茶樹(shù)果膠乙酰酯酶家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析

劉艷麗，馬林龍，曹丹，金孝芳，馮琳，龔自明

茶樹(shù)果膠乙酰酯酶家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析

劉艷麗，馬林龍，曹丹，金孝芳*，馮琳，龔自明

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所，湖北 武漢 430209

茶樹(shù)是氟的超富集植物，葉片高氟含量與人體健康密切相關(guān)。果膠乙酰酯酶（PAE）可能通過(guò)調(diào)控果膠的去乙?；饔脜⑴c茶樹(shù)葉片對(duì)氟的富集和解毒，然而目前并無(wú)茶樹(shù)PAEs的相關(guān)報(bào)道。本研究以茶樹(shù)舒茶早基因組和三代測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)的方法開(kāi)展了PAEs的鑒定及其特性、進(jìn)化和定位分析。結(jié)果表明，在茶樹(shù)中，PAE家族有12個(gè)蛋白，屬于PAE5、PAE8、PAE9、PAE10、PAE12等5個(gè)成員，具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等9個(gè)保守基序；在進(jìn)化關(guān)系上，茶樹(shù)PAEs與葡萄、可可親緣關(guān)系較近；12個(gè)CsPAEs氨基酸大小為326~515，分子量為36.7~56.9?kDa，等電點(diǎn)為5.1~8.9；除CsPAE5、CsPAE5-1定位線(xiàn)粒體，CsPAE10-1可能定位胞質(zhì)外，其他9個(gè)CsPAEs定位細(xì)胞壁；CsPAE5、CsPAE5-1、CsPAE12和CsPAE12-1為跨膜蛋白。此研究結(jié)果將為解析PAE在茶樹(shù)葉片氟富集和解毒過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

茶樹(shù)；果膠乙酰酯酶；鑒定；生物信息學(xué)分析

植物細(xì)胞壁通常由多糖（纖維素、半纖維素和果膠）和結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中果膠是主要組分[1]。果膠是一類(lèi)富半乳糖醛酸（GalA，通過(guò)-1,4糖苷鍵連接）的多糖，主要由同聚半乳糖醛酸（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（RG-Ⅱ）和木糖半乳糖醛酸聚糖（XGA）4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成[2-4]。據(jù)報(bào)道，HG和RG-I骨架上半乳糖醛酸C2或C3羥基常發(fā)生乙?；揎梉5]。此外，也有報(bào)道RG-I中的鼠李糖及RG-Ⅱ側(cè)鏈上的巖藻糖和槭汁酸C3位發(fā)生乙?；揎梉6-7]。果膠乙酰化發(fā)生在果膠從高爾基體向細(xì)胞壁分泌的過(guò)程中，然后乙酰化的果膠結(jié)合進(jìn)細(xì)胞壁[8-9]。果膠乙?；淖兞斯z組分的理化性質(zhì)，影響了細(xì)胞的粘連進(jìn)而影響了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)[10]。果膠乙?；某潭仁芄z乙酰酯酶（Pectin acetylesterase，PAE）的調(diào)控，PAE具有切割乙酰酯鍵對(duì)果膠進(jìn)行去乙?；淖饔肹9,11]。

研究表明，果膠甲基酯酶（Pectin methylesterase，PME）調(diào)控果膠去甲基化，使果膠中自由基團(tuán)增多，進(jìn)而使細(xì)胞壁具有吸附結(jié)合更多重金屬離子的能力。PAE可能同PME一樣，通過(guò)調(diào)控果膠乙酰基化使細(xì)胞壁具吸附結(jié)合更多重金屬離子的能力[4]，從而參與植物細(xì)胞壁對(duì)重金屬的富集和解毒。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道PAE參與植物生長(zhǎng)發(fā)育繁殖過(guò)程[9,11]、果實(shí)硬度變化[12]及植物防御生物和非生物脅迫[13-16]。Pogorelko等[14]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)構(gòu)巢霉菌的轉(zhuǎn)基因擬南芥和二穗短柄草對(duì)病原菌具有更高的抗性；楊志遠(yuǎn)等[15]發(fā)現(xiàn)擬南芥T-DNA插入突變體對(duì)大豆疫霉菌更為敏感。然而，PAE參與植物重金屬富集和解毒的報(bào)道一直缺乏。最近，我們利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略探討茶樹(shù)葉片對(duì)氟脅迫的響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)PAE顯著上調(diào)表達(dá)，表明其參與葉片氟富集和解毒過(guò)程[16]。

茶樹(shù)[(L.) O. Kuntze]是氟的超富集植物，其葉片高氟含量與人體健康密切相關(guān)。鑒于PAE參與茶樹(shù)葉片氟富集和解毒過(guò)程，解析茶樹(shù)PAE將有助于對(duì)葉片氟富集和解毒機(jī)制的了解。在高等植物中，PAE屬于CE13超家族成員，有10個(gè)左右PAE成員，具有保守的PAE結(jié)構(gòu)域[5,17]。然而，截止目前尚無(wú)茶樹(shù)PAE家族成員的相關(guān)報(bào)道。最近，云抗10號(hào)基因組[18]和舒茶早基因組[19]序列信息相繼釋放，使得PAE家族成員的鑒定、特性分析和功能研究更為容易和可靠。本研究采用生物信息學(xué)的方法開(kāi)展了茶樹(shù)PAEs的鑒定、特性、進(jìn)化和亞細(xì)胞定位分析，以期為解析PAE在茶樹(shù)葉片氟富集和解毒過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)原料：采取湖北省茶樹(shù)資源圃中鄂茶1號(hào)一年生扦插苗一芽二葉，自來(lái)水沖洗擦干、液氮速凍后保存于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

數(shù)據(jù)庫(kù)：舒茶早（var. sinensis cv ‘Shuchazao’）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[19]和三代測(cè)序數(shù)據(jù)（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)韋朝領(lǐng)老師提供）及鄂茶1號(hào)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[20]。

試驗(yàn)藥劑：植物多糖多酚RNA提取試劑盒、零背景pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒購(gòu)置于北京艾德萊生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒購(gòu)置于美國(guó)Thermo Scientific；TOYOBO高保真酶KOD plus購(gòu)置于日本東洋紡（上海）生物科技有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)置于杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司；Taq酶購(gòu)置于大連寶生物工程有限公司；引物合成、樣品測(cè)序由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成；其他生化試劑均購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

茶樹(shù)PAEs基本特性分析使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam），保守結(jié)構(gòu)域分析使用NCBI CDD工具（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）。多重序列比對(duì)使用CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）。信號(hào)肽分析使用SignalP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)使用TargetP 1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）、WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）和Loctree3（https://rostlab.org/services/loctree3）。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析使用TMHMM Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。核和過(guò)氧化物酶體定位分析分別使用cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）和PTS1 predictor（http://mendel.imp.ac.at/pts1）。使用MEGA X軟件采用NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄及CsPAEs克隆

以鄂茶1號(hào)一芽二葉為材料，使用植物多糖多酚RNA提取試劑盒提取總RNA，使用RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒獲得總cDNA。

以基因組中TEA020946、三代測(cè)序獲得的Tea_472383及鄂茶1號(hào)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中Unigene0148795序列為參照，根據(jù)重復(fù)部分拼接PAE9并以此為模板設(shè)計(jì)引物。前置和后置引物分別為：5'-ATGATGAATAGAAGAAAAATTGAGTT-3'和5'-TCAGCCTATCAAGTTATGGCA-3'。同時(shí)，以基因組中TEA033219及鄂茶1號(hào)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中Unigene0147524序列為參照設(shè)計(jì)PAE12引物，前置和后置引物分別為5'-ATGAGGAAGCTGATGGG-3'和5'-TTATTTGAAAACCAGATTGT-3'。隨后，使用TOYOBO高保真酶KOD plus克隆得到目的條帶，繼而使用膠回收試劑盒回收，零背景pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒連接、轉(zhuǎn)化DH5α，最后通過(guò)菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證。試驗(yàn)均參照相應(yīng)試驗(yàn)盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)PAE家族成員的鑒定

使用PAE保守結(jié)構(gòu)域（pfam03283），在舒茶早基因組和三代測(cè)序數(shù)據(jù)中檢索到26個(gè)蛋白。為了排除重復(fù)，使用CLUSTALW對(duì)26個(gè)蛋白進(jìn)行了多重序列比對(duì)。結(jié)果表明，Tea_42986與Tea_50692序列相似性100%，TEA022428與Tea_38789序列相似性100%。隨后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，使用NCBI conserved domain database對(duì)余下的24個(gè)蛋白進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明，24個(gè)蛋白都是PAE超家族蛋白，其中16個(gè)蛋白是PAE；16個(gè)PAE蛋白中，10個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)域序列完整，5個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)域C端序列缺失，1個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)域N端序列缺失。蛋白結(jié)構(gòu)域序列缺失可能是測(cè)序或拼接不完全造成的，因此后續(xù)分析排除結(jié)構(gòu)域序列不完整的6個(gè)PAEs。綜上，在舒茶早基因組和三代測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選到10個(gè)可能的PAE蛋白。

為了區(qū)分10個(gè)茶樹(shù)PAEs，使用CLUSTALW軟件將其與12個(gè)擬南芥PAEs（AtPAE1-12）進(jìn)行了多重序列比對(duì)。結(jié)果表明，2個(gè)蛋白包括TEA023839和Tea_32472同AtPAE5相似性最高，氨基酸同源性分別為49.7%和60.8%；4個(gè)蛋白包括TEA023165、TEA022428、Tea_23392和Tea_42986同AtPAE8相似性最高，同源性為64.2%~67.6%；Tea_47238同AtPAE9相似性最高，同源性為66.6%；2個(gè)蛋白包括TEA009391和 TEA002398與AtPAE10相似性最高，同源性分別為61.4%和57.7%；TEA033219同AtPAE12相似性最高，同源性為63.5%（表1）。由此可初步推測(cè)，茶樹(shù)中可能存在5個(gè)PAE成員，分別是PAE5、PAE8、PAE9、PAE10和PAE12。

2.2 茶樹(shù)PAEs保守基序分析

Philippe等[5]對(duì)72個(gè)植物PAEs分析發(fā)現(xiàn)，PAEs具有CLDG、PxYh、gGxwC、GS、Nwn、rYCDg、GCSxG、NxayDxwQ、HCQ等9個(gè)保守基序（圖1-A）。其中，HCQ是最保守的基序，GCSxG和NxayDxwQ也是重要的保守基序。為了驗(yàn)證茶樹(shù)PAEs保守基序，使用ClustalX2.1對(duì)10個(gè)PAEs和12個(gè)擬南芥PAEs進(jìn)行了多重序列比對(duì)。結(jié)果表明，茶樹(shù)中存在有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等9個(gè)保守基序（圖1-B）。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)僅有6個(gè)蛋白包括Tea_32472（PAE5）、TEA022428（PAE8）、Tea_23392（PAE8）、Tea_42986（PAE8）、TEA002398（PAE10）和TEA009391（PAE10）具有全部保守基序；TEA023165（PAE8）和TEA023839（PAE5）缺少中間的保守基序NaAYDSWQ；TEA0332199（PAE12）缺少N端的保守基序CLDG和PxYH，而Tea_47238（PAE9）缺少C端的保守基序HCQ（圖1-C）。蛋白保守基序的缺失尤其是N端和C端保守基序的缺失，可能源于基因的選擇性剪切，也可能是測(cè)序或拼接不完全造成的。

2.3 茶樹(shù)PAEs的克隆和命名

為了驗(yàn)證和進(jìn)一步分析，我們以鄂茶1號(hào)葉片cDNA為模板，以拼接的和設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，采用PCR對(duì)和進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增得到了符合預(yù)期大小的單一條帶（圖2-A）?；厥諚l帶后進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，和大小分別為1191?bp和1?251?bp，與預(yù)期大小完全一致，分別命名為和（表1）。隨后，對(duì)ClCsPAE9和ClCsPAE12進(jìn)行了保守基序分析，發(fā)現(xiàn)二者均具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ和HCQ 9個(gè)保守基序（圖1-C）。

網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)不僅僅只是為教師組織教學(xué)提供了教學(xué)平臺(tái)，更重要的是為學(xué)生提供了一個(gè)巨大的資源庫(kù)。大部分的網(wǎng)絡(luò)教學(xué)平臺(tái)都有功能支持教師與學(xué)生的互動(dòng)交流，從而有效地?cái)U(kuò)展了我們的教學(xué)空間。教師也可以從平臺(tái)的資源庫(kù)中調(diào)取各種學(xué)習(xí)資源，尤其是可以從一些精品課程中獲取各種適用的資料用于教學(xué)。

通過(guò)多重序列比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)TEA033219與ClCsPAE12相似性96.8%（圖2-B），Tea_47238與ClCsPAE9相似性100%（圖2-C），推測(cè)TEA033219是ClCsPAE12的亞型，Tea_47238是ClCsPAE9的亞型，是由基因可變剪切引起的。同樣地，TEA023165與Tea_42986（PAE8）相似性96.7%，Tea_23392與Tea_42986（PAE8）相似性97.3%，推測(cè)TEA023165和Tea_23392均是Tea_42986的亞型，是基因不同可變剪切類(lèi)型造成的。此外，TEA023839與Tea_32472（PAE5）相似性85.2%，TEA002398和TEA009391（PAE10）相似性81.0%，且二者局部序列完全相同，推測(cè)也是選擇性剪切形成的不同蛋白。相關(guān)推測(cè)有待通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

注：A: 72個(gè)植物PAEs的保守基序，B、C：12個(gè)茶樹(shù)PAEs保守基序

至于Tea_42986（PAE8）與TEA022428（PAE8）二者相似性為82.9%，是2個(gè)不同的PAEs。由于Tea_42986與AtPAE8相似性高于TEA022428與AtPAE8的相似性，因此將Tea_42986命名為CsPAE8，TEA022428命名為CsPAE8-like。

綜上，我們?cè)诓铇?shù)中共鑒定了12個(gè)PAE蛋白包括CsPAE5（Tea_32472）及亞型CsPAE5-1（TEA023839）、CsPAE8（Tea_429862）及亞型CsPAE8-1（Tea_23392）和CsPAE8-2（TEA023165）、CsPAE8-like（TEA022428)、CsPAE9（ClCsPAE9）及亞型CsPAE9-1（Tea_47238）、CsPAE10（TEA002398）及亞型CsPAE10-1（TEA009391）和CsPAE12（ClCsPAE12）及亞型CsPAE12-1（TEA033219）（表1）。

2.4 茶樹(shù)PAE進(jìn)化樹(shù)分析

為了了解茶樹(shù)PAEs同其他植物的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA X構(gòu)建了69個(gè)植物PAEs的進(jìn)化樹(shù)。69個(gè)植物PAEs分別是：水稻（）7個(gè)、二穗短柄草（）6個(gè)、高梁（）6個(gè)、擬南芥（）12個(gè)、大豆（）7個(gè)、番茄（）7個(gè)、葡萄（）5個(gè)、楊樹(shù)（）8個(gè)、可可（）6個(gè)和茶樹(shù)（）5個(gè)。進(jìn)化樹(shù)表明（圖3），69個(gè)植物PAEs被聚為了4組，一組包括6個(gè)PAEs，PAE1、PAE2、PAE3、PAE6、PAE10和PAE12；二組包括PAE7、PAE8和PAE11；三組包括PAE4和PAE5；第四組僅包括1個(gè)PAE9。5個(gè)茶樹(shù)PAEs包括CsPAE5、CsPAE8、CsPAE9、CsPAE10和CsPAE12分別聚到了相應(yīng)組，并且在距離上同可可、葡萄PAEs較近，同單子葉植物（水稻和二穗短柄草）PAEs較遠(yuǎn)。此外，同一亞組的單子葉植物PAEs明顯地聚在了一起。

圖2 CsPAE9和CsPAE12的克隆（A）及蛋白比對(duì)（B、C）

Fig. 2The cloning ofand(A), and protein blast (B, C)

注：M：線(xiàn)粒體；S：分泌蛋白；Ch：葉綠體；V：液泡；Cy：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)；Ex：胞外基質(zhì)?！?”表示預(yù)測(cè)結(jié)果相同

Notes:M: Mitochondria. S: Secretory protein. Ch: Chloroplast. V: Vacuole. Cy: Cytoplasmic matrix. Ex: Extracellular matrix. “*” indicate same predicted results

2.5 茶樹(shù)PAE蛋白基本特性分析和亞細(xì)胞定位分析

使用在線(xiàn)ProtParam 軟件（https://web.expasy.org/protparam）對(duì)茶樹(shù)PAEs進(jìn)行了分析。12個(gè)CsPAEs氨基酸平均大小為395，變化范圍為326~515；蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為36.7~56.9?kDa和5.1~8.9（表1），與擬南芥的氨基酸平均大小413，變化范圍326~451、蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為39~49?kDa和5.7~9.4基本一致。

信號(hào)肽是新合成肽鏈中指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的一段N端序列，一般由15~30個(gè)氨基酸組成，是新生蛋白分泌到胞外的信號(hào)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，12個(gè)CsPAEs中，除CsPAE5、CsPAE5-1和CsPAE10-1不具有N端信號(hào)肽外，其他9個(gè)CsPAEs具N端信號(hào)肽，大小為19~24個(gè)氨基酸，是分泌蛋白（表1）。令人疑惑地是，CsPAE10具N端信號(hào)肽，而CsPAE10-1不具有N信號(hào)肽。

亞細(xì)胞定位是某種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位，蛋白的亞細(xì)胞定位分析有助于蛋白功能的初步判斷。我們使用TargetP、LOCtree 和Wolf軟件對(duì)12個(gè)CsPAEs進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)CsPAEs 3種預(yù)測(cè)結(jié)果相同，7個(gè)CsPAEs 2種預(yù)測(cè)結(jié)果相同，僅CsPAE10-1 3種預(yù)測(cè)結(jié)果均不同，推測(cè)CsPAE5、CsPAE5-1定位于線(xiàn)粒體，9個(gè)具N端信號(hào)肽的蛋白包括CsPAE8、CsPAE8-1、CsPAE8-2、CsPAE8-like、CsPAE9、CsPAE9-1、CsPAE10、CsPAE12及CsPAE12-1是分泌蛋白，定位于細(xì)胞壁。值的提及地是，CsPAE10-1使用TargetP未定位于線(xiàn)粒體、葉綠體、胞外且另外兩種預(yù)測(cè)結(jié)果不同，無(wú)法預(yù)測(cè)定位。隨后，使用核定位軟件cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）、過(guò)氧化物酶體定位信號(hào)PTS1預(yù)測(cè)器（http://mendel.imp.ac.at/pts1）、跨膜螺旋預(yù)測(cè)軟件TMHMM Server （http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM）對(duì)CsPAE10-1進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsPAE10-1無(wú)跨膜螺旋、無(wú)核和過(guò)氧化物酶體定位信號(hào)，因此推測(cè)其為細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白，結(jié)果尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsPAE5、CsPAE5-1、CsPAE12和CsPAE12-1具有1~2個(gè)跨膜螺旋，是跨膜蛋白，這與Philippe等[5]報(bào)道的擬南芥PAEs沒(méi)有跨膜蛋白結(jié)果并不相符。

圖3 10個(gè)植物的69個(gè)PAEs進(jìn)化樹(shù)

sFig. 3Phylogenetic tree of 69 PAEs from 10 plantspecies

3 討論

果膠是植物細(xì)胞壁的重要組成成分之一，在其從高爾基體向胞外泌出的過(guò)程中常發(fā)生乙酰化修飾，其乙?；某潭仁芮懈钜阴ｕユI的PAE的調(diào)控[7-8,11]。研究發(fā)現(xiàn)，PAE在植物生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)硬度和脅迫防御中具有重要作用[9,12,15-16]。

PAE是一個(gè)多基因家族，具有保守的PAE結(jié)構(gòu)域。使用PAE保守結(jié)構(gòu)域，在茶樹(shù)舒茶早基因組和三代數(shù)據(jù)中檢索到24個(gè)蛋白。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，24個(gè)蛋白中僅有10個(gè)PAEs結(jié)構(gòu)域序列完整，且10個(gè)中僅有6個(gè)源于基因組，表明基因組測(cè)序并不完全或序列注釋并不完整。為了進(jìn)一步分析，我們克隆了PAE9和PAE12 CDS全長(zhǎng)。在茶樹(shù)中鑒定了12個(gè)PAEs，這和水稻10個(gè)、擬南芥12個(gè)、番茄13個(gè)、葡萄7個(gè)、楊樹(shù)14個(gè)、獼猴桃10個(gè)和可可14個(gè)PAEs的結(jié)果基本一致。經(jīng)過(guò)與擬南芥PAEs序列比對(duì)，初步推測(cè)12個(gè)茶樹(shù)PAEs屬于5個(gè)PAEs（成員），分別是PAE5、PAE8、PAE9、PAE10和PAE12。12個(gè)CsPAEs序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5個(gè)PAEs均存在不同的亞型，表明PAE基因發(fā)生了可變剪切事件。

蛋白保守基序分析發(fā)現(xiàn)，CsPAEs具有CLDG、PxYH、GGGWC、GS、NWN、rYCDG、GCSAG、NaAYDSWQ、HCQ等共9個(gè)保守基序，較之于72個(gè)植物PAEs的保守基序CLDG、PxYh、gGxwC、GS、Nwn、rYCDg、GCSxG、NxayDxwQ和HCQ更為保守[5]，表明了茶樹(shù)PAEs的保守性及與其他植物的分化。69個(gè)植物PAEs的進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，不同物種同源PAEs明顯地聚在了一起，表明PAEs在不同物種間具有高度保守性；CsPAEs與同為木本植物的可可、葡萄進(jìn)化距離較近，表明它們間親緣關(guān)系較近。此外，亞組內(nèi)的單子葉植物PAEs聚在一起并與雙子葉植物PAEs明顯地分離，揭示了單子葉植物和雙子葉植物的分化。

12個(gè)CsPAEs亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，除CsPAE10-1定位外，其他11個(gè)CsPAEs的定位與擬南芥同源PAEs定位一致[5]，再次表明PAEs在不同的物種間具有高度的保守性，并且可能具有相同的生理生化功能。CsPAE8及亞型、CsPAE8-1ike、CsPAE9及亞型、CsPAE10-2、CsPAE12及亞型定位于細(xì)胞壁，表明它們?cè)诩?xì)胞壁執(zhí)行功能。通過(guò)序列比對(duì)，前期在茶樹(shù)葉片中鑒定到的響應(yīng)氟脅迫的PAE是PAE8-1ike。鑒于CsPAE8-1ike定位于細(xì)胞壁并在氟脅迫后表達(dá)上調(diào)，推測(cè)CsPAE8-1ike可能通過(guò)調(diào)控果膠去乙?；饔脜⑴c茶樹(shù)葉片細(xì)胞壁對(duì)氟富集和解毒。然而，具體功能的解析尚需進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法共鑒定了12個(gè)茶樹(shù)PAEs，并對(duì)它們進(jìn)行了命名、進(jìn)化分析、基本特性分析和亞細(xì)胞定位分析，以期為探討CsPAE在茶樹(shù)葉片氟富集和解毒過(guò)程中的功能提供研究基礎(chǔ)。

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Identification and Bioinformatic Analysis of Pectin Acetylesterases fromTea Plant

LIU Yanli, MA Linlong, CAO Dan, JIN Xiaofang*,FENG Lin, GONG Ziming

Institute of Fruit and Tea, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430209, China

Tea plant is a fluoride hyperaccumulator with high fluoride in leaves, which has many health benefits to human body. Tea pectin acetylesterase (PAE) may be related to fluoride accumulation and detoxification by regulating pectin deacytelation. However, few reports on tea PAEs were available. In the study, the identification and analysis of characteristic, evolutionary and subcellular localization of CsPAEs were performed by bioinformatics method based on tea genome database and three next-generation sequencing data ofvar. sinensis cv ‘Shuchazao’. The results indicate that 12 CsPAEs belonged to five members, including PAE5, PAE8, PAE9, PAE10 and PAE12. Nine conserved motifs including CLDG, PxYH, GGGWC, GS, NWN, rYCDg, GCSAG, NaAYDSWQ and HCQwere found in CsPAEs;CsPAEs were more closely related to PAEs ofandaccording toevolutionary relationship; Amino acid length, molecular weight and theoretical isoelectric point of 12 CsPAEs varies from 326-515, 36.7-56.9?kDa and 5.1-8.9, respectively. Except that CsPAE5 and CsPAE5-1 were predicated to be localized in the mitochondrion, and CsPAE10-1 might be present in cellular martix. The rest CsPAEs were predicated to be localized in the cell wall. CsPAE5, CsPAE5-1, CsPAE12 and CsPAE12-1 were transmembrane proteins. The results provided a foundation for functional analysis of CsPAEs involved in fluoride accumulation and detoxification.

tea plant (), pectin acetylesterase, identification, bioinformatics analysis

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2019)05-521-09

2019-03-28

2019-04-23

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目（2017NKYJJ05）、湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目（2016-620-000-001-032）

劉艷麗，女，博士，主要從事茶樹(shù)栽培育種與生物技術(shù)研究。*通信作者：jxf1130@126.com