N-myc下游調(diào)節(jié)基因4表達(dá)與小細(xì)胞肺癌化療多藥耐藥的關(guān)系

王瑜 黃峰 郭琳瑯

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院病理科（廣州510280）

肺癌是世界最常見的癌癥和導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的最主要原因［1］。據(jù)我國腫瘤登記中心2016年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，肺癌在我國男性腫瘤發(fā)病患者中占據(jù)榜首［2］。肺癌按照病理類型分類，主要包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌占新發(fā)肺癌的10%～15%［3］。目前對小細(xì)胞肺癌的臨床治療以化療為主，盡管患者對化療藥物反應(yīng)較敏感，但由于極易出現(xiàn)多藥耐藥，化療效果常不理想，臨床預(yù)后較差。因此，闡明小細(xì)胞肺癌化療耐藥的分子機(jī)制，提高小細(xì)胞肺癌的生存率，是當(dāng)今肺癌臨床治療的重要研究課題之一。N-myc下游調(diào)控基因（N-myc downstream regulated gene，NDRG）家族由4個(gè)成員組成，在細(xì)胞增殖和分化等過程中發(fā)揮作用。雖然對NDRG1和NDRG2進(jìn)行了廣泛的研究，但關(guān)于NDRG3和NDRG4的認(rèn)識卻很少［4］。NDRG4作為一種新的候選腫瘤抑制因子，與腫瘤的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和分期有顯著相關(guān)［5］。目前尚未見NDRG4與小細(xì)胞肺癌化療耐藥的相關(guān)報(bào)道。本研究采用免疫組化SP法檢測NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織及其正常肺組織中的表達(dá)情況，探討NDRG4與小細(xì)胞癌化療耐藥及臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1樣本收集小細(xì)胞肺癌組織收集于2013年1月至2017年10月期間南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院、中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院的手術(shù)及穿刺活檢標(biāo)本共48例，所有病例的病理診斷均經(jīng)兩位以上病理專家確診；另取48例正常肺組織作為對照。

1.2小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征男45例，女3例；60歲以下歲患者20例，60歲以上患者28例，中位發(fā)病年齡60歲；局限期（LD）患者28例，廣泛期（ED）患者20例；截止本研究結(jié)束仍存活患者12例，死亡患者36例。

1.3試劑濃縮型兔抗人NDRG4多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），通用型試劑盒（SP-9000），濃縮型DAB試劑盒、多聚賴氨酸、檸檬酸組織抗原修復(fù)液粉劑、PBS粉劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.4免疫組化步驟將石蠟切片置入100%二甲苯脫蠟2次，每次10 min。依次經(jīng)100%、95%、85%、75%乙醇和純水各1次，每次5 min；PBS洗3次，每次5 min；脫蠟后玻片放入盛有0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=6.0）微波進(jìn)行抗原修復(fù)15 min；冷卻至室溫。PBS洗3次，每次5 min；然后玻片用7%BSA（BPS∶BSA=100∶7）37 ℃下封閉30 min；滴加一抗（1∶200）4℃過夜孵育；室溫平衡30 min，PBS洗3次，每次5 min；玻片滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶2 000），37℃濕盒30 min；用PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB顯色5～10 min；PBS清洗DAB溶液，1次，每次5 min；蘇木素復(fù)染1 min，1%酒精鹽酸分化，自來水返藍(lán)；75%、85%、95%、100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，每次3 min。待玻片干燥后，用中性樹脂封片；結(jié)果判定：NDRG4陽性染色為細(xì)胞漿呈棕黃色。

1.5免疫組化陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)NDRG4陽性表達(dá)主要定位在細(xì)胞漿。按照半定量積分方法，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野（×200倍），判斷結(jié)果：綜合切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和著色強(qiáng)度評分，NDRG4陽性百分比評分：0%（0分），1% ～10%（1分），＞10%（2分）；染色強(qiáng)度評分：不著色（0分），弱著色（1分），中等強(qiáng)度以上著色（2分）。陽性細(xì)胞百分比與著色強(qiáng)度評分相加，總分0～2分為NDRG4表達(dá)缺失或低表達(dá)判為NDRG4表達(dá)陰性，3～4分判為NDRG4表達(dá)陽性。由2位病理醫(yī)師雙盲法讀片并計(jì)數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果均經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，NDRG4表達(dá)與臨床病理特征分析采用列聯(lián)表資料分析；多因素對小細(xì)胞肺癌患者生存時(shí)間的影響采用逐步Cox回歸模型分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及正常肺組織中的表達(dá)情況NDRG4陽性表達(dá)位于細(xì)胞漿（圖1）。NDRG4蛋白在48例小細(xì)胞肺癌組中，10例表達(dá)陽性，38例表達(dá)陰性，NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織中陽性表達(dá)率為20.83%（10/48）；NDRG4蛋白在48例正常肺組織中，45例表達(dá)陽性，3例表達(dá)陰性，NDRG4在正常肺組織中陽性表達(dá)率為93.75%（45/48）。NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)顯著低于正常肺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=52.151，P＜0.001）。

圖1 NDRG4的免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of NDRG4

表1 NDRG4表達(dá)與小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between NDRG4 expression and clinical pathological features of SCLC 例

2.2NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況其與臨床病理特征的關(guān)系NDRG4的表達(dá)與患者的性別無相關(guān)性（χ2=0.303，P=0.582）；NDRG4的表達(dá)與患者的年齡無相關(guān)性（χ2=0.317，P=0.573）；NDRG4的表達(dá)與患者的臨床分期無相關(guān)性（χ2=0.707，P=0.400）。見表1。NDRG4的表達(dá)與患者的Ki-67增殖指數(shù)有相關(guān)性（χ2=4.076，P=0.044），NDRG4陽性患者Ki-67增殖指數(shù)低于NDRG4陰性患者，提示NDRG4陽性的腫瘤增殖指數(shù)更低。

2.3NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況與化療耐藥以及生存期的關(guān)系48例小細(xì)胞肺癌患者中對化療敏感的23例，出現(xiàn)耐藥的25例，化療敏感的患者中NDRG4陽性表達(dá)率為34.78%（8/23），化療多藥耐藥的患者中NDRG4陽性表達(dá)率為8.00%（2/25），化療敏感的NDRG4陽性表達(dá)率患者顯著高于化療多藥耐藥的患者（χ2=5.210，P=0.033）。NDRG4的表達(dá)與患者的生存期有顯著的相關(guān)性，生存的12例患者中，NDRG4陽性者7例；死亡的36例患者中，NDRG4陽性者3例，NDRG4陽性的患者生存顯著高于NDRG4陰性的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.642，P=0.001）。

2.4小細(xì)胞肺癌患者生存分析采用逐步COX回歸模型分析NDRG4陽性表達(dá)與患者的生存時(shí)間的關(guān)系，變量的賦值情況見表2。其中變量“性別”的相對危險(xiǎn)度為7.260，即女性患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是男性患者的7.260倍（P=0.015），變量“NDRG4”的相對危險(xiǎn)度為7.590，即NDRG4陰性表達(dá)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)為NDRG4陽性表達(dá)患者的7.590倍（P=0.009），NDRG4的表達(dá)與患者生存曲線圖見圖2。變量“療效”的相對危險(xiǎn)度為2.244，即化療耐藥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)為化療敏感患者的2.244倍（P=0.035）（表3）。綜上所述，患者的性別、化療療效以及NDRG4的陽性表達(dá)均與患者的生存時(shí)間相關(guān)。

表2 變量的賦值Tab.2 Valuation of variables

圖2 NDRG4的表達(dá)情況與患者生存曲線圖Fig.2 NDRG4 expression and patient survival curve

表3 逐步COX回歸模型分析結(jié)果Tab.3 Analysis of stepwise COX regression model

3 討論

小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間短，進(jìn)展快，極易出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥?；熌退幮缘男纬砂殡S著細(xì)胞成分和生物過程的變化，如代謝重塑，膽固醇代謝可能有助于化療耐藥性［6］。此外，H3K9組蛋白甲基化可能在抑制腫瘤抑制基因和促凋亡基因的表達(dá)以促進(jìn)耐藥性中起到重要作用。在富含細(xì)胞成分的途徑中，TRIPATHI等［7］發(fā)現(xiàn)突觸小泡也可能在耐藥性中起重要作用，包括ABCC1相關(guān)多藥耐藥性中起關(guān)鍵作用的ATP合酶復(fù)合物。超級增強(qiáng)子在獲得化療耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用［8］。超級增強(qiáng)子作為跟蹤癌癥演變的生物標(biāo)志物，最終可能成為干預(yù)治療的重要目標(biāo)［9］。

靶向治療與免疫治療是近年來肺癌研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)［10］。近年針對非小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)的靶向藥物治療獲益，目前還沒有分子靶向藥物被批準(zhǔn)為小細(xì)胞肺癌患者的常規(guī)治療［11］。其中可用于小細(xì)胞肺癌化療耐藥的二線治療的單克隆抗體有nivolumab和pembrolizumab，nivolumab聯(lián)合ipilimumab與nivolumab單藥方案治療含鉑兩藥聯(lián)合化療進(jìn)展的晚期小細(xì)胞肺癌［12］。免疫療法PD-1/PDL-1抑制劑可針對化療耐藥的小細(xì)胞肺癌患者發(fā)揮持續(xù)療效，部分患者可長期生存獲益［13］。

NDRG家族作為與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)的新基因，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中的作用越來越受到關(guān)注。在中國胃癌患者中，NDRG4啟動子甲基化可以作為胃癌的診斷生物標(biāo)記物，并可以作為不良的臨床預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)［4］。另有學(xué)者［14］報(bào)道NDRG4在宮頸癌細(xì)胞中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，為宮頸癌的治療提供了潛在的分子靶標(biāo)。胃癌中NDRG4蛋白的表達(dá)與腫瘤的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和分期有顯著相關(guān)性，NDRG4可能是一種潛在的胃癌抑制和預(yù)后標(biāo)志物［15］。

本研究通過免疫組化方法檢測NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織及正常肺組織中的表達(dá)，分析其臨床意義。研究結(jié)果表明，與正常肺組織相比，NDRG4中在小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，表明NDRG4在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)被抑制，提示NDRG4基因在小細(xì)胞肺癌中也可能具有抑癌作用，作為小細(xì)胞肺癌的新型抑癌基因參與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。NDRG4表達(dá)陽性小細(xì)胞肺癌患者的生存期明顯延長，NDRG4表達(dá)陰性的小細(xì)胞肺癌患者生存期明顯縮短，提示NDRG4與患者的臨床預(yù)后有關(guān)。NDRG4表達(dá)缺失的患者對一線化療不敏感，容易出現(xiàn)繼發(fā)性多藥耐藥，NDRG4表達(dá)陽性的患者對一線化療較為敏感，提示NDRG4可能參與了小細(xì)胞肺癌化療多藥耐藥的調(diào)控，NDRG4的表達(dá)水平對評估小細(xì)胞肺癌化療藥物的療效具有指導(dǎo)意義。對小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行COX回歸生存分析，患者的性別、化療療效以及NDRG4的陽性表達(dá)均與患者的生存時(shí)間相關(guān)。

綜上所述，NDRG4在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)顯著低于正常肺組織，NDRG4陰性的小細(xì)胞肺癌患者更容易出現(xiàn)多藥耐藥，導(dǎo)致較差的臨床預(yù)后與較短的生存期，由此推測NDRG4的蛋白可以作為預(yù)測小細(xì)胞肺癌臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。

致謝：感謝中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院為本研究提供部分手術(shù)及穿刺活檢標(biāo)本。