氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定農(nóng)藥制劑中29種助劑

唐祥凱, 馮德建, 史謝飛, 李懷平

(中國測試技術(shù)研究院, 國家防災(zāi)減災(zāi)分析測試中心(成都), 四川 成都 610021)

農(nóng)藥原藥無法直接使用,需根據(jù)農(nóng)藥的性質(zhì)及加工的劑型添加各種助劑,經(jīng)研制、復(fù)配、加工從而制成農(nóng)藥制劑。目前,常規(guī)使用的農(nóng)藥助劑品種已超過3 000種[1,2],包括表面活性劑、溶劑、增效劑、分散劑、黏著劑、防腐劑和穩(wěn)定劑等,其在農(nóng)藥制劑中所占比例很大,從百分之幾到百分之九十幾不等[3,4]。雖然農(nóng)藥助劑本身沒有農(nóng)藥活性,且在降低農(nóng)藥用量、改善農(nóng)藥有效成分的生物活性、提高農(nóng)藥對作物的安全性、減少環(huán)境污染、提高經(jīng)濟(jì)效益等方面都具有重要作用,但越來越多的研究表明,部分被認(rèn)為是“惰性”的助劑可能比受監(jiān)管的農(nóng)藥活性成分毒性及環(huán)境危害性更強(qiáng)[3,5,6]。美國環(huán)保署對2 000余種助劑的毒性研究發(fā)現(xiàn),其中26%的助劑本身具有致癌性、致畸性、致突變性、內(nèi)分泌干擾作用、繁殖損傷、神經(jīng)毒性等嚴(yán)重健康風(fēng)險[7,8],鑒于此,歐盟、美國、加拿大、印尼等國家或地區(qū)已相繼出臺了對農(nóng)藥助劑嚴(yán)格的管理規(guī)定或標(biāo)準(zhǔn)[5,9],我國大陸地區(qū)自實行農(nóng)藥登記管理以來,一直側(cè)重于農(nóng)藥有效成分的管理,對助劑的安全性研究和管理才剛剛起步,僅有化工行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)HG/T 4576-2013《農(nóng)藥乳油中有害溶劑限量》對農(nóng)藥乳油中7種有害溶劑設(shè)定了限量值,而我國臺灣地區(qū)現(xiàn)行《農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格準(zhǔn)則》則規(guī)定了成品農(nóng)藥中二甲苯、苯胺、苯、四氯化碳等44種助劑的限量基準(zhǔn),雖然2015年7月,原農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所發(fā)布了《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿),擬對84類助劑進(jìn)行禁限用,但至今未正式出臺,這些有害助劑在農(nóng)藥施用過程中全部進(jìn)入環(huán)境,并長時間殘留在大氣圈、水圈等循環(huán)系統(tǒng)中,不僅污染環(huán)境,而且危害人畜安全,其毒害作用不低于甚至遠(yuǎn)大于農(nóng)藥有效成分本身[10,11]。

目前,國外主要針對部分農(nóng)藥助劑本身理化性質(zhì)測定方面建立了標(biāo)準(zhǔn),尚無專門針對農(nóng)藥制劑中助劑含量檢測的標(biāo)準(zhǔn);我國僅有HG/T 4576-2013對農(nóng)藥乳油中苯、甲苯、二甲苯、乙苯、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、萘等7種設(shè)限有害溶劑制定了配套檢測技術(shù),涉及檢測方法均為氣相色譜法;關(guān)于農(nóng)藥制劑中助劑檢測方法的研究文獻(xiàn)報道也較少,主要有氣相色譜法[12,13]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[14-16]、液相色譜法[17,18]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4,19-21],涉及的助劑主要為苯、甲苯、二甲苯、二硫化碳、1,2-二氯乙烯、四氯化碳等50余種,參考《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿),目前尚有二氯甲烷、甲基丙烯酸甲酯、苯酚、對苯二酚、苯駢三氮唑等近30種常用助劑缺乏有效的檢測方法。

GC-MS兼具色譜的高分離效能和質(zhì)譜準(zhǔn)確鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點,非常適合農(nóng)藥制劑中助劑的準(zhǔn)確、高效、全面分析。為此,本研究選取具有代表性的乳油型和可溶液劑型農(nóng)藥制劑為研究對象,建立了GC-MS測定農(nóng)藥制劑中二氯甲烷、甲基丙烯酸甲酯、苯酚、對苯二酚、苯駢三氮唑等29種助劑的高通量檢測方法,以期為農(nóng)藥制劑的生產(chǎn)和質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B GC-5977B MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司),并配有Agilent G4567A自動進(jìn)樣器,Eppendorf 5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司), Sartorius BP 211D型電子天平(德國賽多利斯公司)。

正己烷、甲基異丁基甲酮、甲基丙烯酸丁酯、苯酚、N-甲基吡咯烷酮、對苯二酚(分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司);二氯甲烷、硝基甲烷、甲基丙烯酸甲酯、硝基乙烷、鄰甲酚、對甲酚、2-吡咯烷酮、二苯醚、鄰苯二甲酸二甲酯、苯駢三氮唑(分析純,成都市科龍化工試劑廠);丁酮肟、二乙二醇單甲醚、二乙二醇丁醚、己二酸二異辛酯(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 2-己酮、異丙叉丙酮、異佛爾酮、1-乙基-2-吡咯烷酮、間甲酚、4-氯-3,5-二甲基苯酚、鄰苯二甲酸丁芐酯(分析純,上海麥克林生化科技有限公司);二乙二醇乙醚(分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(分析純,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司);甲醇(色譜純,美國西格瑪奧德里奇公司)。

市售農(nóng)藥制劑樣品:12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))馬拉·殺螟松乳油,0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))丁子香酚可溶液劑,95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))礦物油乳油,3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))赤霉酸乳油,購自四川農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)品綜合市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

對照品單一標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制:準(zhǔn)確稱取適量農(nóng)藥助劑(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中,以色譜純甲醇為溶劑,配制質(zhì)量濃度為1 500.0 mg/L的農(nóng)藥助劑單一標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于4 ℃遮光保存。使用時根據(jù)需要使用空白基質(zhì)溶液稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

對照品混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制:準(zhǔn)確稱取適量農(nóng)藥助劑(精確至0.01 mg)于50 mL容量瓶中,以色譜純甲醇為溶劑,配制質(zhì)量濃度均約為5 000.0 mg/L的29種農(nóng)藥助劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液溶,于4 ℃下避光保存。

對照品混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:精確吸取適量對照品混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))礦物油乳油和3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))赤霉酸乳油樣品的空白基質(zhì)溶液逐級配制成不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

表 1 29種農(nóng)藥助劑的CAS號、色譜及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Chemical abstract service (CAS) numbers and GC-MS parameters for the 29 pesticide adjuvants

1.3 樣品前處理

稱取1 g農(nóng)藥制劑樣品(精確至0.001 g)于100 mL容量瓶中,加入50 mL甲醇渦旋振蕩提取2 min,用甲醇定容至刻度,混勻,吸取5 mL提取液于8 000 r/min下離心5 min,取上清液過0.22 μm尼龍濾膜,待GC-MS分析。提取時根據(jù)樣品中農(nóng)藥助劑的含量適當(dāng)調(diào)整提取溶劑用量。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件

Agilent VF-1701MS毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),升溫程序:30 ℃保持2 min,以3 ℃/min升溫至40 ℃,保持2 min,然后以5 ℃/min升溫至130 ℃,保持3 min,再以20 ℃/min升溫至200 ℃,最后以60 ℃/min升溫至270 ℃,保持20 min;進(jìn)樣口溫度:260 ℃;進(jìn)樣模式:分流進(jìn)樣(分流比50∶1);進(jìn)樣量:1 μL;載氣:氦氣(純度≥99.999%),恒流模式;流速:1.0 mL/min。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:EI電離源;電離能量70 eV;離子源溫度:230 ℃;四極桿溫度:150 ℃,傳輸線溫度:270 ℃,溶劑延遲:5.5 min;掃描模式:選擇離子監(jiān)測(SIM)模式,29種農(nóng)藥助劑的保留時間和特征離子見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

圖 1 9種農(nóng)藥助劑在不同提取溶劑中的響應(yīng)值比較Fig. 1 Comparison of response values for nine pesticide adjuvants in different extraction solvents The number codes are the same as those in Table 1.

圖 2 29種農(nóng)藥助劑的選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig. 2 Selected ion chromatogram of the 29 pesticide adjuvants The number codes are the same as those in Table 1.

由于農(nóng)藥制劑中含有較高的有效成分和其他物質(zhì),會對農(nóng)藥助劑成分的分離和檢測造成一定干擾,因此在檢測農(nóng)藥助劑時,樣品需溶解和稀釋后才能上機(jī)分析。助劑分析中常用的提取溶劑有丙酮[12,16]、乙腈[15,17]、甲醇[18]和乙酸乙酯[14,22]等,分別用4種溶劑配制質(zhì)量濃度為400.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在同一條件下對上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,考察溶劑效應(yīng)。由圖1可知,采用甲醇或乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時,9種助劑的響應(yīng)值高于丙酮或乙酸乙酯,在綜合考慮提取溶劑的溶解性、揮發(fā)性、毒性以及與目標(biāo)物的分離度后,最終選擇甲醇作為本方法的提取和稀釋溶劑。同時,本文還采用樣品加標(biāo)回收試驗對渦旋振蕩提取法和超聲提取法2種前處理方式進(jìn)行了驗證比較,結(jié)果顯示,29種農(nóng)藥助劑的回收率無明顯差異,均在80.0%～120.0%之間。渦旋振蕩提取法具有操作簡便、效率高等優(yōu)點,故采用渦旋振蕩法作為樣品前處理方法。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

本文涉及的29種農(nóng)藥助劑覆蓋極性、中等極性、非極性多種類別,同分異構(gòu)體也加大了分離的難度。農(nóng)藥助劑分析中常用的色譜柱有弱極性的HP-5MS柱[12,13]、中等極性的VF-1701MS柱[16]、DB-624柱[23]以及強(qiáng)極性的DB-WAX柱[22],在比較了3種類型的色譜柱對29種農(nóng)藥助劑的分離效果后,最終確定采用VF-1701MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱作為本方法的分析柱,VF-1701MS柱屬于中等極性色譜柱,對分離非極性和強(qiáng)極性的化合物都有兼顧。通過優(yōu)化升溫程序,選擇穩(wěn)定性好、干擾較少的碎片離子作為特征碎片離子,并通過樣品加標(biāo)回收試驗進(jìn)行驗證,結(jié)果表明1.4節(jié)的色譜與質(zhì)譜條件能夠?qū)崿F(xiàn)29種農(nóng)藥助劑在VF-1701MS色譜柱上的良好分離,優(yōu)化后的選擇離子監(jiān)測圖見圖2。其中對苯二酚、鄰苯二甲酸二甲酯與4-氯-3,5-二甲基苯酚色譜峰雖然未完全分離,但依據(jù)它們之間不同的特征離子可分別進(jìn)行定性和定量分析。

2.3 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)與定量限

以空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為6.2～400.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.4節(jié)條件下進(jìn)行分析,以各農(nóng)藥助劑的定量離子峰面積y與對應(yīng)的質(zhì)量濃度x(mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。由表2可知,29種農(nóng)藥助劑在6.2～400.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。以信噪比約為10時空白樣品添加濃度計算方法的定量限為4.4～439.1 mg/kg,遠(yuǎn)低于《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿)的限量要求(最低限度:1 000 mg/kg),可很好地滿足農(nóng)藥制劑中助劑含量檢測和質(zhì)量監(jiān)管要求。

表 2 29種農(nóng)藥助劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), and limits of quantification (LOQs) of the 29 pesticide adjuvants

y: peak area;x: mass concentration, mg/L.

2.4 方法的回收率與精密度

分別稱取1 g(精確至0.001 g)12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))馬拉·殺螟松乳油和0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))丁子香酚可溶液劑樣品各18份,添加質(zhì)量濃度為1 000.0 mg/L的29種農(nóng)藥助劑混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0.5 mL(即添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%)、1.0 mL(即添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%)、2.0 mL(即添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%),每個水平重復(fù)進(jìn)行6次試驗,由圖3可知,29種農(nóng)藥助劑在12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))馬拉·殺螟松乳油樣品中加標(biāo)回收率為82.0%～111.9%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.4%～7.2%(n=6),僅有二乙二醇單甲醚在0.5%加標(biāo)下的回收率低于85.0%, 2-己酮在1.0%加標(biāo)下的回收率高于110.0%,間甲酚在0.5%加標(biāo)下的回收率高于110.0%;在0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))丁子香酚可溶液劑樣品中加標(biāo)回收率為82.6%～112.9%,RSD為0.3%～8.2%(n=6),僅有二乙二醇單甲醚在0.5%加標(biāo)下的回收率低于85.0%, 2-己酮在0.5%和1.0%加標(biāo)下回收率高于110.0%,間甲酚在0.5%加標(biāo)下回收率高于110.0%,考慮到農(nóng)藥制劑樣品的復(fù)雜性以及其農(nóng)藥配比的不確定性,本文建立的方法能基本滿足農(nóng)藥制劑中助劑常量分析水平的回收率要求。

2.5 實際樣品檢測

采用本文建立的方法對市場上銷售的110份農(nóng)藥制劑樣品中29種助劑含量進(jìn)行分析檢測,由表3可知,28份農(nóng)藥制劑檢出苯酚、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、正己烷等共11種助劑,檢出助劑樣品數(shù)占總樣品數(shù)的25.5%,含量范圍為0.05%～15.65%。與《農(nóng)藥助劑禁限用名單》(征求意見稿)比較發(fā)現(xiàn),有17份樣品不符合相關(guān)禁限用規(guī)定,一定程度上說明農(nóng)藥制劑中助劑使用現(xiàn)狀不容樂觀,存在一定風(fēng)險,應(yīng)引起相關(guān)管理部門重視。

圖 3 29種農(nóng)藥助劑在乳油型與可溶液劑型樣品中不同水平下的加標(biāo)回收率和RSDFig. 3 Recoveries and RSDs for the 29 pesticide adjuvants in EC and SL samples EC: emulsifiable concentrate; SL: soluble concentrate. The number codes are the same as those in Table 1.

表 3 至少檢出1種助劑的農(nóng)藥制劑樣品的檢測結(jié)果Table 3 Results for pesticide formulations revealed at least one of the 29 adjuvants

-: not detected.

3 結(jié)論

本文建立了乳油和可溶液劑型農(nóng)藥制劑中29種助劑的氣相色譜-質(zhì)譜測定方法,該法具有操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點。需要說明的是,農(nóng)藥制劑中助劑的檢測無法用一種方法一次檢測完成,必須依靠GC-MS、LC-MS/MS等多種方法聯(lián)合使用,才能實現(xiàn)農(nóng)藥助劑檢測全覆蓋,因此,下一步將繼續(xù)利用GC-MS、LC-MS/MS等方法,一方面建立未覆蓋的農(nóng)藥助劑的檢測方法,另一方面建立水乳劑、懸浮劑等其他劑型農(nóng)藥制劑中擬禁限用助劑的檢測方法,從而最終建立一套基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的農(nóng)藥制劑中擬禁限用助劑高通量檢測方法體系,為我國農(nóng)藥助劑相關(guān)管理法規(guī)或標(biāo)準(zhǔn)的最終出臺及其落實提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。