PINK1沉默對肺癌細胞增殖和凋亡的影響

申秋菊，趙靜，王二雄，白曉瑞

(榆林市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 榆林 719000)

肺癌是高死亡率的癌癥之一，約占所有癌癥死亡人數(shù)的1/5[1]。目前，手術切除、放射治療及化學治療仍是其最常見的治療方法，但療效并不理想，患者5年生存率僅為15%[1-2]。因此，迫切需要尋求一種新的更為有效的肺癌治療方法。PTEN誘導激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用，可通過介導功能障礙的線粒體募集，進而促進受損線粒體通過自噬作用消除[3]，并和Parkin蛋白一起，在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。對乳腺癌和宮頸癌細胞的研究[4]顯示，PINK1敲低可顯著抑制癌癥相關表型，并阻斷癌細胞的細胞周期進程。同時，PINK1下調(diào)可增加非小細胞肺癌對順鉑的敏感性[5]。此外，近期Yamashita等[6]的研究證明，高表達的PINK1可能會導致食管鱗狀細胞癌患者的化療耐藥性和不良預后。雖然這些研究已經(jīng)闡明了PINK1在多種癌細胞中的作用，但PINK1在肺癌中的詳細機制還尚未完全清楚。本研究采用特異性PINK1-短發(fā)夾RNA(shRNA)沉默肺癌細胞中PINK1的表達，探討PINK1沉默在肺癌細胞增殖、凋亡和線粒體功能障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

人肺癌細胞系H2106購自美國ATCC細胞庫，shRNA-對照質(zhì)粒和shRNA-PINK1質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司提供及合成，pENTRTM/H1/TO載體和脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司，遺傳霉素購自美國 Sigma-Aldrich公司，MTT試劑盒、細胞周期及細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天公司，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)試劑盒、線粒體提取試劑盒、活性氧(ROS)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，BCA試劑盒、RIPA試劑、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體、二抗購自上海碧云天公司，PINK1抗體和活性caspase3抗體購自美國Abcam公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀由美國BD公司生產(chǎn)，imark酶標儀由美國伯樂公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組及轉染 (1)細胞培養(yǎng)：將人肺癌細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶底后，采用0.25%的胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗；(2)細胞分組：將細胞分為空白組(未轉染質(zhì)粒)、陰性組(轉染shRNA-對照質(zhì)粒)和轉染組(轉染shRNA-PINK1質(zhì)粒)。(3)細胞轉染：將shRNA-PINK1基因或shRNA-對照基因分別克隆進pENTRTM/H1/TO載體中構建pENTRTM/H1/TO-shRNA-PINK1(簡稱shRNA-PINK1質(zhì)粒)和pENTRTM/H1/TO-shRNA-對照(簡稱shRNA-對照質(zhì)粒)重組質(zhì)粒，然后采用脂質(zhì)體2000將shRNA-PINK1質(zhì)粒(轉染組)或者shRNA-對照質(zhì)粒(陰性組)轉染至H2106細胞中。轉染48 h后，將150 g/mL的遺傳霉素加入轉染組和陰性組的細胞培養(yǎng)基中。2周后，篩選穩(wěn)定表達PINK1干擾載體的H2106細胞；空白組不做處理。人shRNA-PINK1基因的序列為：5′-CACC GCTGGAGGAGTATCTGATA TTCAAGAGA TATCAGATACTCCTCCAGC-3′，shRNA-對照基因的序列為：5′-CACC GCTAGGATATGGTCGGATA TTCAAGAGA TATCCGACCATATCCTAGC-3′。

1.2.2 細胞增殖抑制率檢測 將各組細胞以5103/孔的密度接種于96孔板，每組8孔。設空白孔，只加RPMI-1640培養(yǎng)基。分別于轉染后0、6、12、24、48和72 h，加入5 mg/mL的MTT溶液20 L，反應4 h，用快速翻板法去除培養(yǎng)基，加200 L的DMSO，振蕩10 min，30 min后用酶標儀在490 nm處檢測吸光值(OD)。細胞增殖抑制率(%)=[(空白孔OD值-待測孔OD值)/空白孔OD值]100%。

1.2.3 細胞周期及細胞凋亡檢測 收集轉染48 h后的細胞，加入1 mL 細胞固定液，吹打混勻，在4 ℃固定24 h。用PBS洗去固定液，1 000 rpm離心5 min，用0.5 mL的PBS重懸細胞。加入0.5 mL PI，室溫避光孵育30 min，用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測每組處于各細胞周期的細胞所占的百分比。收集轉染48 h后的細胞，加入5 L AnnexinV-FITC，混勻，室溫避光孵育10 min，離心收集沉淀，重懸后加入10 L PI，室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Western Blot檢測PINK1、活性caspase3、Bax和Bcl-2等蛋白表達水平 用RIPA試劑從轉染48 h后的各組細胞中分離總蛋白，采用BCA試劑盒進行總蛋白定量。采用10% SDS-PAGE分離總蛋白，轉膜后用5%的BSA封閉45 min，分別加入PINK1、活性caspase3、Bax和Bcl-2一抗，37℃孵育4 h；加入各自二抗(1∶5000)，室溫搖床孵育1 h后，ECL暗室發(fā)光。采用凝膠成像系統(tǒng)和Quantity One 4.6.2軟件(美國Bio-Rad公司)對條帶進行統(tǒng)計分析。內(nèi)參為GAPDH。蛋白相對表達量=檢測蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率的對比

在轉染12、24、48和72 h時，轉染組細胞增殖抑制率均高于空白組和陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組與陰性組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 各組細胞周期和凋亡率對比

與空白組和陰性組對比，轉染組S期細胞數(shù)量降低、G2/M期細胞數(shù)量增加、細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組與陰性組比較，各期細胞和細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1 各組細胞周期和凋亡率對比

*P<0.05，與空白組和陰性組相比。

2.3 各組PINK1等蛋白表達水平對比

與空白組和陰性組對比，轉染組活性caspase3和Bax表達水平增加、PINK1和Bcl-2表達降低(P<0.05)，空白組與陰性組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2和表2。

表2 各組PINK1等蛋白表達水平對比

分組PINK1active caspase3BaxBcl-2空白組(n=8)0.87±0.1040.42±0.1150.26±0.0830.51±0.096陰性組(n=8)0.92±0.0840.38±0.0890.29±0.0900.56±0.124轉染組(n=8)0.33±0.050*1.16±0.132*1.47±0.146*0.20±0.079*

*P<0.05，與空白組和陰性組相比。

3 討論

PINK1在肺癌細胞中高表達，可促進癌細胞惡性增殖以及化療耐藥性[6]。本研究采用RNA干擾技術，將shRNA-PINK1質(zhì)粒轉染入人肺癌細胞H2106中沉默PINK1，借以探討PINK1沉默對肺癌細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等的影響。

本研究結果顯示，PINK1沉默可顯著增加肺癌細胞的增殖抑制率。其原因可能是PINK1可通過調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞周期和線粒體功能，進而促進腫瘤的發(fā)展[3]，也可以說，PINK1為促腫瘤因子，而其沉默將可能導致腫瘤生長抑制。結果還顯示，PINK1沉默后，G2/M期的細胞構成比顯著增加，而S期細胞構成比降低。G2為有絲分裂的準備期，M期為有絲分裂期，G2/M期細胞構成比增加表示細胞有絲分裂進入延遲，細胞可能在修復S期累積的DNA損傷。有研究[7]證實，在wee1蛋白缺乏的情況下，將導致細胞沒有完成DNA修復就直接進入有絲分裂期，但在進入有絲分裂期后，G2/M期的DNA檢查點將會發(fā)出不利于分裂的信號(由于DNA修復未完成)。因此，導致細胞在G2/M期滯留，有絲分裂未啟動。這可能是PINK1沉默導致肺癌細胞增殖抑制的原因之一。

細胞凋亡逃逸是癌細胞的一個顯著特征，且越來越多的研究[8]表明，PINK1在多種細胞模型中具有抗凋亡作用。因此，本研究試圖探討PINK1沉默在肺癌細胞凋亡中的作用，結果顯示，PINK1沉默能顯著增加肺癌細胞的凋亡率，其機制可能與PINK1沉默降低肺癌細胞中Bcl-2蛋白表達、提高Bax蛋白表達及caspase-3活化有關。Bax和Bcl-2蛋白均是內(nèi)在線粒體依賴性細胞凋亡的關鍵參與者，Bax為促凋亡蛋白，會加速細胞凋亡過程，反之Bcl-2為抗凋亡蛋白，會阻止細胞凋亡過程[9]。Caspase-3是caspase家族之一，是促凋亡蛋白，可由線粒體依賴的內(nèi)在凋亡途徑和死亡受體觸發(fā)的外源性凋亡途徑激活[10]。據(jù)此推測，由caspase-3及Bax/Bcl-2啟動的線粒體依賴凋亡途徑可能也是PINK1沉默促進肺癌細胞凋亡的原因之一。

綜上，PINK1沉默可抑制肺癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，PINK1可能是肺癌治療的另一個新靶點。