封杏嵐,黃程青,徐瀹澄,沈繼云,解文濤,楊豫斐,何述棟
(合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院,安徽合肥 230009)
醇溶蛋白(Prolamin)是作物籽粒蛋白中溶于醇類的部分,占谷類成熟種子總氮的40%~60%[1]。醇溶蛋白具有良好的疏水、成膜、抗氧化[2]等功能,因而被廣泛應(yīng)用于食品、材料、紡織、醫(yī)藥等領(lǐng)域[3]。挖掘植物種子中醇溶蛋白的生產(chǎn)潛力,對于提高蛋白資源利用率、增加農(nóng)作物附加值具有重要意義。蕓豆(Kidney bean),又名扁豆、腰豆、飯豆,屬豆科,蝶形花亞科,菜豆族菜豆屬作物[4],具有極高的營養(yǎng)價值,其主要成分為碳水化合物(37.6%~48.5%)和蛋白質(zhì)(19.9%~20.0%)[5]。目前,鮮有針對蕓豆醇溶蛋白的研究報道。試驗以白蕓豆為對象,通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化,為豆類中醇溶蛋白的提取提供借鑒,同時可為蕓豆中蛋白質(zhì)資源的精細化利用提供理論基礎(chǔ)和試驗支撐。
云南大白蕓豆,市售;纖維素酶(綠色木霉50 U/mg)、(果膠酶500 U/mg),上海源葉生物科技有限公司提供;其他化學試劑均為分析純。
SC-3614型低速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司產(chǎn)品;LGJ-12型冷凍干燥機,北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;HX-300型高速中藥粉碎機,浙江省永康市溪岸五金藥具廠產(chǎn)品;CPll4型電子天平,奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品;85-2型恒溫磁力攪拌器,江蘇省金壇市城東新瑞儀器廠產(chǎn)品;101-3A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海坤天試驗室儀器有限公司產(chǎn)品。
選取飽滿、潔白、無蟲眼的白蕓豆,粉碎并過80目篩,篩下粉用正己烷脫脂。配制成濃度為50 mmol/L濃度0.5 mol/L NaCl和1.0 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液(pH值6.5),去除蕓豆粉中清蛋白和球蛋白[6],具體方法為:準確稱取一定質(zhì)量的脫脂蕓豆粉,以料液比1∶10溶于緩沖液中,于室溫下磁力攪拌2 h后,在4℃下離心(8 000 r/min,10 min),棄去上清液,沉淀用超純水清洗3次后冷凍干燥備用。
參考韓晶[7]的方法提取白蕓豆中的醇溶蛋白。稱取預(yù)處理后的蕓豆粉20 g,加入乙醇溶液并在室溫下攪拌2 h,使蕓豆粉充分分散,水浴浸提后離心(8 000 r/min,15 min),收集上清液,沉淀重復(fù)浸提、離心2次,合并上清液,待45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,冷凍干燥得到醇溶蛋白粉。
利用凱氏定氮法(參考國標GB 5009.5—2010)對蛋白質(zhì)含量進行測定,計算醇溶蛋白的得率。
選擇乙醇體積分數(shù)(50%,60%,70%,80%,90%,V/V),提取料液比 (1∶6,1∶8,1∶10,1∶12,1∶14,W/V),浸提溫度 (10,20,30,40,50℃) 和浸提時間 (1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h) 進行單因素試驗,考查其對醇溶蛋白得率的影響,根據(jù)試驗需要固定提取料液比1∶10,浸提溫度30℃,浸提時間2.0 h,每個單因素試驗至少重復(fù)3次。
選擇乙醇體積分數(shù)(X1)、料液比(X2)、浸提溫度(X3)、浸提時間(X4)為優(yōu)化因素,以醇溶蛋白得率(%)為響應(yīng)值,采用四因素三水平中心組合設(shè)計 (Central Composite Design,CCD) 進行白蕓豆醇溶蛋白提取試驗。
響應(yīng)面因素與水平設(shè)計見表1。
表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計
選擇纖維素酶和果膠酶對脫脂后蕓豆粉進行酶解,探究酶解工藝對醇溶蛋白得率的影響。各組加酶量及條件為:①復(fù)合酶處理:0.5%纖維素酶+0.1%果膠酶,pH值5.0,180 min;②纖維素酶處理:0.5%纖維素酶,pH值5.0,180 min;③未加酶處理:料液比1∶10,酶解溫度55℃,酶解時間3.0 h。酶解后將混合液離心,沉淀于40℃下烘干備用。
采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,利用Design Expert 8.0.6進行響應(yīng)面試驗設(shè)計、結(jié)果分析及預(yù)測。
乙醇體積分數(shù)對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖1。
圖1 乙醇體積分數(shù)對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響
由圖1可知,醇溶蛋白得率隨乙醇體積分數(shù)的升高而增大,并于70%時獲得最大的提取量(1.75%±0.03%),當體積分數(shù)大于70%時,對于醇溶蛋白的提取效果反而有所下降。由方差分析結(jié)果可知,不同體積分數(shù)乙醇對于蕓豆醇溶蛋白得率的影響差異顯著,過高(90%)或過低(50%)體積分數(shù)都不宜于醇溶蛋白的溶出。醇溶蛋白的提取需要在一定體積分數(shù)的醇溶液中實現(xiàn),有文獻報道,玉米醇溶蛋白可溶解于50%~95%的乙醇溶液中[8]。陳曉萌等人[9]采用70%乙醇溶液對2種紅蕓豆中醇溶蛋白進行提取,其得率分別占總蛋白的6.79%和6.12%,間接印證上述試驗結(jié)果。以上試驗確定提取用最佳乙醇體積分數(shù)為70%。
料液比對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖2。
由圖2可知,當料液比為1∶8和1∶10時均獲得較大的醇溶蛋白得率,且1∶10時達到最高為1.76%±0.01%,但二者之間差異不顯著;除此二者以外,無論料液比升高或是降低,均導(dǎo)致醇溶蛋白得率下降。一般而言,提取所用料液比越大,蕓豆粉在溶液中的分散越充分,更有利于蛋白質(zhì)的溶出。但過多的溶劑用量會造成分離和濃縮過程中混合液處理量增大,引起醇溶蛋白損失和提取成本增加;而較低料液比無法滿足蕓豆粉中蛋白質(zhì)的充分溶出。綜上原因并結(jié)合經(jīng)濟等因素,選擇提取液料比為1∶10。
圖2 提取液料比對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響
浸提溫度對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖3。
圖3 浸提溫度對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響
當浸提溫度低于30℃時,醇溶蛋白得率隨浸提溫度增加而上升,并于30℃時獲得最大值(1.76%±0.01%);隨后在40℃時醇溶蛋白得率為1.72%±0.02%,與30℃時相比差異不顯著;當浸提溫度達到50℃時,醇溶蛋白得率迅速降低,此時僅為1.56%±0.42%。升高溫度可引起溶劑中分子活動加劇,從而提高醇溶蛋白得率。但另一方面,乙醇作為沸點較低的易揮發(fā)性溶劑,隨著浸提溫度的升高不斷逸出,表現(xiàn)為溶液體系中實際乙醇體積分數(shù)的下降,造成醇溶蛋白得率的降低。由圖3可知,最優(yōu)浸提溫度為30℃。
浸提時間對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖4。
由圖4可知,隨著浸提時間的延長,各組醇溶蛋白得率不斷增加,在3.0 h時獲得最大值為1.80%±0.02%。從圖4中各點形成趨勢可明顯看出,增加浸提時間可以增加醇溶蛋白提取率,故3.0 h為最佳浸提時間,但對于實際生產(chǎn)而言,提取水平的選擇還需綜合成本、時間等因素來考慮。
響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。
通過Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行擬合,建立醇溶蛋白得率Y對乙醇體積分數(shù)X1、浸提液料比X2、浸提溫度X3和浸提時間X4的多元回歸方程如下:
圖4 浸提時間對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響
表2 響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果
由表3可知,回歸方程p<0.000 1,方程高度顯著;失擬項p=0.637 9>0.05,失擬結(jié)果不顯著;同時模型相關(guān)系數(shù)R2=0.992 5,校正系數(shù)R2Adj=0.985 4,說明模型擬合效果良好,因此可通過以上回歸方程確定醇溶蛋白提取最優(yōu)工藝參數(shù)。影響醇溶蛋白得率因素的主次順序為X2=X4>X3>X1,且選取的各因素均對醇溶蛋白得率影響顯著或極顯著。
方差分析見表3。
表3 方差分析
響應(yīng)面分析診斷圖見圖5。
由圖5可知,(a)中展示的殘差正態(tài)分布概率近似分布在一條直線上,(b)中各點分布零散且無規(guī)律,而(c)中的點幾乎在一條直線上,以上皆表明由響應(yīng)面分析擬合的模型適應(yīng)性良好。由表3可知,除乙醇體積分數(shù)和浸提溫度外,其余因素間兩兩交互作用差異顯著。
不同因素交互作用對醇溶蛋白得率影響響應(yīng)面及等高線圖見圖6。
由圖6可知,固定浸提溫度和時間,醇溶蛋白得率隨乙醇體積分數(shù)的增加呈上升后下降趨勢,隨料液比在一定范圍內(nèi)緩慢上升、(b)中乙醇體積分數(shù)和浸提溫度在試驗設(shè)計水平內(nèi)交互作用不顯著,固定浸提溫度后,醇溶蛋白得率隨乙醇體積分數(shù)先升高后下降,另一方面,得率隨浸提溫度升高也表現(xiàn)出相似趨勢,但弱于乙醇體積分數(shù)造成的影響。從圖6(c) 可看出,當乙醇體積分數(shù)位于“0”水平附近,同時浸提時間位于“1”水平附近時,可獲得較高的醇溶蛋白提取量。(d)圖表明,在固定浸提溫度的情況下,提高液料比可以明顯增加醇溶蛋白的提取率。(e)(f)兩圖均表明,固定其他3個因素的水平,延長浸提溫度可有效提高醇溶蛋白得率。經(jīng)該模型預(yù)測優(yōu)化出的提取工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)70%,料液比1∶9.2,浸提溫度32℃,浸提時間2.9 h,預(yù)測得率為1.83%。采用以上參數(shù)進行驗證試驗,獲得醇溶蛋白得率為1.78%,占蕓豆中總蛋白質(zhì)量的7.81%,與預(yù)測值相對誤差為2.73%,表明預(yù)測模型較為可靠。
圖5 響應(yīng)面分析診斷圖
酶解處理對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響見圖7。
由圖7可知,醇溶蛋白得率由大到小排列為:未加酶組(1.76%±0.03%)>僅加纖維素酶組(0.90%±0.05%)>纖維素酶+果膠酶(復(fù)合酶)組(0.70%±0.04%),且各組間存在顯著差異。理論上認為,在蕓豆粉脫脂之后進行纖維素酶、果膠酶處理,對蕓豆粉中纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等[10]進行酶解,破壞蕓豆的細胞結(jié)構(gòu),利于蛋白質(zhì)在后續(xù)醇提過程中的溶出。然而實際上,多步處理會造成蛋白質(zhì)的損失;多糖類物質(zhì)酶解后可能會競爭性降低蛋白質(zhì)的溶解度;且豆粉容易出現(xiàn)結(jié)塊,不利于乙醇溶液的浸提。綜上原因,酶解處理不利于白蕓豆中醇溶蛋白的提取。
采用單因素試驗分別考查乙醇體積分數(shù)、液料比、浸提溫度和浸提時間對于醇溶蛋白得率的影響,最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)70%,料液比1∶10,浸提溫度30℃,浸提時間3.0 h;通過響應(yīng)面分析優(yōu)化出最佳提取工藝,得到回歸方程為:
圖6 不同因素交互作用對醇溶蛋白得率影響響應(yīng)面及等高線圖
圖7 酶解處理對白蕓豆醇溶蛋白得率的影響
當乙醇體積分數(shù)70%,料液比1∶9.2,浸提溫度32℃和浸提時間2.9 h時,醇溶蛋白得率可達到1.78%。和未加酶組相比較,酶解處理未明顯提高醇溶蛋白的提取率。