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    原始森林高產(chǎn)纖維素酶刺器腐霉的篩選鑒定

    2019-10-12 02:50:06何海燕付躍秦文芳張玉蘭甘小富覃擁靈
    食品研究與開發(fā) 2019年19期
    關鍵詞:剛果紅進化樹羧甲基

    何海燕,付躍,秦文芳,張玉蘭,甘小富,覃擁靈,*

    (1.河池學院化學與生物工程學院,廣西宜州546300;2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室,廣西宜州546300)

    纖維素是植物纖維的主要成分,約占植物總干重的30%~50%[1],是分布最廣的天然碳水化合物,也是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。Z˙ywicka 等估計全世界每年通過光合作用產(chǎn)生的纖維素高達1.55×109噸,其中89%尚未被人類利用[2]。利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶將其轉(zhuǎn)化為人類急需的能源食物和化工原料,對人類社會的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義。纖維素酶在食品、飼料、紡織和洗滌等行業(yè)具有較大的應用潛力。Stevenson 研究認為篩選出產(chǎn)高活性纖維素酶的菌株是開發(fā)利用纖維素資源的前提和關鍵[3]。

    本課題以原始森林腐爛木材下的土壤為原料,以羧甲基纖維素鈉(carboxyl methyl cellulose,CMC-Na)為唯一碳源進行篩選,純化并經(jīng)過剛果紅染色鑒定后,得到4 株產(chǎn)透明圈的菌株。對該菌株進行葡聚糖內(nèi)切酶(endo-glucanase,CMCase)活性鑒定,完成高產(chǎn)纖維素酶菌種篩選鑒定研究,為纖維素酶進一步的研究工作奠定了基礎。

    1 材料與儀器

    1.1 試劑

    參照張煒煒方法配置pH 4.8 醋酸-醋酸鈉緩沖液[4];3,5-二硝基水酸溶液:上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;0.9%生理鹽水:微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室配置;參照杜健配置3,5-二硝基水楊酸溶液(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)[5];參照陳玉方法配置1%CMC-Na[6],溶液稱取0.625 g 羧甲基纖維素鈉,加熱溶解于pH4.8 醋酸-醋酸鈉緩沖液并定容至100 mL。

    樣品:采自廣西羅城小長安水上相思林原始森林腐木下,取腐爛木材地表下5 cm~15 cm,100 g,保鮮膜密封,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 儀器與設備

    BX51 顯微鏡:奧林巴斯(OLYMPUS)專業(yè)公司;GZX-GF101-2S 電熱恒溫鼓風干燥箱、SPX-150 生化培養(yǎng)箱:上海躍進醫(yī)療器械有限公司;UV-2802 紫外可見分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;LDZX-5OFAS 立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;xMark 酶標儀:BIO-RAD 公司;SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺:蘇州安泰空氣技術有限公司;YHG-型搖床:上海欣蕊自動設備有限公司。

    2 試驗方法

    2.1 培養(yǎng)基配置

    參照Saritha 等的方法配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)平板和斜面培養(yǎng)基[7]:馬鈴薯200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂 15 g,蒸餾水 1 000 mL,pH7。

    參照張靜靜方法配置CMC-Na 篩選培養(yǎng)基[8]:CMC-Na 5 g,牛肉浸膏1 g,蛋白胨1 g,MgSO40.5 g,KH2PO31 g,K2HPO31 g,瓊脂 20 g,水 1 000 mL,pH7,121 ℃滅菌 20 min。

    應用 Biochof 等的產(chǎn)酶培養(yǎng)基[9]:CMC-Na 5 g,酵母膏 2g,MgSO45g,水 1000mL,pH7。每個培養(yǎng)瓶 250mL。

    2.2 樣品處理

    將原始森林腐爛木材下的土壤樣品梯度稀釋,各取10-4~10-63 個稀釋度0.1 mL 涂布以CMC-Na 為唯一碳源的篩選平板,37 ℃倒置培養(yǎng)72 h,分離旺盛生長的菌株。

    2.3 剛果紅染色鑒定法

    采用張煒煒剛果紅染色鑒定法[10],將所分離的菌株活化后,點樣接種于篩選培養(yǎng)基CMC-Na 平板并做好標記,倒置培養(yǎng)72 h,加入適量1 mg/mL 剛果紅溶液,染色3 h 后棄去染液,加入適量1 mol/L NaCl 溶液脫色1 h。根據(jù)透明圈大小及透明圈菌落直徑比選擇產(chǎn)酶菌株。

    2.4 接種和產(chǎn)酶培養(yǎng)

    將平板上的單菌落挑起,在斜面培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)。每天觀察,待菌種長后,用10 mL 生理鹽水洗下制成孢子液或單細胞菌懸液(部分留作甘油種),取1 mL轉(zhuǎn)入產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng),100 r/min,培養(yǎng)3 d。

    2.5 粗酶液的制備

    應用何海燕等的粗酶液的制備方法[11],取1 mL 孢子懸液或單細胞菌懸液轉(zhuǎn)入產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng),100 r/min,培養(yǎng)3 d,將纖維素酶發(fā)酵液用6 層紗布過濾,4 000 r/min,離心10 min,上清液即為粗酶液。

    2.6 纖維素酶酶活性檢測

    參照盧憲芹配制葡萄糖標準液[12]:將葡萄糖放在110 ℃烘箱中烘2 h 至恒重,稱取0.108 g 葡萄糖,用蒸餾水溶解定容至100 mL 制成6 μmol/mL 的葡萄糖標準液。

    取6 支洗凈烘干的20 mL 具塞刻度試管,編號后分別加入 1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,補加蒸餾水至總體積為2 mL,配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后,向各試管中加入2 mL DNS 溶液,搖勻后沸水浴5 min,取出冷至25 ℃后,用蒸餾水定容至20 mL,充分混勻。在540 nm波長下,以1 號試管溶液作為空白對照,調(diào)零點,測定其它各管溶液的光密度值并記錄結(jié)果。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標,OD 值為縱坐標,繪制標準曲線。計測出其在540 nm 處的吸光度,得出還原糖的量。

    參照宋嶸錫的羧甲基纖維素酶活力(CMCase)的測定方法[13]:取4 支洗干凈烘干的試管,編號后,取1%的 CMC-Na 溶液 3.8 mL(CMC-Na 溶于 pH 值為 4.8 的醋酸緩沖液)作為底物,同時一號試管加入3.8 mL 蒸餾水作為空白對照組,50 ℃保溫酶解反應30 min,加入經(jīng)稀釋10 倍的粗酶液0.2 mL,于50 ℃反應30 min,加入1 mL DNS,1 mL 2 mol/L NaOH,沸水浴10 min,冷卻后加水稀釋到25 mL,于540 nm 測定還原糖量。以1 號試管溶液為空白對照調(diào)零點,在540 nm 波長下測定2、3、4 號試管液的吸光度值并記錄結(jié)果。根據(jù)3 個重復光密度的平均值,在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量,計算出CMC 酶活力。

    2.7 菌落形態(tài)觀察

    通過對平板生長菌落的形態(tài)、大小、顏色、菌絲及孢子的觀察對菌落進行初步鑒定。

    2.8 顯微觀察

    參照高鴻健插片法[14]:用鑷子把滅過菌的蓋玻片斜插入涂布接種的PDA 平板培養(yǎng)基上,每塊板插3片~5 片,培養(yǎng)3 d~5 d,可以在不同生長期小心取出蓋玻片,在顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗、孢子的形態(tài)。

    2.9 分子鑒定

    菌體總DNA 的提取:新鮮培養(yǎng)的菌絲加入液氮,在研缽中充分研磨變成粉末,總DNA 的提取參照Michaelson 等方法進行[15]。總 DNA 純化晾干后加 100 μL TE 緩沖液(pH7.4)充分溶解后在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴展5.8S 核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)域DNA 序列(internally transcribed spacer regions and the ribosomal,ITS) 鑒定菌種:PCR 引物按 White 等報道設計[16],引物 ITS1 的序列:5`TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3`,引物 ITS4 的序列:5`TCCTCCGCTTATTGATATGC3`。PCR 擴增體系為:10×Ex Taq 緩沖液 5 μL,菌體總 DNA 2 ng,10 mmol/L dNTP 1 μL,20μmol/L ITS1 引物 0.5 μL,20μmol/L ITS4引物0.5μL,TaqTM聚合酶2U,加去離子水補足至50μL。

    PCR 反應條件為:95 ℃預變性 5 min,95 ℃ 50 s,52 ℃ 40 s,72 ℃ 50 s,30 個循環(huán)后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,用PCR 純化試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物,對ITS 基因片段測序,利用BLAST 軟件在NCBI 進行同源性比較。檢索得到的同源性較高的序列用Vector NTI 軟件整理排列,用分子進化遺傳分析軟件MEGA7,neighbor joining method 構建系統(tǒng)發(fā)生樹。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 產(chǎn)纖維素酶細菌的篩選

    樣品經(jīng)富集之后,在篩選培養(yǎng)基上共篩選出12 株長勢良好的菌株,經(jīng)篩選培養(yǎng)基原位多次點種剛果紅染色鑒定,有4 個菌落周圍均有透明圈,2 號菌株產(chǎn)生的透明圈大而清晰,直徑可達21 mm,將此菌株命名為H-2。

    3.2 菌株的酶活測定結(jié)果

    根據(jù)葡萄糖標準溶液光密度測定結(jié)果,繪制葡萄糖標準曲線,見圖1。

    圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose concentration

    H-2 液體培養(yǎng)3 d,測定粗酶活性,在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量,計算出CMC 酶活為130 U/mL。試驗結(jié)果表明,H-2 菌株分泌CMC 酶的能力較強,有進一步研究開發(fā)的價值。

    3.3 菌株的形態(tài)和顯微鑒定

    H-2 菌株在PDA 平板上培養(yǎng)4 d 后的生長情況見圖2。

    圖2 H-2 菌株在PDA 平板上培養(yǎng)4 d 后的生長情況Fig.2 Growth of H-2 strain cultured on PDA plate for 4 days

    H-2 菌落在PDA 平板上形成由中心向外3 層的菌圈,菌落中心為黃白色油狀滴,往外為藍紫色圈,菌落為絲狀菌絲,最外層為較大的白色絨狀圈,在PDA培養(yǎng)基生長3 d 直徑可達3 cm。

    H-2 菌株剛果紅染色產(chǎn)生的透明圈見圖3。

    圖3 H-2 菌株剛果紅染色產(chǎn)生的透明圈Fig.3 H-2 produced clear hydrolytic zone around its colony on a Congo red dyeing agar plate

    H-2 菌在CMC-Na 上培養(yǎng)3 d,經(jīng)剛果紅染色出現(xiàn)較大透明圈,直徑達2 cm~3 cm。

    H-2 菌株的光學顯微鏡圖見圖4。

    圖4 光學顯微鏡圖Fig.4 Optical microscope

    利用插片法在光學顯微鏡下觀察,H-2 菌絲有分枝,且有橫隔,分生孢子梗聚集,呈條狀,表面光滑,顯綠色。

    H-2 掃描電子顯微鏡相片見圖5。近端處分枝,孢子絲發(fā)育到一定階段便分化為分生孢子,孢子橢圓形,孢子囊絲狀有隔膜,孢子橢圓形。孢子囊相互連接。H-2 菌株菌落形態(tài)特征、顯微特征都和霉菌屬菌株一致,依據(jù)魏景超方法初步推斷為霉菌屬菌株[17]。

    圖5 H-2 掃描電子顯微鏡相片F(xiàn)ig.5 The scanning electron micrograph of H-2

    3.4 菌種分子鑒定

    H-2 系統(tǒng)進化樹見圖6。

    圖6 H-2 系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of H-2

    依據(jù)Bruns 等和Gardes 等方法,ITS 序列在相同物種之間高度同源,是物種鑒定的可信的基因標記[18-19]。PCR 成功擴增得到 02 菌株 ITS 序列 752bp,BLAST 比對,以比對得到的相近ITS 序列建立進化樹。02 系統(tǒng)進化樹顯示,02 菌株和刺器腐霉 (Pythium acanthophoron)處于進化樹同一分支上,兩者ITS 位點序列有100%的相似性,表明該菌株和刺器腐霉(P.acanthophoron)分類地位很接近,有很近的親緣關系。

    4 結(jié)論

    原始森林土壤中蘊含豐富微生物菌種資源,從原始森林取樣可以篩選得到酶學性質(zhì)優(yōu)良的菌種。從廣西羅城原始森林取樣篩選到4 株產(chǎn)纖維素酶菌株,其中經(jīng)剛果紅染色法證明H-2 在CMC-Na 篩選平板上形成的透明圈和菌落直徑最大,產(chǎn)羧甲基纖維素酶的能力強,液體發(fā)酵粗酶活測定發(fā)現(xiàn),H-2 菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)3 d,羧甲基纖維素酶活力達130 U/mL。H-2 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征鑒定為細菌桿菌屬菌株,羧甲基纖維素酶活較高,具有良好的應用前景。

    研究表明,腐霉屬(Pythium Pringsheim)可以產(chǎn)纖維素酶[20-22],但未見刺器腐霉(P.acanthophoron)產(chǎn)纖維素酶報道。課題計劃繼續(xù)開展刺器腐霉發(fā)酵條件優(yōu)化、纖維素酶純化及酶學特性研究,為該菌進一步運用打下試驗基礎。

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