一個新的玉米silky1基因等位突變體的遺傳分析與分子鑒定

王曉娟 潘振遠 劉 敏 劉忠祥 周玉乾 何海軍 邱法展,*

一個新的玉米基因等位突變體的遺傳分析與分子鑒定

王曉娟1,**潘振遠2,**劉 敏2劉忠祥1周玉乾1何海軍1邱法展2,*

1甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所, 甘肅蘭州 730070;2華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室, 湖北武漢 430070

前期試驗發(fā)現(xiàn)一個玉米雄性不育突變體(), 命名為。經(jīng)過連續(xù)多代雜合單株自交發(fā)現(xiàn)該突變體性狀能穩(wěn)定遺傳, 遺傳模式分析表明該突變體為單個隱性1核基因控制。以與自交系B73 雜交構(gòu)建F2遺傳定位群體, 利用BSA (Bulk Segregant Analysis)方法, 篩選到與位點連鎖的4個SSR標記, 即C6-24、C6-30、C6-34和C6-40。進一步采用444個F2單株對這4個連鎖標記驗證, 將定位于標記C6-24與C6-34之間, 即玉米第6染色體68.5~98.1 Mb之間。通過基因組序列信息分析發(fā)現(xiàn), 在此定位區(qū)間內(nèi)存在一個已報道的基因?；蚓幋aMADS-BOX蛋白, 是參與花器官建成ABCD模型的B功能基因, 該基因的突變會造成雄花不育、雌花花絲增多等表型。利用雜合體+/與純合突變體/雜交進行等位測驗, 雜交后代中正常植株與突變植株分離比例符合1∶1。基因組序列以及轉(zhuǎn)錄本序列分析發(fā)現(xiàn),突變體中第6個內(nèi)含子5'端供體位點AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃, 導致第6外顯子被錯誤剪切掉, 產(chǎn)生了第6個外顯子缺失的異常轉(zhuǎn)錄本。以上實驗證據(jù)表明,與所報道的由mutator轉(zhuǎn)座子插入造成的突變體、-和的突變方式不同, 是一個新的基因等位突變體。的發(fā)現(xiàn)與鑒定為進一步深入解析玉米穗花器官決定的遺傳機制提供豐富的實驗材料, 同時也為RNA加工過程中剪接位點保守性提供重要證據(jù)。

玉米; 雄性不育; 遺傳分析;; 基因定位; 等位突變

植物典型的花器官的構(gòu)造分為4層,由外而內(nèi)依次為花萼、花瓣、雄蕊以及雌蕊, 而每一層花器官都是由不同的基因所控制的, 因此前人提出了經(jīng)典的花器官發(fā)育的ABCE模型來解釋決定花器官的遺傳機制[1-2]。依據(jù)這個模型, A類基因單獨地決定著花萼的形成, A和B兩類基因一起決定著花瓣的形成, B和C這兩類基因一起決定著雄蕊的形成, C類基因單獨決定著雌蕊的形成, 而E類基因在上述4層花器官的建成中都起著重要的作用[2-4]。是玉米中第一個被分離到的B功能基因, 它的克隆是人們對玉米B功能基因認識的一次飛躍[5]。是一個B功能DEF/AP3類同源基因, 原位雜交分析顯示首先在內(nèi)/外稃原基被激活表達, 隨后在漿片原基和雄蕊原基中表達, 并在它們的整個發(fā)育過程中都表達?；虻耐蛔冊斐尚刍ú挥? 漿片以及花藥退化為膜狀結(jié)構(gòu), 并在末端形成了絲狀突出物; 雌花可育, 花絲增多[6]。

真核生物的基因組包含大量的不能被翻譯成蛋白質(zhì)的非編碼序列。前體RNA中就含有大量的內(nèi)含子, 這些內(nèi)含子必須經(jīng)過剪切才能形成成熟mRNA, 以進行下一步的翻譯和調(diào)控。在前體RNA的剪切過程中, 內(nèi)含子通過2個外顯子的連接而被精確切除, 剪切過程是由剪切體(spliceosome)介導的。前體RNA的剪切需要兩步轉(zhuǎn)酯反應, 第一步是靠近內(nèi)含子3￠端分支點的A殘基的2’-OH對5￠端的磷酸基團進行親核攻擊, 形成2’-5￠磷酸二酯鍵連接的套環(huán)結(jié)構(gòu); 接著發(fā)生第2步轉(zhuǎn)酯反應, 被剪接的外顯子3￠核苷酸的-OH進攻3’內(nèi)含子末端的磷酸基團, 最后在3￠內(nèi)含子外顯子剪接點處斷開, 套索結(jié)構(gòu)釋放, 2個外顯子連接[7-10]。在整個剪接過程中, 剪接位點起著關(guān)鍵的作用, 并且研究發(fā)現(xiàn), 內(nèi)含子/外顯子剪接位點的序列也是相當保守的。剪接位點的變異很可能造成轉(zhuǎn)錄本外顯子的丟失或者一些隱藏的剪接位點的激活, 從而產(chǎn)生異常的轉(zhuǎn)錄本[11]。內(nèi)含子5￠端供體位點AG/ GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列非常保守, 位于內(nèi)含子的5個堿基與U1 RNA的互補配對結(jié)合是RNA剪接的首要條件[12-13]。前2個堿基GT是最為保守的, 這2個堿基的突變通常會造成錯誤的剪接。雖然+5處的堿基G也是相當保守的, 但只有20%的突變會造成錯誤的剪接發(fā)生[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個玉米雄性不育突變體材料, 命名為, 通過對該突變體的遺傳分析和基因定位, 最終發(fā)現(xiàn)是一個新的基因等位突變體。在突變體中的第6個內(nèi)含子5￠端供體位點AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃, 從而導致了第6外顯子被錯誤地剪切掉, 造成不完整轉(zhuǎn)錄本, 從而導致基因功能的喪失。該突變的發(fā)掘為進一步深入解析玉米穗花器官決定提供豐富的實驗材料, 同時也為RNA加工過程中剪接位點保守性提供重要證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米雄性不育突變體()為田間發(fā)現(xiàn)的來源于黃早四(HZ4)背景的自然突變體, 被命名為, 該突變體表現(xiàn)為雄穗不育、雌穗花絲增多;為轉(zhuǎn)座子插入的突變體, 源于Clinton J. Whipplea (Department of Biology, Brigham Young University, Provo, Utah 84602); 自交系B73和HZ4, 以及與自交系B73和HZ4分別雜交構(gòu)建的F2群體。

1.2 突變體的表型鑒定和遺傳分析

由于純合雄性不育突變體不能夠自交繁殖, 只能利用雜合基因型自交后代分離出。因此隨機選取來源于雄性不育姊妹株的正?？捎闹仓曜越环敝? 自交后代鑒定有雄性不育株, 然后再取正常植株自交種植, 以此連續(xù)多代自交觀察該突變體表型。對于突變體表型的遺傳分析, 采用分別與自交系HZ4和B73雜交構(gòu)建F2群體, 散粉期統(tǒng)計可育單株與不育單株的分離比, 利用卡方測驗確定遺傳模式。

1.3 目的基因的初定位

Bulk Segregant Analysis (BSA)是突變體/主效QTL快速定位的一個重要方法。利用分離群體野生型和突變體2個DNA池進行全基因組的多態(tài)性分析, 尋找和目標基因緊密連鎖的分析標記, 進行快速初定位[14]。在本實驗中, 利用BSA的方法對雄性不育突變位點進行初定位。首先, 將與B73雜交, 產(chǎn)生F1, 并將F1自交, 構(gòu)建F2分離群體。散粉期, 從田間選取15株不育表型植株, 分別提取DNA等量混合, 構(gòu)建一個“突變體池”; 同時, 另外選取15株表型正常的植株, 分別提取DNA等量混合, 構(gòu)建了一個“野生型池”。利用本實驗室已經(jīng)合成的均勻覆蓋玉米基因組的1000對SSR引物, 對2個混池DNA樣品進行擴增, 毛細管電泳檢測PCR產(chǎn)物, 篩選多態(tài)性標記, 在突變體DNA混池和野生型DNA混池間存在多態(tài)性的標記即為與突變基因緊密連鎖的標記。隨后, 利用444株F2分離個體組成的群體對獲得的多態(tài)性標記進行共分離驗證并定位突變位點。

1.4 定位區(qū)間基因檢索及等位測驗

根據(jù)基因的初定位區(qū)間, 在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上(http://www.maizegdb.org/)檢索區(qū)間內(nèi)的基因注釋信息, 發(fā)現(xiàn)已經(jīng)報道的玉米雄穗不育、雌穗花絲增多的基因位于該區(qū)間內(nèi)[15]。為檢測和是否等位, 利用雜合基因型單株和不育單株雜交, 統(tǒng)計后代不育單株數(shù)目以及可育單株與不育單株的分離比例。

1.5 基因組DNA提取、PCR擴增和序列分析

在散粉期, 用CTAB法分別提取突變體、、B73和HZ4的基因組DNA[16]。根據(jù)基因組序列, 利用Primer3軟件(http://primer3. ut.ee/)在線設(shè)計5對引物-F1/R1~-F5/R5) (表1), 擴增產(chǎn)物覆蓋基因組序列。以WT (HZ4和B73)與基因組DNA為模板, 分別擴增基因片段, 將PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠生物技術(shù)有限公司測序。使用CLC軟件比對分析測序結(jié)果, 確定基因突變情況。根據(jù)轉(zhuǎn)座子插入位置兩端序列設(shè)計特異引物F/R, 并結(jié)合轉(zhuǎn)座子序列末端側(cè)翼序列的簡并引物TIR6 (表1)進行基因型分析: 僅_F/R有擴增條帶為純合野生型(+/+), 只有F和R分別與TIR6結(jié)合擴增出條帶則為純合突變體(), 若3對標記都有擴增條帶則為雜合基因型(+/。試驗采用南京諾唯贊生物科技有限公司的PCR反應試劑, 擴增體系為2×PCR Mix 15 μL, 引物(10 μmol L–1) 0.5 μL, 模板DNA 2 μL, 補超純水至30 μL。PCR擴增條件為94°C預變性5 min; 94°C變性30 s, 58°C退火30 s, 72°C延伸1 min, 34個循環(huán); 68°C延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.6 RNA的提取及轉(zhuǎn)錄本的擴增

根據(jù)基因型取純合野生型以及突變體雄穗幼穗, 用植物總RNA提取試劑盒提取RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司, Cat# AU311-02)反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以cDNA為模板, 設(shè)計特異引物-cDNA-F/R (表1), 進行CDS擴增并測序(反應體系同上)。

表1 Silky1基因相關(guān)的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體msm-6的表型和遺傳分析

主要表現(xiàn)為雄穗不育, 雌穗花絲增多(圖1-A, B)。通過對花器官進一步的解剖觀察發(fā)現(xiàn),突變體雄花不開裂, 花藥退化為膜狀結(jié)構(gòu)并在末端形成了絲狀突出物, 從而造成雄花不育的表型(圖1-C); 雌花花絲增多, 每一個子房對應2~4個花絲(圖1-D)。利用雜合基因型自交后代的分離對進行繁殖, 經(jīng)過連續(xù)自交發(fā)現(xiàn)該突變表型能夠穩(wěn)定遺傳; 將該突變體與HZ4和B73分別雜交, F1表現(xiàn)為野生型, 統(tǒng)計F1自交得到的2個F2群體中野生型和突變體的數(shù)目, 經(jīng)卡方檢驗其分離比例都符合3∶1 (表2), 表明雄性不育性狀是受單個隱性核基因控制。

圖1 msm-6突變體雄穗和雌穗表型

A: 野生型(上)和突變體(下)的雄穗表型; B: 野生型(左)和突變體(右)的雌穗表型; C: 野生型(左)和突變體(右)的雄花表型; D: 野生型(左)和突變體(右)的雌花表型。A圖, 標尺=5 cm; B圖, 標尺=3 cm; C圖, 標尺=3 mm; D圖, 標尺=3 cm。

A: Tassel of WT (up) and(down); B: Ear of WT (left) and(right); C: Male flower of WT (left) and(right); D: Female flower of WT (left) and(right). Bar = 5 cm in Fig. A; bar = 3 cm in Fig. B; bar = 3 mm in Fig. C; bar = 3 cm in Fig. D.

2.2 msm-6基因定位

利用F2群體, 采用BSA方法在1000對SSR標記中共篩選4對多態(tài)性標記, 分別為C6-24、C6-30、C6-34和C6-40; 根據(jù)B73 V4版本參考基因組信息, 這4對標記都位于玉米第6染色體上, 物理位置分別為68453519、87429100、98078061、107626979 (表3和圖2)。4對標記在野生型DNA池中都擴增出雙帶, 而在突變體DNA池中只擴增出單帶, 初步推測這4對標記與突變位點緊密連鎖。進而對444個F2單株的基因型分析表明, C6-24、C6-30、C6-34和C6-40與突變性狀表型相關(guān)的交換頻率分別為0.045、0、0.011和0.034 (表3), 此結(jié)果不僅驗證了BSA結(jié)果的真實性, 而且確定突變位點與C6-30更緊密連鎖, 最終根據(jù)交換單株的基因型信息將的突變位點定位于標記C6-24與C6-34之間約30 Mb的物理區(qū)間內(nèi)(表4)。

圖2 BSA篩選到的與msm-6連鎖標記

表2 F2分離群體的卡方測驗

表3 連鎖標記信息以及與突變位點的交換頻率

表4 重組單株基因型以及表型信息

H表示雜合基因型; B表示突變體基因型。

H shows the heterozygosity genotype; B shows the genotype of the mutant.

2.3 msm-6和silk1等位測驗

采用基因型為+/雜合單株的花粉和純合突變體雜交, 雜交后代出現(xiàn)了突變表型(圖3), 在調(diào)查的106個單株中, 表現(xiàn)為野生型表型的為56個, 突變體表型的50個, 卡方檢驗分析表明野生型植株與突變體植株的分離比為1︰1 (= 0.56), 證明了可能為新的等位突變體

圖3 msm-6與silky1突變體等位測驗

A: 以雜合+/單株和突變體雜交后代的野生型; B: 以雜合+/單株和突變體雜交后代的突變體。

A: The wild-type plant from×+/; B: The mutant plant from×+/

2.4 msm-6突變位點鑒定

為進一步驗證和是等位基因并確認的突變位點, 根據(jù)B73參考基因組序列共設(shè)計5對特異引物對基因啟動子以及基因區(qū)進行PCR擴增, 擴增模板為WT(HZ4)和基因組DNA, 擴增產(chǎn)物從1237 bp到1562 bp跨疊式覆蓋了基因組序列(表1)。對擴增產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn),突變體中第6個內(nèi)含子5'端供體位點AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃 (圖4-A, B)。而已報導的突變體、和均由轉(zhuǎn)座子的插入造成, 以上研究結(jié)果充分證實是一個新的等位突變體。

2.5 Silky1基因在msm-6突變體中的轉(zhuǎn)錄本擴增

分別取純合突變體和純合野生型雄穗幼穗提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 對轉(zhuǎn)錄本進行擴增, 結(jié)果顯示, 與野生型相比, 突變體轉(zhuǎn)錄本變小(圖5-A)。通過進一步的測序分析發(fā)現(xiàn),突變體中轉(zhuǎn)錄本第6個外顯子缺失(圖5-B)。轉(zhuǎn)錄本的不完整性造成了該基因的功能缺失, 產(chǎn)生相關(guān)的突變表型。

圖4 msm-6突變位點鑒定

A: 野生型以及突變體的序列分析; 箭頭指示突變位點。B:基因結(jié)構(gòu)示意圖及2個突變體的突變位置。

A: The sequence analysis of WT and; The arrow indicates the mutation site. B: Gene structure ofand mutation site of two mutants.

圖5 msm-6突變體中Silky1轉(zhuǎn)錄本Exon6的缺失

A:轉(zhuǎn)錄本在野生型和突變體中的擴增; B:轉(zhuǎn)錄本在野生型和突變體中的序列分析。

A: PCR product oftranscript between WT and6;B: The sequence analysis oftranscript between WT and

3 討論

BSA是突變體/主效QTL快速定位的一個重要方法[16]。利用分離群體野生型和突變體2個DNA池進行全基因組的多態(tài)性分析, 就能夠快速找到與基因/QTL連鎖的分子標記, 確定基因/QTL所在區(qū)間位置, 該方法簡單快速, 并且節(jié)約成本, 得到了廣泛應用[17-18]。在玉米上, 通過BSA的方法定位及克隆了許多基因/位點。Cai等[19]采用1000個覆蓋玉米全基因組的SSR標記對突變體以及野生型DNA混池進行基因型分析, 成功定位克隆了一個控制玉米籽粒發(fā)育的基因。Zhao等[20]鑒定到了一個雌穗無花絲的突變體, 通過構(gòu)建DNA混池, 并結(jié)合228個覆蓋玉米全基因組的SSR標記將定位于第2染色體, 并通過進一步精細定位將其成功克隆。Strable等[21]利用BSA的方法將控制葉片下垂的突變基因以及分別定位于第1染色體短臂以及9號染色體長臂, 同樣通過精細定位成功將其克隆。本研究采用F2分離群體的野生型和突變體各15株, 及BSA策略快速將定位于第6染色體68.5~98.1 Mb的區(qū)間內(nèi), 實驗結(jié)果真實可靠。

等位測驗是通過雜交試驗對雜交后代性狀的分離進行統(tǒng)計分析, 確定基因之間的等位性。本研究中, 由于雄性不育突變體不能產(chǎn)生后代, 因此, 只能利用+/雜合單株的花粉和純合突變體雜交進行初步的等位性檢測, 初步驗證了和的等位性進而利用基因序列分析鑒定真實的突變位點, 結(jié)合基因在突變體中的轉(zhuǎn)錄本擴增結(jié)果, 充分證明是的一個新等位基因

剪接位點的識別是RNA內(nèi)含子剪接加工過程中非常關(guān)鍵一步, 而且剪接位點的序列在各物種間都是相對比較保守的, 因此剪接位點的變異很可能會造成mRNA的錯誤加工, 導致基因功能的喪失?；虻牡?2個內(nèi)含子第5位堿基由G突變?yōu)锳 (4518+5G > A), 造成了剪接位點的失活, 從而形成了錯誤的剪接以及轉(zhuǎn)錄的提前終止, 導致杜氏肌萎縮癥發(fā)生[22]。膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白基因()第1個內(nèi)含子剪接供體位點的突變, 造成蛋白的移碼突變, 從而導致高α脂蛋白血癥發(fā)生[23]。在水稻中,基因的第1個內(nèi)含子的剪接位點前2個堿基由GT突變?yōu)門T, 從而影響了轉(zhuǎn)錄本的正常剪接, 導致蛋白功能的缺失[24]。玉米中,的等位突變體-是第3個內(nèi)含子的5￠端剪接位點由GT突變?yōu)锳T造成的, 該堿基的突變造成了該剪接位點的失活以及另外2個臨近剪切位點的激活, 從而產(chǎn)生了包含第3個內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄本以及缺失第3個外顯子的轉(zhuǎn)錄本, 而這2種轉(zhuǎn)錄本都不能翻譯成有功能的蛋白, 造成胚乳發(fā)育缺陷表型[25]。本研究發(fā)現(xiàn), 在中,基因第6個內(nèi)含子的剪接供體位點第1個堿基由G突變?yōu)镃, 造成了剪接位點不能被正常識別, 導致第6個外顯子連同第6個內(nèi)含子一起被剪切掉, 形成了1個第6個外顯子缺失的不完整轉(zhuǎn)錄本, 導致表型產(chǎn)生。

Ambrose等[6]采用分離轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列標簽法從和共3個突變體中成功分離克隆了基因。在這3個突變體中, 轉(zhuǎn)座子分別插入在第3個內(nèi)含子、第1個內(nèi)含子以及第2個外顯子, 并影響了該基因的轉(zhuǎn)錄, 造成雄花不育, 漿片以及花藥退化為膜狀結(jié)構(gòu), 并在末端形成了絲狀突出物、雌花可育、花絲增多的突變表型。根據(jù)蛋白同源分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼1個B功能DEF/ AP3蛋白, 其同源基因在擬南芥和金魚草中早有報道, 同樣參與花器官的決定, 會造成突變體花瓣轉(zhuǎn)化為萼片以及雄蕊[26]。本研究獲得了1個新的等位突變體, 該突變體和已報道的突變體具有相似的表型。該突變體的突變位點位于第6個內(nèi)含子第1個堿基, 由G突變?yōu)镃, 導致轉(zhuǎn)錄本不能夠正常剪切, 第6個外顯子缺失, 影響轉(zhuǎn)錄后加工過程, 與前人報道的基因影響轉(zhuǎn)錄過程不同。

4 結(jié)論

發(fā)現(xiàn)了一個玉米雄性不育突變體材料,是基因的一個新等位突變體。在突變體中,的第6個內(nèi)含子5￠端供體位點AG/GTAAG (外顯子/內(nèi)含子交接處)的序列+1位G突變?yōu)镃, 導致第6外顯子被錯誤地剪切掉, 產(chǎn)生不完整轉(zhuǎn)錄本, 喪失基因功能。的發(fā)現(xiàn)與鑒定為進一步深入解析玉米穗花器官決定的遺傳機理提供豐富的試驗材料, 同時也為RNA加工過程中剪接位點保守性提供重要證據(jù)。

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Genetic analysis and molecular characterization of a new allelic mutant ofgene in maize

WANG Xiao-Juan1,**, PAN Zhen-Yuan2,**, LIU Min2, LIU Zhong-Xiang1, ZHOU Yu-Qian1, HE Hai-Jun1, and QIU Fa-Zhan2,*

1Crops Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, Gansu, China;2National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070, Hubei, China

We identified a new maize male sterile mutant in early experiment, designated as. This mutant characters were steadily inherited and genetically regulated by a single recessive gene. An F2population was developed by crossing B73 inbred line to, and four SSR markers (C6-24, C6-30, C6-34, and C6-40) closely linked to this locus were identified by BSA (Bulked Segregant Analysis) method. The 444 F2individuals were used to map the target gene in an interval from 68.5 to 98.1 Mb between markers C6-24 and C6-34 on chromosome 6. Using genomic sequence database, we found thatgenewas located in this mapping region.encodes a B function MADS box protein of ABCD model for floral organ establishment. The mutation ofled to sterile stamen and more silks of the ear. By crossing heterozygous +/plants to homozygousplants, we found a 1:1 segregation ratio for normal to male sterile plants.Genomic and cDNA sequences ofdisclosed a single-nucleotide change from G to C at the first position of intron 6, which resulted in exon 6 skipping, producing aberrant mRNAs without exon 6. Sois a new allele mutant of, which is different from,, andcaused by the insertion of mutator transposons. The identification ofprovides not only abundant experimental materials for the study of the floral organ determination in maize, but also important evidence for the conservation of splicing sites in RNA processing.

maize;genetic analysis;;gene mapping; allelic mutant

本研究由國家重點研發(fā)計劃“七大農(nóng)作物育種”專項(2018YFD0100202-3)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0100202-3).

2019-02-26;

2019-05-12;

2019-06-03.

邱法展, E-mail: qiufazhan@mail.hzau.edu.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

王曉娟, E-mail: wangxj839@sina.com; 潘振遠, E-mail: panzhenyuandawood@163.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190603.0848.004.html

10.3724/SP.J.1006.2019.93009