基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究川芎治療冠心病的作用機(jī)制

趙新望， 徐文華， 趙 陽(yáng)， 伍燕宏， 羅 蔚， 朱梓銘， 鄭景輝

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧530001）

我國(guó)心血管疾病發(fā)生率不斷升高， 《中國(guó)心血管病報(bào)告2017》 推算目前患病人數(shù)為2.9 億，其中冠心病1 100 萬［1］，2013 年死亡人數(shù)較1990 年增加了90.9%［2］。冠心病屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛” “厥心痛”范疇，中藥在相關(guān)治療方面有其獨(dú)到之處，其中川芎有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效，其所含成分川芎嗪的作用已得到廣泛的認(rèn)可，但研究發(fā)現(xiàn)該藥材主要化合物為苯酞類和酚酸類，前者含有量更高，而后者很低很少，甚至在許多樣品中無法被檢測(cè)出來，故川芎嗪無法作為川芎質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)［3］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出川芎主要化合物成分及其發(fā)揮作用的相關(guān)靶點(diǎn)，挖掘冠心病已知相關(guān)靶點(diǎn)，通過生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID）對(duì)靶點(diǎn)基因本體（GO）生物過程，以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）中代謝通路進(jìn)行分析，為該藥材治療冠心病的進(jìn)一步探索提供參考。

1 材料

TCMSP（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)，http： ／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）； Pharm-Mapper （反 向 藥 效 團(tuán) 匹 配 數(shù) 據(jù) 庫(kù)， http： ／／59.78.98.102／pharmmapper／submit_ file.php）；String（蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，https： ／／string-db.org／cgi／network.pl ）； GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https： ／／www.genecards.org／）； Venny2.1.0（http： ／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／）；Cytoscape3.2.1 軟件 （http： ／／cytoscapeweb.cytoscape.org／）；DAVID（基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)，http： ／／david.nifcrf.gov／）； GraphPad Prism 7.00 軟 件（https： ／／www.graphpad.com／）。

2 方法

2.1 川芎中化合物及作用靶點(diǎn)的篩選 依托TCMSP 檢索出與川芎相關(guān)的所有化合物成分，基于樣本量、數(shù)據(jù)的復(fù)雜性及文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)（ADME） 參數(shù)確定藥物口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18 作為篩選條件，將篩選后得到的化合物成分上傳到PharmMapper 服務(wù)器，得到其作用靶點(diǎn)。最后，應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫(kù)通過輸入靶點(diǎn)名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為其官方名稱（official symbol） 后，獲取與化合物成分相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.2 冠心病潛在作用靶點(diǎn)的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與冠心病發(fā)病相關(guān)的靶點(diǎn)，它可通過Gifts 算法來計(jì)算靶點(diǎn)與疾病之間的相關(guān)度，并以其進(jìn)行排序，選擇相應(yīng)靶點(diǎn)。

2.3 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 通過venny2.1.0 軟件將川芎成分靶點(diǎn)與冠心病疾病靶點(diǎn)取交集，得到川芎治療冠心病的潛在作用靶點(diǎn)。然后，由String 數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 作用靶點(diǎn)富集分析網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 應(yīng)用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)川芎作用靶點(diǎn)的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）進(jìn)行KEGG 通路富集分析，采用Omicshare 軟件繪制KEGG 通路富集分析氣泡圖，以進(jìn)一步揭示川芎治療冠心病的作用機(jī)制。

2.5 化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將川芎化合物和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建川芎化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)出川芎治療冠心病發(fā)揮主要作用的靶點(diǎn)與化合物。

3 結(jié)果

3.1 化合物及其作用靶點(diǎn) 檢索得到川芎化合物有189 個(gè)，符合篩選條件的7 個(gè)，分別為扁桃醇、楊梅酮、含川哚、洋川芎醌、川芎萘呋內(nèi)酯、谷甾醇、FA，見表1。然后，將PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)中所有靶點(diǎn)刪除重復(fù)的，整合得到川芎作用靶點(diǎn)481個(gè)；經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，整合得到冠心病靶點(diǎn)5 264 個(gè)，取相關(guān)度大于20 的443 個(gè)，通過venny2.1.0 軟件取兩者交集，韋恩圖見圖1；川芎、冠心病作用靶點(diǎn)取交集，得到潛在作用靶點(diǎn)31 個(gè)，見表2。

表1 川芎關(guān)鍵化合物Tab.1 Key compounds in Chuanxiong Rhizoma

圖1 韋恩圖Fig.1 Venn diagram

表2 川芎治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn)Tab.2 Key targets for Chuanxiong Rhizoma in treating coronary heart disease

3.2 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 由String 數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），其中“邊” 代表作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)，其粗細(xì)用combine score 表示，“邊” 越粗，combine score 值越大，代表其結(jié)合度越大；節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)。由圖可知，共有31 個(gè)節(jié)點(diǎn)、93 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為6，平均局部聚類系數(shù)為0.605。

圖2 川芎靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein interaction network of Chuanxiong Rhizoma tragets

3.3 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 通過Cytoscape

3.5.1 軟件構(gòu)建川芎治療冠心病化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），體現(xiàn)了川芎治療冠心病多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。

圖3 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Compounds-targets interaction network

3.4 靶點(diǎn)的GO 富集分析 利用David 數(shù)據(jù)庫(kù)，從生物過程、分子功能、細(xì)胞成分3 個(gè)水平對(duì)31 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分類分析，分別得到70、16、15 條，P＜0.05 者分別為56、9、9 條。然后，通過Graph-Pad Prism 7 軟件將這些條目做成可視化條形圖（生物過程條目較多，取排名前10 的條目），見圖4。

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

3.5 KEGG 通路富集分析 對(duì)川芎作用于冠心病主要的31 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到6 條P＜0.05 者，再通過Omicshare 軟件對(duì)其進(jìn)行可視化分析，氣泡圖見圖5。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可從分子水平上預(yù)測(cè)藥物治療疾病的靶點(diǎn)、通路等，近年來得到了越來越廣泛地認(rèn)可和應(yīng)用，故本研究通過該方法研究川芎治療冠心病的作用機(jī)制，結(jié)果得到7 個(gè)主要化合物，31 個(gè)作用于冠心病的主要靶點(diǎn)，主要涉及凝血、血管生成、血管擴(kuò)張、炎癥反應(yīng)、抗氧化、血壓調(diào)節(jié)6 個(gè)生理病理過程。血管性血友病因子（VWF） 及凝血因子（F2、F5、F11、F13A1） 主要與凝血過程有關(guān)，VWF 與血小板結(jié)合后可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊形成，而VWF 缺陷的小鼠中動(dòng)脈粥樣斑塊較少［4］；F2 激活是凝血過程的第一步，故抗凝治療為冠心病重要治療方案； 血管表皮生長(zhǎng)因子（EGF） 介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)在血管新生過程中發(fā)揮重要作用，是最重要的促血管形成和分化調(diào)節(jié)因子之一，細(xì)胞在缺氧時(shí)其合成量會(huì)升高12 倍，可明顯促進(jìn)全身多處組織器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、趨化［5-6］；肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2A（MEF2A） 在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)降低，該基因沉默可明顯上調(diào)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1、纖溶酶原激活物抑制劑-1 表達(dá)［7］。

圖5 KEGG 通路富集分析高級(jí)氣泡圖Fig.5 Senior bubble chart for KEGG pathway enrichment analysis

血管擴(kuò)張方面，一氧化氮合酶（NOS） 催化左旋精氨酸時(shí)可產(chǎn)生NO，具有強(qiáng)烈的擴(kuò)血管作用，能降低平均動(dòng)脈血壓，調(diào)節(jié)全身各血管靜息張力，也是心臟血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)的重要因子［8］。炎癥反應(yīng)方面，跨膜受體蛋白1（Notch1） 在巨噬細(xì)胞分化過程中可促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的釋放引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，干擾Notch1 信號(hào)通路則可明顯促進(jìn)抗炎癥型M2 型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，上調(diào)抗炎癥細(xì)胞因子的分泌［9］；半乳凝集素（LGALS） 可結(jié)合CD98 促進(jìn)巨噬細(xì)胞激活，活化的巨噬細(xì)胞分泌纖維化細(xì)胞因子，刺激肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，最終參與不良心臟重構(gòu)和心肌纖維化。MacKinnon 等［10］發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中缺乏LGALS 的內(nèi)皮下幾乎沒有動(dòng)脈斑塊形成。抗氧化方面，機(jī)體在缺血、缺氧時(shí)可產(chǎn)生大量氧自由基，肌紅蛋白（MB） 是一種含亞鐵血紅素的低分子，可運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧氣，不同原因引起心肌組織損傷均可導(dǎo)致血液中MB 水平增加，故它是急性心梗早期最靈敏的指標(biāo)；超氧化物歧化酶（SOD） 是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶，為生物體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)，其血清水平與血管結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，故可用于標(biāo)記心血管變化；調(diào)脂方面，上調(diào)膽固醇-7α 羥化酶（CYP7A1） 和過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα） 表達(dá)可調(diào)節(jié)血脂［11］，降低血壓，以達(dá)到改善動(dòng)脈粥樣硬化的目的；醛固酮是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一部分，其激活程度與冠心病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，川芎有效成分可能通過與醛固酮受體結(jié)合，以負(fù)反饋機(jī)制減少醛固酮的分泌，減低激活程度，降低血壓。然后，對(duì)31 個(gè)主要靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，得到其涉及的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC） 相關(guān)信息。

P＜0.05 的前20 個(gè)生物過程中與冠心病相關(guān)的有17 個(gè)，主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、凝血、血管生成、血管擴(kuò)張、血壓調(diào)節(jié)等方面。缺氧時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，超氧化物歧化酶將這些氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，然后由過氧化氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的水和氧，以減輕缺氧對(duì)機(jī)體造成的損害，而且此時(shí)可激活缺氧誘導(dǎo)因子，缺氧誘導(dǎo)因子可使血管再生和修復(fù)微血管梗阻［12］；根據(jù)凝血酶原激活物形成始動(dòng)途徑和參與因子的不同，可將凝血途徑分為內(nèi)源性、外源性，前者蛋白參與心血管疾病發(fā)生，導(dǎo)致血栓形成［13-17］；血小板通過脫顆粒作用釋放EGF，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，劉一劍等［18］研究表明，其水平升高在冠心病的發(fā)生發(fā)展中可能作為一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子存在；MEF2A 基因沉默可明顯上調(diào)ICAM-1、VCAM-1、PAI-1 表達(dá)，其變異更容易導(dǎo)致冠心病的發(fā)生［19］；nNOS 不僅可生成NO 來擴(kuò)張血管，還可生成H2O2，同樣可起到擴(kuò)張血管的作用，大鼠血管內(nèi)膜被乙酰膽堿刺激后會(huì)增加nNOS 生產(chǎn)H2O2［20］；劉紅瓊等［21］報(bào)道， 脈壓、脈壓指數(shù)與高血壓患者冠心病發(fā)生有關(guān)，特別是脈壓指數(shù)越大，冠心病發(fā)生率越高，冠脈病變?cè)絿?yán)重，故血壓調(diào)節(jié)對(duì)冠心病治療非常重要。

P＜0.05 的分子功能有9 個(gè)，涉及抗氧化、延長(zhǎng)作用時(shí)間、保護(hù)心肌、抗凝4 個(gè)方面。血紅素結(jié)合蛋白是一種血漿急性期糖蛋白，其功能主要是與循環(huán)中多余的游離血紅素結(jié)合，并轉(zhuǎn)移到特定的細(xì)胞處理［22］，對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕多余的游離血紅素造成的組織損傷［23］；蛋白結(jié)合是指藥物進(jìn)入血液循環(huán)與血漿蛋白的結(jié)合，成為結(jié)合型藥物，暫時(shí)失去一般藥理活性，并“儲(chǔ)存” 在血液中，起到藥庫(kù)的作用，對(duì)于藥物作用及其維持時(shí)間長(zhǎng)短有重要意義，一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除會(huì)比較慢，作用維持時(shí)間長(zhǎng)，川芎化合物與血漿蛋白的結(jié)合力較強(qiáng)［24］；石天堯等［25］發(fā)現(xiàn)，心肌缺血／再灌注大鼠模型血清中肌酸激酶活性和丙二醛水平顯著降低，表明半乳糖苷具有明顯的心肌保護(hù)作用；一些研究表明，經(jīng)高鎂培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中NO 產(chǎn)生增加，可防止NF-κB 活化，降低基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9） 活性，上調(diào)VWF 蛋白水解，抑制血小板黏附［26-27］，達(dá)到抗凝效果。

P＜0.05 的細(xì)胞成分有9 種，涉及炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)3 個(gè)方面。血小板α 顆粒是血小板中可分泌蛋白質(zhì)的主要貯存部位，在冠狀動(dòng)脈粥樣病變時(shí)其膜蛋白表達(dá)增高，從而介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附聚集在動(dòng)脈粥樣斑塊周圍，造成局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)性反應(yīng)，釋放大量組織活性因子，在這些組織活性因子的共同作用下最終導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定性下降、斑塊破裂［28］；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER） 是在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞器，約有30 多種膜結(jié)合蛋白，另有30 多種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，其分布具有異質(zhì)性，在冠心病患者中同型半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的半胱天冬酶3 活化增強(qiáng)，證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與冠心病的發(fā)生機(jī)制可能存在關(guān)聯(lián)［29］；過氧化物酶體是一種存在于幾乎所有真核細(xì)胞中的細(xì)胞器［30］，可把氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2而發(fā)揮抗氧化的作用。

對(duì)川芎作用于冠心病主要的31 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到P＜0.05 的通路6 條。其中，補(bǔ)體級(jí)聯(lián)與凝血級(jí)聯(lián)、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路、過氧化物酶體通路與冠心病相關(guān)，涉及凝血過程、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管擴(kuò)張、心肌保護(hù)等方面；凝血因子是凝血過程的主要參與者，川芎作用于冠心病的主要靶點(diǎn)包括多種凝血因子，由此推測(cè)它可能通過抑制其表達(dá)來達(dá)到抗凝的目的，從而改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的程度；補(bǔ)體系統(tǒng)成分由30 多種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段組成，主要分為固有成分 （C1qrs-C9、 B／D／P 因子、 MBL、絲氨酸蛋白酶等）、補(bǔ)體受體（CR1、CR2、CR3、C3a R，C5aR 等） 和調(diào)節(jié)分子（C1INH、DAF、H因子等），黃政［31］認(rèn)為，后處理能夠上調(diào)HSP90表達(dá)，并減少缺血-再灌注（缺氧／復(fù)氧） 誘導(dǎo)的補(bǔ)體C3／C5a、NF-κB、IL-1β、TNF-α 表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡；早期缺氧時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子激活后可激活下游EGF、NOS2 基因表達(dá)，EGF 表達(dá)可促進(jìn)新生毛細(xì)血管生成，NOS2 作為催化劑參與產(chǎn)生NO，進(jìn)而擴(kuò)張血管，調(diào)節(jié)心臟血流；研究表明［32］，缺氧時(shí)HIF-1α 表達(dá)增加能活化VEGF 基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)其mRNA 穩(wěn)定性，上調(diào)其mRNA 表達(dá)，從而促使血管生成，降低缺氧對(duì)組織的負(fù)面影響；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α） 是機(jī)體細(xì)胞在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，參與低氧反應(yīng)基因的調(diào)控，可促進(jìn)血紅素氧化酶-1 （HO-1）、 血管生長(zhǎng)因子（VEGF） 等因子表達(dá)，其中HO-1 具有抗氧化、抗炎、擴(kuò)張血管作用，被認(rèn)為是血管保護(hù)因子，而且HIF 誘導(dǎo)的HO-1 對(duì)缺血-再灌注損傷具有長(zhǎng)期的心肌保護(hù)作用［33］。

綜上所述，川芎可能主要通過抗氧化、抗炎、抗凝血、促進(jìn)血管生成、擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血壓等方面來治療冠心病。但本研究?jī)H對(duì)一些數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行挖掘，對(duì)川芎的功效作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，今后在基礎(chǔ)研究、臨床實(shí)驗(yàn)中還需要進(jìn)一步驗(yàn)證?；衔镆設(shè)B和DL 作為篩選條件也存在一定局限性，如川芎嗪注射液目前在臨床上已取得廣泛應(yīng)用，故不能僅依靠口服利用度來篩選化合物，該值較低者也需要加以重視。另外，本研究只對(duì)川芎進(jìn)行了研究，而在臨床上它大多與其他中藥進(jìn)行配伍來治療冠心病，同時(shí)各中藥之間的相互作用也未能得到體現(xiàn)，需要不斷完善。