響應(yīng)面優(yōu)化蟬花孢梗束麥角甾醇超聲波協(xié)同微波輔助提取工藝

許艷紅，于士軍，陳磊，于愛文，柴新義，王維坤

（1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239012；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；3.通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司，安徽滁州239000）

蟬花（Isaria cicadae），又名金蟬花、蟬蟲草、蟬茸等，隸屬于麥角菌科、蟬棒束孢菌屬，是寄生在蟬幼蟲上的一種昆蟲真菌，由蟲和孢梗束兩部分組成[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明蟬花具有雙向免疫調(diào)節(jié)[2]、抗腫瘤[3-4]、改善腎功能[5]、降血糖[6]、抗衰老[7]、鎮(zhèn)痛[8]等作用。蟬花又是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的食用菌，其中含有多種生物堿、多糖、核苷類成分、蟲草酸、蛋白質(zhì)、多種必需氨基酸、環(huán)肽化合物、甘露醇、麥角甾醇等有效成分[9-12]?，F(xiàn)今對蟬花的利用還停留在作為藥物的初級產(chǎn)品上，而深加工產(chǎn)品還比較少見。要開發(fā)深加工產(chǎn)品，對蟬花展開深層次利用就需要深入研究蟬花中的活性成分。因此，現(xiàn)今要研究的重點(diǎn)問題就是蟬花孢梗束中化學(xué)成分的提取檢測與利用問題。

在蟬花孢梗束活性成分中麥角甾醇的獲得是相當(dāng)具有吸引力的。這種甾醇在紫外線的照射下，發(fā)生一系列的變化可轉(zhuǎn)化成維生素D2，因此其可以作為一種重要的維生素D 源，以及重要的醫(yī)藥中間體和食品添加劑，發(fā)揮人體對鈣吸收和利用的促進(jìn)作用，對骨質(zhì)疏松和佝僂病的治療具有一定的功效。它還表現(xiàn)出一定的抗氧化性和抗炎性以及抗高血脂癥等作用，并且麥角甾醇過氧化物還具有潛在的抗癌性[5，13]。此外，麥角甾醇還能作為測定生物量的重要指標(biāo)，與葡糖胺相比，其更具特征性，因此可以用于真菌生物量的測定[14]。在現(xiàn)階段尋求一種簡便快速、無毒安全、高效節(jié)能的綠色萃取麥角甾醇的技術(shù)是研究的熱點(diǎn)。近年來，超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)以不限制物料尺寸、不需要載氣、熱解速度快、易于控制、強(qiáng)選擇性以及操作簡便、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于天然活性成分的提取[15]，而有關(guān)超聲-微波協(xié)同輔助提取蟬花孢梗束麥角甾醇鮮見報(bào)道。

本文以蟬花蟲草孢梗束粉為研究對象，采用超聲波協(xié)同微波輔助提取麥角甾醇，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，以提高麥角甾醇的產(chǎn)量，以期對蟬花孢梗束麥角甾醇的提取工藝的后續(xù)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟬花蟲草孢梗束粉：滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；麥角甾醇對照品（純度99%）：上海金穗生物科技有限公司；去離子水：滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；95%乙醇（分析純）、三氯甲烷（分析純）：上海振企化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（HPLC-310）：江蘇天瑞儀器股份有限公司；微波-紫外-超聲波三位一體萃取反應(yīng)儀（UWave-1000）：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；潔盟牌超聲清洗機(jī)（JP-020）：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；臺式低速大容量離心機(jī)（湘儀L-550）：上海申光儀器儀表有限公司；新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；分析天平（FA2204B）、電子天平（JA5003J）：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟬花孢梗束麥角甾醇的提取和檢測

1.3.1.1 麥角甾醇提取

蟬花孢梗束粉→浸泡12 h→超聲波協(xié)同微波輔助提取→離心（4 000 r/min，10 min）→取上清液→過濾→高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析[16]。

1.3.1.2 高效液相色譜檢測條件

色譜柱：Agilent C18反相色譜柱（C184.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器：紫外燈光檢測器；流動相：甲醇；檢測波長：282 nm；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；采樣時間：15 min[17]。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶解于無水乙醇中，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別吸取 0、1、2、4、8、10 mL，各自用無水乙醇補(bǔ)至 10 mL，配制成濃度分別為 0、10、20、40、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.22 μm 濾膜過濾后采用高效液相色譜法進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和峰面積計(jì)算回歸方程。

1.3.2 方法學(xué)考察

1.3.2.1 精密度試驗(yàn)

吸取濃度為10 μg/mL 的麥角甾醇對照品溶液10 μL，采用1.3.1 的檢測方法檢測5 次，記錄峰面積并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取蟬花孢梗束粉樣品5 份，各0.25 g，分別加入20 mL 95%乙醇溶解，浸泡12 h，在超聲波功率100 W，微波功率 100 W，液料比 80 ∶1（mL/g）條件下提取15 min，將樣品溶液分別進(jìn)行測定，記錄峰面積并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取蟬花孢梗束粉樣品0.25 g，加入20 mL 95%乙醇溶解，浸泡12 h，在超聲波功率100 W，微波功率100 W，液料比 80 ∶1（mL/g）條件下提取 15 min，樣品溶液按 1.3.1 檢測方法分別隔 0、4、8、12、24 h 測定，記錄峰面積并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱取蟬花孢梗束粉樣品3 份，各0.25 g，分別加入3、4、5 mL 100 μg/mL 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，提取液按1.3.1檢測方法分別進(jìn)行測定并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差[18]。

1.3.3 蟬花孢梗束麥角甾醇的計(jì)算

采用高效液相色譜法得到的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出麥角甾醇的質(zhì)量濃度，采用下面公式計(jì)算出蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率[19]。

式中：X 為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的麥角甾醇的質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為提取溶液的總體積，mL；m 為蟬花孢梗束粉質(zhì)量，g。

1.3.4 超聲波-微波提取麥角甾醇的工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

1）提取時間對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響

稱取蟬花孢梗束粉末0.25 g，在提取溶劑為95%乙醇，超聲波功率100 W，微波功率100 W，液料比80 ∶1（mL/g）的條件下，設(shè)置提取時間為 5、10、15、20、30 min 5 個水平，研究提取時間對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響，每個水平重復(fù)3 次[16]。

2）乙醇濃度對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響

稱取蟬花孢梗束粉末0.25 g，在超聲波功率100 W，微波功率 100 W，液料比 80 ∶1（mL/g），提取時間 15 min的條件下，設(shè)置乙醇濃度為35%、50%、65%、80%、95 %5 個水平研究乙醇濃度對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響，每個水平重復(fù)3 次[20]。

3）液料比對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響

稱取蟬花孢梗束粉末0.25 g，在提取溶劑為95%乙醇，超聲波功率100 W，微波功率100 W，提取時間15 min 的條件下，設(shè)置液料比為 20 ∶1、40 ∶1、60 ∶1、80 ∶1、100 ∶1（mL/g）5 個水平，研究液料比對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響，每個水平重復(fù)3 次[21]。

4）超聲波功率對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響

稱取蟬花孢梗束粉末0.25 g，在提取溶劑為95%乙醇，液料比 80 ∶1（mL/g），微波功率 100 W，提取時間15 min 的條件下，設(shè)置超聲波功率為 50、75、100、125、150、200 W 5 個水平研究超聲波功率對蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率的影響，每個水平重復(fù)3 次。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以95%的乙醇為提取溶劑，麥角甾醇提取得率為響應(yīng)值，提取時間、超聲波功率、液料比為自變量進(jìn)行條件優(yōu)化。采用Box-Behnken三因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平和編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM-SPSS-Statistics 19 軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異用Duncan 新復(fù)極差法檢驗(yàn)；利用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析；數(shù)據(jù)圖采用Origin Pro 8.5.1 進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

按照1.3.1 的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，以峰面積為縱坐標(biāo)，麥角甾醇濃度（μg/mL）橫坐標(biāo)得到的線性回歸方程：Y=2 460.6X+3 138.6，R2=0.999 9，結(jié)果顯示，濃度在 10 μg/mL～100 μg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。采用濃度為10 μg/mL 的麥角甾醇對照品溶液，按1.3.1 色譜條件進(jìn)樣檢測5 次，得到結(jié)果的RSD 為0.35%，表明該方法的精密度良好。經(jīng)1.3.2 的重復(fù)試驗(yàn)方法處理樣品進(jìn)行檢測，測定5 次，得到的結(jié)果的RSD 為0.29%，表明該方法的重復(fù)性良好。經(jīng)1.3.2 的穩(wěn)定性試驗(yàn)方法處理樣品進(jìn)行檢測，得到的結(jié)果RSD 0.72%，表明樣品在24 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。按1.3.2 的加標(biāo)回收試驗(yàn)方法處理樣品進(jìn)行檢測，得到的結(jié)果平均回收率為99.90 %，RSD 為1.82 %，表明試驗(yàn)回收率較好。

2.2 單因素試驗(yàn)分析

提取時間、乙醇濃度、液料比、超聲波功率對麥角甾醇提取得率的影響見圖1。

圖1 提取時間、乙醇濃度、液料比、超聲波功率對麥角甾醇提取得率的影響Fig.1 The effects of extraction time，ethanol concentration，liquid-solid ratio，ultrasonic power on the yield of ergosterol

由圖1（A）可知，在提取時間為15 min 內(nèi)，麥角甾醇提取得率隨提取時間的增加而顯著提高，10 min～15 min 內(nèi)上升最快，差異最為顯著（P<0.05），在15 min左右麥角甾醇的提取得率達(dá)到最大值，提取時間延長，麥角甾醇的提取得率又顯著降低?？赡苁请S著提取時間延長，微波作用下溶液內(nèi)局部溫度上升過快，一方面導(dǎo)致麥角甾醇分子變性，另一方面溫度波動過大可能導(dǎo)致乙醇揮發(fā)過多，從而使得乙醇濃度降低，致使麥角甾醇的提取得率降低[22]。故選擇提取時間為15 min 較為合適。

由圖1（B）可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率隨乙醇濃度的增加而不斷提高，提取溶劑為95%的乙醇溶液時，麥角甾醇提取得率最高。乙醇濃度從50%到80%時，麥角甾醇的提取得率上升最快，乙醇濃度從80%到95%時，麥角甾醇提取得率上升緩慢，乙醇濃度為35%、50%、65%、80%時麥角甾醇提取得率與95%時的麥角甾醇提取得率差異顯著（P<0.05）?？紤]到實(shí)驗(yàn)室資源以及麥角甾醇提取得率隨乙醇濃度升高的變化趨勢，故選擇95%的乙醇溶液為提取溶劑。

由圖1（C）可知，不同液料比麥角甾醇的提取得率差異顯著（P<0.05），且液料比從 20 ∶1（mL/g）開始變化時，隨著液料比的增大麥角甾醇的提取得率提高，料液比達(dá)到80 ∶1（mL/g）左右時，提取得率達(dá)到最大值，此后隨著液料比的增大，麥角甾醇的提取得率有所降低。用溶液從固體中萃取目的物質(zhì)時，液料比不同導(dǎo)致液相、固相之間的濃度差的不同，從而傳質(zhì)推動力就會出現(xiàn)快慢，影響提取效果[22]。開始時由于液體過少，不足以萃取出麥角甾醇從而導(dǎo)致麥角甾醇提取率低，而隨著液料比增加，有效成分溶出也增加；但達(dá)到一定程度時其他成分溶出也增加，反而影響目標(biāo)物的提取或可能是因?yàn)槿軇┝窟^大時微波和超聲的能量過多作用于溶劑，物料吸收的能量反而變少，從而導(dǎo)致麥角甾醇的溶出量下降。因此，選擇液料比80 ∶1（mL/g）為最佳比例。

由圖1（D）可知，超聲波功率為 50、75 W 與 100 W時的麥角甾醇的提取得率差異顯著（P<0.05），超聲波功率為125、150 W 與100 W 時的麥角甾醇的提取得率差異不顯著（P<0.05），開始時隨著超聲波功率的增加，麥角甾醇的提取得率增加，超聲波功率為100 W左右時麥角甾醇的提取得率最大，功率再增加麥角甾醇提取得率有所降低。這可能是因?yàn)殡S著超聲波功率的增大，超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)就越強(qiáng)，細(xì)胞破碎的就越徹底[16]，從而麥角甾醇就能有效的溶出，但超聲波功率繼續(xù)增大對麥角甾醇的提取沒有多大的效果，甚至可能會降低其提取得率。因此，選擇超聲波功率100 W較為合適。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以95%乙醇溶液為提取溶劑，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波協(xié)同微波輔助提取蟬花孢梗束麥角甾醇工藝中提取時間、液料比、超聲波功率3 個參數(shù)。以麥角甾醇提取得率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken 的原理，采用Design-Expert 8.0 進(jìn)行設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Response surface test designs and extraction results

利用Design-Expert 8.0 軟件對表2 中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立提取時間、超聲波功率、液料比與蟬花孢梗束麥角甾醇提取得率之間的回歸模型，回歸方程為：

該回歸模型的可靠性可由結(jié)果分析和相關(guān)系數(shù)來判定，分析結(jié)果如表3 所示。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 3 Results of regression statistics analysis

續(xù)表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Continue table 3 Results of regression statistics analysis

當(dāng)P<0.05 時，則表示判定指標(biāo)是顯著的。運(yùn)用二次模型的變異分析，結(jié)果表示，建立的蟬花孢梗束麥角甾醇提取的模型中二次多項(xiàng)失擬項(xiàng)不顯著，模型極顯著（P<0.01），且由回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.953 5可知，該模型能解釋95.35%的響應(yīng)值的變化。因此，該模型的擬合度較好，可用于蟬花孢梗束麥角甾醇提取的分析和預(yù)測。一次項(xiàng)X1、X3不顯著，X2極顯著；二次項(xiàng) X22極顯著、X32顯著，X12不顯著；交互項(xiàng) X1X3極顯著，X1X2、X2X3不顯著；由F 值可以看出影響超聲協(xié)同微波提取蟬花孢梗束麥角甾醇的主次因素：X2超聲波功率>X3液料比>X1提取時間。

提取時間、超聲波功率和液料比對麥角甾醇提取得率的影響的響應(yīng)面和等高線見圖2。

圖2 提取時間、超聲波功率和液料比對麥角甾醇提取得率的影響的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour plots for effects of extraction time，ultrasonic power，and liquid-solid ratio on the yield of ergosterol

用Design-Expert 軟件得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，分析這些因素對麥角甾醇提取得率的交互影響。響應(yīng)面圖中圖的坡度越大則表明麥角甾醇的提取得率變化得越快，也即表明對麥角甾醇提取得率的影響更為顯著。而等高線圖中可以更加直觀地看出各個因素對麥角甾醇提取得率的影響，從而可以更好的找出最佳工藝參數(shù)；等高線中最小橢圓的中心即為響應(yīng)面的最高點(diǎn)，且等高線的形狀可以反映交互影響的強(qiáng)弱，橢圓即為影響顯著，圓形即為不顯著[21]。

由圖2 可知，提取時間與超聲波功率對麥角甾醇提取得率的交互影響呈拋物線形，等高線形狀比較接近圓。提取時間與液料比對麥角甾醇提取得率的交互影響的呈拋物線形，等高線圖為橢圓。超聲波功率與液料比對麥角甾醇的交互影響的呈拋物線形，等高線形狀最接近圓。說明提取時間和液料比對麥角甾醇提取得率的交互影響最為顯著，提取時間和超聲波功率以及超聲波功率和液料比對麥角甾醇的交互影響不顯著。且由3D 響應(yīng)面圖可知，超聲波功率與提取時間、液料比相比，其效應(yīng)曲線比較陡，超聲波功率等高線密度高于其余兩個因素的等高線密度，說明超聲波功率較提取時間、液料比對麥角甾醇提取得率的影響更為顯著。

2.3.2 最佳工藝的驗(yàn)證

由Design-Expert 模擬獲得的最優(yōu)組合為提取時間15.42 min、超聲波功率 119.12 W、液料比 82.58（mL/g），預(yù)測值為2.64 mg/g。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，微調(diào)變量參數(shù)得組合提取時間15 min，超聲波功率120 W，液料比 80 ∶1（mL/g），微波功率 100 W，95%乙醇為提取溶劑的條件下進(jìn)行提取，做3 個平行，得到麥角甾醇平均提取得率為2.68 mg/g，與預(yù)測值接近（P<0.05）。結(jié)果證明響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波協(xié)同微波輔助提取蟬花孢梗束麥角甾醇的工藝條件是可行的。

3 結(jié)論

確定提取溶劑時，曾采用蒸餾水、甲醇、乙醇、三氯甲烷提取蟬花孢梗束麥角甾醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用三氯甲烷與95%乙醇提取得率差異不明顯（P<0.05），且是最高的。陳紅梅[23]對紅曲中麥角甾醇提取時發(fā)現(xiàn)三氯甲烷提取率高，但三氯甲烷易揮發(fā)，對心、肝、腎有損害，遵循食品行業(yè)的安全性原則采用乙醇這種無毒無害試劑進(jìn)行提取。且王祿祿等[16]對元蘑中麥角甾醇提取時發(fā)現(xiàn)無水乙醇提取率最高。

本研究結(jié)合了超聲波協(xié)同微波輔助萃取技術(shù)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化了蟬花孢梗束麥角甾醇提取工藝，確定的最佳工藝為：提取時間15 min，超聲波功率 120 W，液料比 80 ∶1（mL/g），提取溶劑95%乙醇，微波功率100 W。在最佳工藝條件下，得到的麥角甾醇提取得率為2.68 mg/g，與在本實(shí)驗(yàn)室條件下采用超聲波破碎法[24]從蟬花孢梗束中得到的麥角甾醇提取得率2.13 mg/g 相比，高出25.82%，提高了蟬花孢梗束麥角甾醇的提取得率。且與傳統(tǒng)的水浴鍋加熱法提取[17，20]相比大大縮短了提取時間，操作更加簡便，選擇性更高，熱解速度快。該提取工藝對蟬花孢梗束麥角甾醇的相關(guān)研究提供參考，對于蟬花孢梗束的進(jìn)一步利用具有重要意義。