基于高通量測(cè)序?qū)χ袊?guó)不同區(qū)域傳統(tǒng)發(fā)酵香腸細(xì)菌多樣性的研究

黃鄭朝,宋蓮軍*，黃現(xiàn)青，喬明武，趙秋艷，張平安，劉茜

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州,450002) 2(鄭州市大豆深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州,450002)

發(fā)酵香腸是指將絞碎的肉、脂肪、糖、食鹽、發(fā)酵劑、香辛料等混合，再灌進(jìn)腸衣，經(jīng)過微生物發(fā)酵而制成的具有典型發(fā)酵風(fēng)味的肉制品[1-2]。因其具有風(fēng)味獨(dú)特[3-4]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[5]、儲(chǔ)藏時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，深受全世界消費(fèi)者的喜愛。發(fā)酵香腸根據(jù)含水量、產(chǎn)地、發(fā)酵程度和加工時(shí)間有不同的分類標(biāo)準(zhǔn)而分成不同的產(chǎn)品[6]。中式香腸通常采用自然發(fā)酵方式來制作香腸，由于其微生物復(fù)雜多樣，香腸的安全和品質(zhì)沒有質(zhì)量保障。中式香腸相較于國(guó)外工業(yè)化生產(chǎn)的香腸來說，擁有自己穩(wěn)定和獨(dú)特的微生物群落，并且不同地區(qū)發(fā)酵香腸的微生物群落之間可能具有一定差異，而不同微生物對(duì)香腸的品質(zhì)有極大的影響，因此研究各個(gè)地區(qū)發(fā)酵香腸微生物分布顯得尤為重要。

微生物發(fā)酵劑具有可以在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸和促進(jìn)水分活度(Aw)下降的能力，可以抑制香腸腐敗和致病微生物的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期[7]。中式香腸作為傳統(tǒng)肉制品最為典型的代表，其生產(chǎn)方式較為落后,不僅加工期長(zhǎng),產(chǎn)品感官欠佳,還存在亞硝胺、生物胺和有害微生物等隱患[8]，菌種篩選在提高香腸食用安全方面一直是研究重點(diǎn)，研究人員在菌種復(fù)配和降低香腸生物胺含量方面做了大量研究[9-13]。當(dāng)前大多數(shù)對(duì)發(fā)酵劑的研究都是在傳統(tǒng)微生物技術(shù)的基礎(chǔ)上，從環(huán)境中篩選符合預(yù)期的菌種，并不能把環(huán)境中所有的微生物進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)，也不能說明各菌種之間的相互交叉作用，這顯然對(duì)研究結(jié)果有一定影響。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為難培養(yǎng)微生物的研究提供了技術(shù)支持，和傳統(tǒng)微生物技術(shù)相比，該方法可以快速獲取樣品中所有微生物的信息并且已廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域[14-15]。

本文采用高通量454焦磷酸測(cè)序技術(shù)，克服了傳統(tǒng)微生物技術(shù)耗時(shí)耗力和研究不夠全面的缺陷，可以避免細(xì)菌在挑菌落不全面、沒有真正顯示出微生物類群的漏洞。收集自中國(guó)4個(gè)不同地區(qū)的發(fā)酵香腸，可以在一定程度上反映中式香腸細(xì)菌群落的分布情況，為中式香腸的安全性研究和下一步香腸發(fā)酵劑的篩選提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年3月于四川成都(SC)、廣東深圳(GD)、湖南長(zhǎng)沙(HN)和黑龍江哈爾濱(HB)地區(qū)分別購買傳統(tǒng)發(fā)酵香腸，每個(gè)地區(qū)購買5種，采集的樣品均來自當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)或超市，購買時(shí)樣品均已在常溫下儲(chǔ)藏1個(gè)月左右，并采用真空包裝的形式在常溫條件下運(yùn)輸，樣品采集完成后立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

一步式細(xì)菌DNAout試劑盒:北京天恩澤基因科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)用酶:寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；SX-50型高壓蒸汽滅菌鍋，北京五洲東方科技有限發(fā)展公司；Neofuge-1600R型冷凍高速離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；1300型生物安全柜，賽默飛世爾科技公司；BagMixer40型拍擊式均質(zhì)機(jī)，Interscience公司；DH-420電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)分組

香腸根據(jù)不同的地區(qū)分為5組， SC香腸為A組，5種分別編號(hào)為A1，A2，A3，A4和A5； GD香腸為B組，5個(gè)種類分別編號(hào)為B1，B2，B3，B4和B5；HN香腸為C組，5個(gè)種類編號(hào)分別為C1，C2，C3，C4和C5；HB香腸為D組，5個(gè)種類分別編號(hào)為D1，D2，D3，D4和D5。

1.3.2 PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA

在無菌條件下，香腸去腸衣，隨機(jī)取樣25 g，裝入無菌均質(zhì)袋中，加入150 g無菌生理鹽水，拍擊式均質(zhì)器拍打(2 min)提取細(xì)菌，取1.5 mL提取液，離心去除上清液留沉淀備用，按照天恩澤一步式細(xì)菌DNAout試劑盒使用說明書提取細(xì)菌DNA。338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)作為擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)域的引物。PCR擴(kuò)增總體積為20 μL，其中含有4 μL 5×FastPfu緩沖液，0.8 μL正向引物(5 μmol/L)，0.8 μL反向引物(5 μmol/L)，2 μL 5 mmol/L dNTPs，0.4 μL FastPfu聚合酶，0.2 μL BSA，10 ng模板DNA，加ddH2O至20 μL。PCR參數(shù)設(shè)置參數(shù)如下：95 ℃下變性3 min；循環(huán)數(shù)為36次， 95 ℃下變性30 s，50 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸45 s； 72 ℃下延伸10 min。3 μL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。

1.3.3 文庫構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，文庫合格后，使用v2測(cè)序試劑盒(2×250 bp)和MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)序[16]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析進(jìn)行多樣本均數(shù)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pan和Core OTU分析

OTU(operational taxonomic units)是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元(品系，屬，種、分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志[17]。Pan OTU指的是泛OTU，是所有樣本所包含的OTU的總和，用于觀測(cè)隨著樣本總數(shù)的增加，總OTU數(shù)目的增加情況。Core OTU指的是核心OTU，是所有樣本所共有的OTU總數(shù)目，用于觀測(cè)隨著樣本總數(shù)的增加，共有OTU數(shù)目的減少情況。從圖1可以看出，隨著樣品數(shù)量的增加，曲線的變化近似于漸近線，說明樣本量已經(jīng)足夠反映客觀事實(shí)。

A-Pan OTU分析；B-Core OTU分析圖1 Pan和Core OTU分析Fig.1 Pan and Core OTU analysis

2.2 細(xì)菌多樣性分析

2.2.1 細(xì)菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有Sobs、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)。Sobs是用來表示豐富度實(shí)際觀測(cè)值的指標(biāo)，Chao1指數(shù)是生態(tài)學(xué)中用來估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)。Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)越小，說明群落多樣性和均勻性越高[18]。4個(gè)不同地區(qū)之間發(fā)酵香腸細(xì)菌多樣性指數(shù)如表1所示。在四川地區(qū)中，A5組的Sobs(160.33±2.08)、Shannon(2.10±0.25)和Chao1(197.47±2.32)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05),Simpson指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05)，A5組在SC香腸中細(xì)菌多樣性最豐富。在廣東地區(qū)中，B3組的Sobs(252.00±4.00)、Chao1(266.79±4.32)和Shannon(3.22±0.06)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，B3組Simpson(0.11±0.01)指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05)，B3組在GD香腸中細(xì)菌多樣性最豐富。在湖南地區(qū)中，C4組的Sobs(208.66±21.38)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05);Chao1(246.81±25.81)指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，其中C4和C1組之間不存在顯著性差異。C1組的Simpson指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05),其中C1組和C2組之間不存在顯著性差異;C1組的Shannon指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，C4組在HN香腸中細(xì)菌多樣性最豐富。在哈爾濱地區(qū)中，D3組的Sobs指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)；Shannon指數(shù)要明顯大于其他4組(P<0.05)，其中D3組和D5組之間不存在顯著性差異；Simpson指數(shù)要明顯小于其他4組(P<0.05),其中D3組和D5組之間不存在顯著性差異；Chao1指數(shù)也要明顯大于其他4組(P<0.05)，D3組在HB香腸中細(xì)菌多樣性最豐富。

表1 細(xì)菌多樣性指數(shù)表Table1 Bacterial diversity index

注：相同地區(qū)之間不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.2 細(xì)菌Beta多樣性分析

PCOA(principal coordinate analysis)是將聚類分析與主成分分析方法結(jié)合起來，用較少的主坐標(biāo)對(duì)分類單元進(jìn)行有效的排序，不同分組樣本的距離越近，表明樣本物種組成越相近，從圖2中可以看出，哈爾濱香腸和其他3個(gè)地區(qū)之間有明顯的不同，廣東和湖南香腸之間沒有明顯的區(qū)分，兩者的細(xì)菌在OTU水平上的分布基本上接近一致，四川香腸里面有少部分樣品在OTU水平上的分布同廣東和湖南相似,剩余樣品同其他3個(gè)地區(qū)之間有明顯的不同。

圖2 細(xì)菌Bray-Curtis距離的PCOA圖Fig.2 PCOA plot of bacterial Bray-Curtis distance

2.3 細(xì)菌組成分析

圖3是對(duì)各個(gè)地區(qū)不同樣品的有效序列進(jìn)行聚類之后求均值，細(xì)菌在菌門水平上的分布圖(相對(duì)含量<1%歸為others)。4個(gè)地區(qū)60個(gè)樣品共檢測(cè)到6個(gè)菌門，其中厚壁菌門、藍(lán)藻門和變形菌門在所有地區(qū)的樣本中占多數(shù)，是樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門，但是三者在不同區(qū)域樣品中的相對(duì)豐度不一樣，在SC和HN中，厚壁菌門占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在GD中，三者的相對(duì)含量大致相同，而在HB中，藍(lán)藻門是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌門。

A-SC 發(fā)酵香腸; B-GD發(fā)酵香腸; C-HN 發(fā)酵香腸; D-HB發(fā)酵香腸圖3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平分布圖Fig.3 Bacterial community structure phylum level distribution map

圖4是對(duì)各個(gè)地區(qū)不同樣品的有效序列進(jìn)行聚類之后求均值，細(xì)菌在菌屬水平上的分布圖(相對(duì)含量<1%歸為others)，表2是不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌屬的分布表(占比前3)。所有樣品中共檢測(cè)到26個(gè)菌屬，4個(gè)地區(qū)中均含有無法比對(duì)的菌屬存在。其中乳桿菌屬是SC的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)含量為53.68%，乳球菌屬在GD和HN中的相對(duì)含量較高，分別為17.62%和16.04%。在HB中，并沒有哪一種菌屬存在較大的優(yōu)勢(shì)，所有的菌屬分布較為均勻，反而無法比對(duì)的菌屬占據(jù)了絕大優(yōu)勢(shì)，相對(duì)含量達(dá)到了58.13%，對(duì)這些無法確定的細(xì)菌還需進(jìn)一步研究；巨型球菌屬是除了在HB地區(qū)之外都檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌屬。

A-SC發(fā)酵香腸 B-GD 發(fā)酵香腸; C-HN 發(fā)酵香腸; D-HB 發(fā)酵香腸圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平分布圖Fig.4 Distribution of bacterial community structure genus level distribution map

表2 不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌分布表Table 2 Distribution of dominant bacteria in different regions

3 討論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4個(gè)地區(qū)共20種香腸中的細(xì)菌群落進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn),從細(xì)菌多樣性和OTU重疊角度分析，HN和GD香腸的細(xì)菌組成比其他地區(qū)要更加豐富；從主坐標(biāo)角度分析，SC和HB香腸更具有地區(qū)性。哈爾濱香腸是煙熏熟制而成，并且湖南長(zhǎng)沙和廣東深圳兩者都屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,而四川成都和哈爾濱分別屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候和溫帶季風(fēng)氣候，加工工藝的不同和氣候的不同很可能導(dǎo)致了香腸細(xì)菌分布的不同，進(jìn)而導(dǎo)致了香腸風(fēng)味的不同。

在細(xì)菌水平上，4個(gè)地區(qū)中厚壁菌門，藍(lán)藻門和變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中SC地區(qū)乳桿菌屬和葡萄球菌屬占優(yōu)勢(shì)，GD地區(qū)中乳球菌屬，不動(dòng)桿菌屬和巨型球菌屬含量較高，HN地區(qū)中乳球菌屬，四聯(lián)疊球菌屬，乳桿菌屬和巨型球菌數(shù)含量較高，前三者都是屬于乳酸菌，HB地區(qū)中，D1樣品中的類芽孢桿菌屬含量較高，剩下的樣品相對(duì)于無法比對(duì)的細(xì)菌來說含量并不是太高，但從中可以看出乳酸菌含量還是具有一定比例。乳酸菌在發(fā)酵肉制品中占優(yōu)勢(shì)，和前人的研究結(jié)果是一致的[19-21]，其在發(fā)酵肉制品中主要是通過酸化來改變產(chǎn)品的品質(zhì)[22]。巨型球菌屬和葡萄球菌屬在基因上相比[23]，具有相近的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)4個(gè)地區(qū)檢測(cè)到的巨型球菌屬進(jìn)一步在菌種水平劃分，確定該菌為溶酪大球菌。溶酪大球菌呈革蘭氏陽性，早期研究表明該菌種作為內(nèi)源發(fā)酵劑，可提高對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)的分解作用,并可以耐受一定濃度的食鹽,具有亞硝酸鹽分解能力，并對(duì)改善香腸的風(fēng)味具有一定的積極作用[24-26]，對(duì)生物體沒有致病作用[27],通過全基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該菌種和葡萄球菌在代謝途徑上極為相似，但是和葡萄球菌相比，該菌種的染色體較小并且缺少毒力基因[23]。但近期研究表明，該菌的某些菌株對(duì)禽類具有感染性[28]，為了食品安全，還需進(jìn)一步對(duì)該菌種做進(jìn)一步的研究。

在傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中，本研究結(jié)果中微生物多樣性特征和其他學(xué)者相比較，大體上是一致的但也有部分差異，例如在傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中，乳酸菌和凝固酶陰性球菌是兩類主要的菌群[29]，本研究結(jié)果中除了這兩類細(xì)菌之外，藍(lán)藻門也占據(jù)了一定比例。引起這種差異可能有以下幾個(gè)原因：采樣的時(shí)間、氣候，制作香腸的工藝，制作香腸原料肉的肥瘦比，添加香辛料等的不同造成微生物生存環(huán)境的不同，從而造成了這種差異。本研究中存在的未測(cè)定微生物可能是因?yàn)楹昊蚪M測(cè)序數(shù)據(jù)中含有多種未知物種，從而很難確定一段DNA序列來源于何種物種[30]。本課題組選取了4個(gè)地區(qū)共20種香腸進(jìn)行研究，雖然有一定的局限性，但也能夠反映中式香腸細(xì)菌群落分布。