EMA-qPCR檢測空腸彎曲活菌方法研究

聞子鈺,顧一心,梁 昊,王佳奇,鞠長燕,馬艷萍,張茂俊,段永翔

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)是最常見的食源性病原菌之一,與沙門氏菌、志賀氏菌并列為人類三大腹瀉致病菌。該菌屬于彎曲菌屬,為微需氧菌,在大氣或厭氧的環(huán)境中均不生長,廣泛存在于家禽腸道中[1],并通過污染肉品、食物或水源導致人類感染,主要引起人的發(fā)熱和急性腸胃炎,進一步還可引發(fā)心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎等全身性疾病[2],研究表明,特定血清型的空腸彎曲菌感染與吉蘭-巴雷綜合征的發(fā)病密切相關(guān)[3-5]。

目前對于彎曲菌的檢測方法是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法,從富集培養(yǎng)、選擇性分離、形態(tài)特征觀察、生化反應和血清學鑒定等過程,時間長達5～7 d左右,操作過程費時費力,影響因素較多,靈敏度偏低[6]。熒光定量PCR技術(shù)能夠快速定量檢測樣本中病原菌的污染,但其通過檢測樣品中特異核酸的存在及拷貝數(shù),對樣本中“死菌”的擴增導致假陽性結(jié)果,不能真正反映樣品中活菌的數(shù)量。

疊氮溴化乙錠(Ethidium monoazide,EMA)是溴化乙錠的衍生物,能夠進入受到損害的細菌細胞壁和細胞膜,隨后共價結(jié)合在其DNA上,不能被PCR所擴增。活菌細胞因具有完整的細胞壁和細胞膜,使其得到保護不受EMA共價反應的影響,因此,利用EMA預處理模板可克服PCR檢測的假陽性結(jié)果。本研究通過優(yōu)化EMA使用濃度,建立EMA-qPCR組合檢測技術(shù),并進行模擬食品標本的驗證,從而建立一種快速定量檢測“活的”空腸彎曲菌的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株 空腸彎曲菌為中國疾病預防控制中心傳染病所保存。

1.1.2 試劑和儀器 疊氮溴化乙錠EMA(Biotium,美國),裂解液(由本實驗室配制),QIAamp DNA mini kit(德 國 QIAGEN)、QIAamp DNA Stool Mini Kit(德國QIAGEN)、彎曲菌培養(yǎng)檢測試劑盒(青島中創(chuàng)生物科技有限公司),TranStartProbe qPCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);振蕩恒溫金屬浴(MB-102,杭州博日科技有限公司)、17R離心機(Thermo)、實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、活菌甄選儀BluCoo(北京博瑞立安生物技術(shù)有限公司BBI)。

1.1.3 引物和探針 針對彎曲菌擴增的探針引物參考文獻[7],序列見下:

1.2 方 法

1.2.1 優(yōu)化EMA使用濃度

1.2.1.1 空腸彎曲活菌、死菌的制備 空腸彎曲菌接種于加脫纖維羊血Karmali培養(yǎng)基上,置于三氣培養(yǎng)箱(5%O2,10%CO2,85%N2)中37℃生長48 h,使用1 L接種環(huán)刮取一環(huán)空腸彎曲菌溶于1 mL 0.85%預冷的生理鹽水中,紫外分光光度計調(diào)節(jié)菌液濃度A600＝1(109CFU/mL),用生理鹽水10倍梯度稀釋至106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL,各濃度取1/2體積作為活菌,取1/2體積于水浴鍋加熱(95℃,10 min)作為死菌,并于培養(yǎng)基驗證完全處死。

1.2.1.2 EMA 處理 將106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL的活、死菌懸液分別分裝200μL至1.5 mL EP管中,加入不同體積的1 mg/mL EMA 至終濃度為0(對照組)、2、5、10、20、50μg/mL,并進行標記,重復1次操作作為平行對照,以上步驟均在冰上操作。充分混勻后置于活菌甄選儀中,4℃,暗反應5 min,光反應15 min。

1.2.1.3 DNA提取 取出活菌甄選儀中的樣品,離心(4℃,12 000 g,10 min)后,重懸于裂解液中,金屬浴加熱(100℃,10 min),離心(4℃,16 000 g,5 min),DNA于-20℃保存。

1.2.1.4 熒光定量PCR 反應條件:總體系20μL,成分 如 下:TranStart○RProbe qPCR Super Mix 10 μL,Nuclease-free Water 5.5μL,上游及下游引物0.3μmol/L,探針0.15μmol/L,DNA 3μL。反應程序:94℃預變性5 min,45個循環(huán)中94℃變性15 s,60℃退火及延伸1 min,退火階段采集熒光信號。

1.2.2 EMA-qPCR檢測空腸彎曲菌的死/活混合物按1.2.1.1所述步驟制備106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL的死、活空腸彎曲菌,每個濃度均進行以下操作:以活菌比例占0%(800μL D),10%(80μL V＋720μL D),30%(240μL V＋560μL D),50%(400μL V＋400μL D),70%(560μL V＋240μL D),90%(720μL V＋80μL D),100%(800 μL D)與同濃度的死菌混合(V:活菌,D:死菌),充分混勻后分裝200μL至EP管中,每個比例的兩管作為處理組,兩管作為對照組1,同時活菌按相同比例與生理鹽水混合作為對照組2,設一個平行對照,以上操作在冰上進行。處理組加入1 mg/mL EMA至終濃度為5μg/mL,對照組不加EMA,充分混勻后置于預冷4℃的活菌甄選儀中,暗反應進行5 min,光反應進行15 min,按1.2.1.3、1.2.1.4步驟提取DNA及進行熒光定量PCR。

1.2.3 EMA-qPCR檢測模擬食品標本

1.2.3.1 食品盥洗液制備 于超市購買3只雞腿肉各75 g,分別放入無菌袋中,加入100 mL 0.1% 滅菌蛋白胨水盥洗15 min,盥洗液分裝至2個50 mL離心管中,4℃保存。

1.2.3.2 本底檢測 取1管50 mL盥洗液,將試劑盒中的雙孔板從4℃冷藏室拿出后,室溫平衡后(約30 min),使用無菌鑷子將濾膜輕輕貼在雙孔板的中間上,吸取300μL混勻后的增菌培養(yǎng)液分6～7個點均勻滴加雙孔板的濾膜上,待水分充分透過濾膜(約1 h),使用無菌鑷子輕輕的揭去濾膜,翻轉(zhuǎn)平板。置于微需氧環(huán)境37℃培養(yǎng)48 h。離心管內(nèi)剩余溶液離心(4℃,4 000 r/min,10 min,離心半徑為9 cm),棄上清,按照QIAamp DNA Stool Mini Kit步驟說明提取DNA,應用檢測彎曲菌的熒光定量PCR驗證是否含有彎曲菌。

1.2.3.3 模擬感染空腸彎曲菌 按1.2.1.1所述步驟制備107CFU/mL、106CFU/mL濃度活、死狀態(tài)的空腸彎曲菌,各濃度分別以活菌占10%(2μL V＋18μL D)的比例與同菌種同濃度的死菌混合作為處理組和對照組1,同時與生理鹽水混合作為對照組2,于含有死/活菌混合液的EP管中分別加入180μL的3份驗證無彎曲菌存在的雞肉盥洗液(此時空彎活菌濃度為105CFU/mL、104CFU/mL)。處理組加入EMA至終濃度為5 g/mL,對照組不加EMA,所有步驟在冰上操作。處理組充分混勻后置于活菌甄選儀中,4℃,暗反應5 min,光反應15 min。反應結(jié)束后使用Qiagen mini kit試劑盒提取DNA,應用擴增彎曲菌的熒光定量PCR檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析,采用Dunnett-t檢驗,檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 EMA最優(yōu)濃度 將106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL死、活菌分別使用EMA作用后,熒光定量PCR結(jié)果如下(見表1),EMA終濃度為5～10μg/mL時,死菌在106、105、104、103時,死菌的Ct值比不加EMA的Ct明顯提高6個單位左右,EMA終濃度為10μg/mL時,活菌在105CFU/mL時,Ct值約增加1個單位,EMA終濃度小于5μg/mL時,對活菌Ct值無影響。綜合各濃度考慮,5μg/mL為EMA應用于“活的”空腸彎曲菌檢測前處理的最優(yōu)濃度。

表1 EMA作用濃度的優(yōu)化結(jié)果Tab.1 Optimization of EMA concentration

2.2 EMA-qPCR檢測空腸彎曲菌死/活混合物對不同濃度的以不同活菌、死菌比例混合后的死/活混合物進行終濃度為5μg/mL的EMA處理,熒光定量PCR結(jié)果如下(見圖1,圖2,圖3):菌總量在106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL時,活、死菌混合物進行EMA處理后與活菌與生理鹽水混合物的對照組2的Ct值在活菌比例占10%、20%、50%、70%、90%、100%時基本一致,活、死菌混合物進行EMA處理后與活、死菌混合物的不加EMA處理對照組1的Ct值在活菌比例小于70%時有差距,并隨著活菌比例趨于100%而趨于一致。表明EMA-qPCR可從純培養(yǎng)的空腸彎曲菌的死/活混合物中識別出“活的”空腸彎曲菌。

圖1 空腸彎曲菌的不同活菌比例的EMA-qPCR(106)Fig.1 EMA-qPCR results of different ratios of viable C.jejuni cells(106)

圖2 空腸彎曲菌的不同活菌比例的EMA-qPCR(105)Fig.2 EMA-qPCR results of different ratios of viable C.jejuni cells(105)

圖3 空腸彎曲菌的不同活菌比例的EMA-qPCR(104)Fig.3 EMA-qPCR results of different ratios of viable C.jejuni cells(104)

2.3 EMA-qPCR檢測模擬食品標本 對人工感染空腸彎曲菌的模擬食品進行終濃度為5μg/mL的EMA結(jié)合qPCR,經(jīng)SPSS24.0單因素方差分析及LSD多重比較,檢驗水準＝0.05。結(jié)果如表2,菌濃度為106CFU/mL,活菌占10%時,3組Ct值的差異有統(tǒng)計學意義(F＝49.404,P＝0.001＜0.05),處理組與對照組1的Ct值的差異有統(tǒng)計學意義(t＝9.378,P＜0.001);處理組與對照組2的Ct值的差異無統(tǒng)計學意義(t＝1.834,P＝0.116);菌濃度為105CFU/mL,活菌占10%時,3組Ct值的差異有統(tǒng)計學意義(F＝26.190,P＝0.001＜0.05),處理組與對照組1的Ct值的差異有統(tǒng)計學意義(t＝6.756,P＝0.001),處理組與對照組2的Ct值的差異無統(tǒng)計學意義(t＝1.129,P＝0.302)。表明EMA-qPCR可成功識別模擬食品中“活的”空腸彎曲菌。

表2 模擬食品感染空腸彎曲活、死菌混合物的EMA-qPCR結(jié)果Tab.2 EMA-qPCR results of simulated food infection of viable and dead C.jejuni

3 討 論

針對特異基因序列設計引物或探針的PCR技術(shù),以DNA為靶標進行擴增,無法避免死菌DNA產(chǎn)生擴增信號的影響。僅識別活菌的擴增信號對于分子生物學技術(shù)在食品檢測及監(jiān)測的應用更有意義,同時減輕了大量的經(jīng)濟損失。基于mRNA及基于膜通透性的活性染料法是目前實現(xiàn)PCR進行活菌檢測的2種方法。mRNA半衰期較短,在細菌死亡后很快降解,因此對mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄PCR可達到只檢測活菌的目的,但存在一系列困難,首先,食品中存在的脂肪等抑制劑導致RNA提取較為困難[8];其次,RNA在細菌中含量較少,易被內(nèi)源性外源性RNA酶降解,受實驗操作者影響較大;再次,RT-qPCR靈敏性較低[8],檢測過程需要結(jié)合增菌步驟,增加了檢測時間,當死菌含量較大時,RNA并不能完全降解,導致產(chǎn)生假陽性結(jié)果[9]。

EMA是一種可以進入死菌受損的細胞膜并結(jié)合DNA形成共價化合物的活性染料,對樣本進行前處理后,可避免PCR對死菌DNA進行擴增產(chǎn)生的假陽性結(jié)果[10]。但成功地應用EMA,必須考慮可能會影響結(jié)果數(shù)據(jù)的多因素,包括染料的濃度、孵育時間;光源及曝光時間、光照距離;是否存在大量死亡細胞,待檢樣品中存在高水平的懸浮固體或生物量;反應混合液中的鹽濃度、p H;目標基因的長度、序列等[9]。以往研究大多采用鹵素燈作為光源,鹵素燈是一種產(chǎn)熱光源,其產(chǎn)生的熱能可能對活細胞產(chǎn)生殺傷作用,研究者通過控制光源距離及冰上操作進行實驗,由于研究條件不同,研究結(jié)果通常呈現(xiàn)多樣性。本研究采用了活菌甄選儀,其冷光源對活細胞無損傷,實驗中發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度也是一個重要影響因素,可能是由于細菌周圍環(huán)境的升高使得細菌細胞膜處于不穩(wěn)定狀態(tài),因此在EMA使用的過程中需在在冰上操作,保持活菌細胞膜的穩(wěn)定性。

本研究以建立“活的”空腸彎曲菌的檢測技術(shù)為目的,結(jié)果表明空腸彎曲菌的最優(yōu)EMA終濃度為5～10μg/mL,EMA的使用濃度并未隨空腸彎曲菌濃度的不同發(fā)生較大改變,綜合濃度及經(jīng)濟考慮,將5μg/mL應用于純培養(yǎng)的死/活菌混合物及模擬食品檢測后,EMA-qPCR技術(shù)成功區(qū)分活、死菌?；罹壤笥?%或10%時,處理組與對照組2即保持一致,表明可區(qū)分死、活菌。在對加入EMA處理后的樣品進行菌落培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過EMA處理后的活菌樣品無菌落生長,可能是EMA對活細胞具有毒性作用,無法培養(yǎng),但進行熒光PCR可檢測出Ct值,與未進行EMA處理的活菌樣品相比無差異,不影響EMA區(qū)別死、活菌的效果。研究表明,在實際標本的基質(zhì)中除空腸彎曲菌之外的其他菌群不會影響EMA的作用[11]。相比之下,RT-qPCR共消耗7美元[12],EMA-qPCR處理1份樣品需比qPCR成本增加0.4元,EMA更為經(jīng)濟,且無需增菌步驟,本研究建立的EMA-qPCR活菌檢測技術(shù)可用于“活的”空腸彎曲菌的檢測。

利益沖突:無

引用本文格式:聞子鈺,顧一心,梁昊,等.EMA-qPCR檢測空腸彎曲活菌方法研究[J].中國人獸共患病學報,2019,35(9):821-825.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.117