可知共有14 個(gè)共有峰，與對(duì)照品色譜圖比對(duì)后共指認(rèn)出4 個(gè)（2、7、8、9 號(hào)），分別為綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素，其中異葒草苷色譜峰時(shí)間適中，對(duì)稱性良好，故選擇其作為參照峰（R）。

然后，測(cè)定相似度，結(jié)果見表2。由表可知，14 個(gè)共有峰的峰面積均大于98%，相似度均大于0.99，表明提取液化學(xué)成分相似。

2.5 主成分分析［11-13］將14 個(gè)共有峰導(dǎo)入SPSS 軟件，提取特征值λ＞1 的主成分1 個(gè)，方差貢獻(xiàn)率為89.7%，可表達(dá)指紋圖譜信息的89.7%，代表性良好。第一主成分中變量權(quán)重值最大的色譜峰分別為7 號(hào)（葒草苷）、8 號(hào)（異葒草苷），權(quán)重系數(shù)分別為0.997、0.999，表明兩者占決定性作用。因此，本試驗(yàn)選擇這2 種成分總含有量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。

圖2 竹葉HPLC 指紋圖譜

表2 相似度測(cè)定結(jié)果

2.6 單因素試驗(yàn)

2.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，按料液比1 ∶25 提取30 min，考察40%、60%、80%、100%乙醇對(duì)提取效果的影響。結(jié)果，80%乙醇提取時(shí)葒草苷、異葒草苷總含有量最高，故選擇其作為提取溶劑。

2.6.2 提取時(shí)間 精密稱取藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，按料液比1 ∶25 加入80%乙醇，考察提取時(shí)間10、20、30、60、90 min 對(duì)提取效果的影響。結(jié)果，葒草苷、異葒草苷總含有量隨著提取時(shí)間延長而升高，但30 min 后增長趨勢(shì)漸緩，而且此時(shí)提取率約為提取60 min 時(shí)的95%以上。從節(jié)約能源、提高效率的角度考慮，提取時(shí)間不宜過長，故選擇30 min 作為提取時(shí)間。

2.6.3 料液比 精密稱取藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，加入80%乙醇提取30 min，考察料液比1 ∶10、1 ∶25、1 ∶50 對(duì)提取效果的影響。結(jié)果，隨著料液比增加提取效率逐漸升高，但在1 ∶25 時(shí)葒草苷、異葒草苷大多已溶出，提取率基本趨于穩(wěn)定。從節(jié)約溶劑和節(jié)能的角度考慮，溶劑用量不宜過大，故選擇1 ∶25 作為料液比。

2.7 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C） 作為影響因素，設(shè)計(jì)L9（34） 正交試驗(yàn)。因素水平見表3，結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表3 因素水平

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 方差分析

由表3 可知，各因素對(duì)提取效果的影響程度依次為B＞A＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比；由表4 可知，因素A、B 有顯著影響（P＜0.05），而因素C 無顯著影響（P＞0.05）。最優(yōu)工藝為A3B2C3，即提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1 ∶50，但料液比過大會(huì)造成能源和溶劑的浪費(fèi)，故本實(shí)驗(yàn)選擇A3B2C2，即提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1 ∶25。再進(jìn)行3 批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得葒草苷、異葒草苷總含有量為1.78 mg／g，高于表3 最高值1.65 mg／g，表明工藝穩(wěn)定可行。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立竹葉超聲提取液的HPLC 指紋圖譜，確認(rèn)了14 個(gè)共有峰，并鑒定出其中4 個(gè)，分別為綠原酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊素，而且各批樣品相似度無明顯差異，表明其所含化學(xué)成分相似，但相對(duì)峰面積差異大，可能與提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率等因素有關(guān)。由于共有峰數(shù)據(jù)較多，其權(quán)重?zé)o法確定，故本實(shí)驗(yàn)又通過主成分分析提取了竹葉超聲提取液中起決定性作用的黃酮苷類成分——葒草苷和異葒草苷，為進(jìn)一步優(yōu)化超聲提取工藝奠定了基礎(chǔ)。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響竹葉中有效成分提取率的因素依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間有顯著影響（P＜0.05）。最佳條件為提取時(shí)間30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1 ∶25，葒草苷、異葒草苷總含有量為1.78 mg／g，RSD 為2.9%，表明工藝穩(wěn)定可行。