氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定巴氏殺菌乳中9種香精成分

劉 通, 王玉嬌, 王秀娟, 崔東偉,3, 張 峰*

(1. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院, 天津 300000; 3. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 沈陽(yáng) 110122)

巴氏殺菌乳是僅以生牛(羊)乳為原料,經(jīng)巴氏殺菌等工序制得的液體產(chǎn)品[1]。近年來(lái)乳品工業(yè)迅猛發(fā)展,市場(chǎng)上銷(xiāo)售的巴氏殺菌乳品種、規(guī)格頗多。部分乳品企業(yè)為提高產(chǎn)品的“香”、“濃”,會(huì)使用香精等添加劑來(lái)增強(qiáng)口味。我國(guó)現(xiàn)行的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)巴氏殺菌乳做了明確規(guī)定,不得添加任何香精香料,但目前尚缺乏相應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致監(jiān)管缺項(xiàng)。

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素作為食品添加劑,廣泛用于巧克力、冰淇淋、糕點(diǎn)、糖果和乳制品等食物中,但人體超量攝入會(huì)對(duì)身體健康造成危害,如產(chǎn)生頭暈、惡心、呼吸困難,甚至導(dǎo)致肝、腎損傷[2]。香豆素是具有新鮮香草氣味的內(nèi)酯類(lèi)化合物,在蕓香科和傘形科植物中廣泛存在。毒理實(shí)驗(yàn)表明,香豆素能夠?qū)Ω文I產(chǎn)生中等毒性,從而危害健康,中國(guó)、美國(guó)、英國(guó)和印度等國(guó)家禁止香豆素作為食品添加劑添加到食品中。然而香豆素衍生物如7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、二氫香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素和環(huán)香豆素等可能被用作香豆素替代物添加到食品中,進(jìn)而逃避安全監(jiān)管[3-5]。考慮到香蘭素和香豆素類(lèi)物質(zhì)的副作用[6],建立其在食品中的同時(shí)檢測(cè)方法十分必要。

目前,針對(duì)食品中香蘭素和香豆素類(lèi)致香成分的測(cè)定方法主要有氣相色譜法(GC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8-10]、液相色譜法(LC)[11]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[12-14]和毛細(xì)管電泳法(CE)[15]等。相比液相色譜法,氣相色譜法對(duì)應(yīng)的前處理簡(jiǎn)單,更易操作,但在復(fù)雜基質(zhì)多組分分析時(shí),氣相色譜法存在靈敏度低和檢出限高的缺點(diǎn)。GC-MS采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式對(duì)化合物進(jìn)行確認(rèn),但受樣品基質(zhì)干擾影響,易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。氣相色譜-三重四極桿技術(shù)(GC-MS/MS)是在GC-MS的基礎(chǔ)上增加了二級(jí)質(zhì)譜信息,因此選擇性和抗干擾能力更強(qiáng),定量更準(zhǔn)確。

鄭小嚴(yán)[16]建立了凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定配方奶粉中香蘭素和乙基香蘭素的檢測(cè)方法;李長(zhǎng)于等[17]建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定香精香料中香豆素和黃樟素的檢測(cè)方法,但目前尚未有香蘭素和香豆素以及它們衍生物同時(shí)檢測(cè)的方法報(bào)道。本文采用GC-MS/MS技術(shù)建立了巴氏殺菌乳中香蘭素和香豆素以及它們衍生物的同時(shí)檢測(cè)方法。該方法前處理操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,定性定量準(zhǔn)確,可為巴氏殺菌乳中香蘭素和香豆素類(lèi)香精的精準(zhǔn)測(cè)定提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器、試劑與材料

7890A/7000C氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(配備自動(dòng)進(jìn)樣器和電子轟擊電離源,美國(guó)Agilent公司),數(shù)據(jù)采集由MassHunter完成;VORTEX KB-3渦旋振蕩器(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司); 3-30K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

9種香精標(biāo)準(zhǔn)品:二氫香豆素、香蘭素、香豆素、乙基香豆素、甲基香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4甲基香豆素和環(huán)香豆素(純度>96%,日本TCI公司)。乙醇、甲醇、乙腈和丙酮(美國(guó)Fisher Scientific公司);乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)(德國(guó)Sigma公司);十八烷基鍵合硅膠(C18)(美國(guó)Agilent公司);硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉(成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取9種香精標(biāo)準(zhǔn)品(10.0±0.1) mg,分別置于10 mL容量瓶中,加入少許無(wú)水乙醇混勻,待標(biāo)準(zhǔn)品溶解,再加入乙醇定容至10 mL,可得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

分別精密移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL,置于10 mL容量瓶中,用乙醇稀釋并定容至10 mL,可得10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取液體巴氏殺菌乳1 g,置于50 mL離心瓶中,加入15 mL無(wú)水乙醇,渦旋1 min,低溫離心(4 ℃, 8 000 r/min)5 min,取1 mL上清液,用0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾后,上機(jī)檢測(cè)。

1.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取不含目標(biāo)物的空白巴氏殺菌乳樣品1 g(精確至0.01 g),按1.3節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理得到基質(zhì)提取液。用基質(zhì)提取液作為稀釋溶劑制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 GC-MS條件

色譜柱:DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國(guó)Agilent公司);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;載氣:氦氣(≥99.999%);流量:1.0 mL/min。程序升溫:初始溫度80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的速率升溫至170 ℃,保持1 min,以60 ℃/min的速率升溫至270 ℃,保持10 min。進(jìn)樣量:1.0 μL。

色譜-質(zhì)譜接口溫度:280 ℃;電子轟擊電離(EI)源;電子能量:70 eV;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;溶劑延遲:4 min。9種香精化合物的名稱(chēng)、保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 9種香精成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention time and MS parameters of the nine flavor compounds

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的考察

升溫程序是實(shí)現(xiàn)化合物分離非常重要的氣相色譜參數(shù),本實(shí)驗(yàn)考察了在升溫的第一階段不同升溫速率(5、10和20 ℃/min)對(duì)化合物分離效果的影響。當(dāng)?shù)谝浑A段升溫速度為20 ℃/min時(shí),二氫香豆素和香蘭素保留時(shí)間相近,兩個(gè)化合物難以分開(kāi);采用10 ℃/min和5 ℃/min兩種升溫速率可實(shí)現(xiàn)2種化合物的良好分離,考慮到節(jié)約時(shí)間,升溫速率最終選擇10 ℃/min。

2.2 質(zhì)譜條件的考察

三重四極桿質(zhì)譜條件的優(yōu)化參數(shù)一般包括母離子、子離子以及碰撞能量等。在MRM參數(shù)優(yōu)化過(guò)程中,先通過(guò)全掃描模式選取質(zhì)荷比較大且相對(duì)豐度較高的特征碎片作為母離子,然后將母離子進(jìn)一步裂解,選取2～3個(gè)離子作為子離子,最后對(duì)每一對(duì)母離子/子離子以響應(yīng)信號(hào)大小為依據(jù)優(yōu)化碰撞能量。圖1顯示了9種香精成分的結(jié)構(gòu)圖,在MRM模式下9種香精成分的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖 1 9種香精成分的結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structure diagrams of the nine flavor compounds

圖 2 9種香精成分的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of the nine flavor compounds 1. hydrocoumarin; 2. vanillin; 3. coumarin; 4. ethyl vanillin; 5. methyl vanillin; 6. 7-methylcoumarin; 7. 7-methoxycoumarin; 8. 7-ethoxy-4-methylcoumarin; 9. pyranocoumarin.

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1樣品前處理的選擇

在復(fù)雜基質(zhì)香精成分分析實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)盡量減少前處理步驟,開(kāi)發(fā)出方便快速的前處理方法。本研究考察了直接提取-低溫離心法和QuEChERS法兩種前處理?xiàng)l件下巴氏殺菌乳的提取凈化效果。在QuEChERS前處理方法中考察了分別加入10 mg C18、10 mg PSA和5 mg PSA+5 mg C18時(shí)9種香精成分的回收率。結(jié)果如表2所示,當(dāng)加入QuEChERS凈化材料后,7-甲氧基香豆素回收率低于50%,香蘭素、香豆素、乙基香蘭素、甲基香蘭素、7-甲基香豆素的回收率均低于80%。而采用直接提取-低溫離心的前處理方式,9種目標(biāo)化合物的回收率均在90%～115%之間,滿足定性定量檢測(cè)的要求。因此最終選擇操作簡(jiǎn)單、成本低廉的直接提取-低溫離心的前處理凈化方式。

表 2 2種前處理方式下9種香精成分的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of the nine flavor components usingthe two pretreatment methods (n=3) %

C18: octadecyl bonded silica; PSA: ethylenediamine-N-propylsilane.

2.3.2提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇在前處理步驟中非常重要,合適的提取溶劑能有效提高提取效率。根據(jù)香豆素和香蘭素類(lèi)衍生物易溶于極性溶劑的性質(zhì),考察了甲醇、乙醇、乙腈和丙酮4種溶劑的提取效果。結(jié)果如圖3所示,當(dāng)使用丙酮時(shí),其中3種香精成分的回收率在70%以下;當(dāng)使用甲醇時(shí),二氫香豆素的回收率僅為40.1%;使用乙腈時(shí),二氫香豆素的回收率偏高(129.3%),而香蘭素、乙基香蘭素和7-甲氧基香豆素的回收率偏低(均小于80%);但當(dāng)使用乙醇時(shí),9種香精成分的回收率均在90%～120%之間,可滿足檢測(cè)要求。故最終選擇乙醇為最佳提取溶劑。

圖 3 提取溶劑對(duì)9種香精成分回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recoveries of the nine flavor components (n=3)

2.3.3提取溶劑體積的選擇

提取溶劑體積是影響化合物提取效率的一個(gè)重要因素,提取溶劑用量過(guò)少會(huì)造成提取不完全,而用量太多則浪費(fèi)試劑。本研究以乙醇為提取溶劑,以回收率為指標(biāo),考察了不同提取體積(3、5、8、10、15和20 mL)對(duì)各目標(biāo)物提取效率的影響。如圖4所示,隨著提取體積的增大,回收率逐漸增加,當(dāng)提取體積大于10 mL時(shí),回收率基本趨于穩(wěn)定,為了確保最佳的提取效率,最終選擇提取溶劑體積為15 mL。

圖 4 提取溶劑體積對(duì)9種香精成分回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of extraction solvent volumes on the recoveries of the nine flavor components (n=3)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)(ME)的考察

基質(zhì)效應(yīng)是食品中微/痕量物質(zhì)分析中影響定量結(jié)果的重要因素,因此需要判斷樣品是否有基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率大小來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)值根據(jù)公式(1)來(lái)計(jì)算:

ME=(1-Ss/Sm)×100%

(1)

其中,Ss是基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,Sm是純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)-50%50%時(shí),說(shuō)明該化合物的基質(zhì)效應(yīng)明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,除了二氫香豆素、香豆素和甲基香蘭素,其余6種化合物均表現(xiàn)出一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此,為了減小基質(zhì)效應(yīng)對(duì)準(zhǔn)確定量的影響,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)化合物定量分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1檢出限、定量限和線性范圍

分別配制一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化好的氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜條件下測(cè)定方法的檢出限、定量限和線性范圍。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、各被測(cè)組分的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)作圖,繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，9種香精化合物在1～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.997。在空白樣品中分別添加系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行前處理和測(cè)定,以3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。如表3所示,各化合物的檢出限和定量限分別為0.002～0.5 μg/kg和0.01～2 μg/kg,表明該方法可以滿足基質(zhì)復(fù)雜物質(zhì)的痕量檢測(cè)要求。

表 3 9種香精成分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the nine flavor compounds

2.5.2回收率和精密度

取空白巴氏殺菌乳樣品1 g,分別添加3個(gè)水平(1倍、2倍和4倍LOQ)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每一水平做6次平行,并計(jì)算平均回收率和日內(nèi)、日間精密度。9種化合物平均回收率為90.3%～110.6%,日內(nèi)精密度為1.6%～7.9%,日間精密度為2.3%～9.3%(見(jiàn)表4)。

表 4 巴氏殺菌乳中9種香精成分的加標(biāo)回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)Table 4 Recoveries, intra-day precisions and inter-day precisions of the nine flavor compounds spiked in pasteurized milk (n=6)

2.5.3實(shí)際樣品檢測(cè)

針對(duì)市售的巴氏殺菌乳樣品(10個(gè)),用本文建立的方法進(jìn)行了檢測(cè)分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)表明,7-甲氧基香豆素在其中的4個(gè)樣品中檢出,含量范圍為0.01～2 μg/kg,其余8種化合物在實(shí)際樣品中均未檢出。

3 結(jié)論

本研究采用直接提取-低溫高速離心凈化結(jié)合GC-MS/MS,通過(guò)優(yōu)選提取溶劑、提取溶劑體積和儀器參數(shù),建立了快速定量測(cè)定巴氏殺菌乳中9種香精成分的分析方法。方法學(xué)評(píng)價(jià)和實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明,該方法操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,凈化效果較好,可用于巴氏殺菌乳中多種香精的檢測(cè)。