高效液相色譜法測定人血清中拉莫三嗪血藥濃度的方法及拉莫三嗪個體化用藥分析

李萌，莊星星，倪受東，何勇

拉莫三嗪（lamotrigine）是新一代苯三嗪類的廣譜抗癲癇藥，具有良好的抗癲癇作用，對部分性發(fā)作和全身性發(fā)作性癲癇均有治療作用。臨床上LTG聯(lián)合丙戊酸為常見抗癲癇的治療方案。此外，臨床上拉莫三嗪已被作為心境穩(wěn)定劑運用到雙相情感障礙以及躁狂的治療［1-2］。文獻(xiàn)資料及臨床試驗表明，拉莫三嗪在體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程復(fù)雜，達(dá)到有效血藥濃度所需的劑量個體差異很大，其可受年齡、體質(zhì)量、服藥劑量及合并用藥等諸多因素的影響［3-4］，臨床個體化、合理用藥均要求測定拉莫三嗪的血藥濃度。因此，本課題組于2017年1月至2018年1月參考國內(nèi)外文獻(xiàn)資料報道的血清中拉莫三嗪的高效液相色譜法（HPLC）測定方法［5-7］，摸索、建立了一種新的簡便、快速、準(zhǔn)確的拉莫三嗪血藥濃度監(jiān)測方法，并將其推向臨床應(yīng)用，對臨床病人進(jìn)行拉莫三嗪血藥濃度監(jiān)測，為臨床個體化、合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器高效液相色譜儀（美國Aglient公司，型號1260）；OpenLAB CDS ChemStation工作站；Sartorius電子分析天平（上海梅特勒多-托利多）；XW-80A渦旋振蕩器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；TGL-16H離心機（珠海黑馬儀器公司）；氮吹儀EYELA MG-2200（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司，型號HH501）。

1.2試劑拉莫三嗪對照品（Sigma公司，批號L20170653）；艾司唑侖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號2016093）；甲醇（色譜純）；二氯甲烷（分析純）；健康人空白血清（供質(zhì)控用，-20℃保存）；超純水；其余化學(xué)試劑為分析純；

1.3色譜條件流動相：甲醇∶水=75∶25；流速：1.0 mL/min；色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：225 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；進(jìn)樣時間：8 min（出峰時間：拉莫三嗪為3.46 min；內(nèi)標(biāo)為4.84 min）。

1.4對照品及內(nèi)標(biāo)液的制備精密稱取拉莫三嗪對照品1.0 mg，加入10 mL容量瓶中，定容。配制成100 μg/mL的拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)液。

精密稱取艾司唑侖對照品1.5 mg，加入10 mL容量瓶中，定容。配制成150 μg/mL的艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)液作為內(nèi)標(biāo)液。

1.5血清樣品的處理將血樣放入離心機3 000 r/min離心10 min；取血清100 μL與2.0 mL的離心管內(nèi)，加內(nèi)標(biāo)液10 μL，振蕩混勻1 min；加入二氯甲烷1.0 mL萃取，振蕩1 min，取下層試液；氮氣吹干，加100 μL甲醇振蕩1 min復(fù)溶；5 000 r/min離心5 min；取10 μL進(jìn)樣。

1.6質(zhì)控血清樣品的制備用空白血清和拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)液制備濃度分別為3.0 μg/mL，6.0 μg/mL，9.0 μg/mL，12.0 μg/mL，15.0 μg/mL以及18.0 μg/mL含拉莫三嗪的質(zhì)控血清。按照“1.5血清樣品的處理”進(jìn)行前處理，按照“1.3色譜條件”進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1專屬性試驗將空白血清、空白血清+內(nèi)標(biāo)物+拉莫三嗪對照品和病人含藥血清+內(nèi)標(biāo)物，按“1.5血清樣品的處理”方法前處理；在“1.3色譜條件”下檢測。由圖1可知，拉莫三嗪與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰可完全分離（拉莫三嗪出峰時間：3.46 min；內(nèi)標(biāo)物出峰時間：4.84 min），血清中內(nèi)源性物質(zhì)對拉莫三嗪和內(nèi)標(biāo)物的出峰時間和峰面積無明顯干擾，可見該檢測方法專屬性較高。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用空白血清和拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)液制備濃度分別為1.0μg/mL，3.0μg/mL，6.0μg/mL，9.0 μg/mL，12.0 μg/mL，15.0 μg/mL以及18.0 μg/mL含拉莫三嗪的質(zhì)控血清。按照“1.5血清樣品的處理”進(jìn)行前處理，按照“1.3色譜條件”進(jìn)行分析；以拉莫三嗪與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比X對拉莫三嗪血藥濃度Y作線性回歸，得到線性回歸方程：Y=9.934 4X+0.808 3，r=0.999 8（n=7）；拉莫三嗪血藥濃度在1.00～18.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當(dāng)信噪比：S/N≥10時，最低檢測限：0.80 μg/mL。

注：a為拉莫三嗪，b為內(nèi)標(biāo)物

2.3精密度試驗用空白血清和拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)液制備濃度為9.0 μg/mL的含藥血清，按“1.5血清樣品的處理”方法前處理；在“1.3色譜條件”下檢測。1 d內(nèi)不同時間測定3次及3 d內(nèi)每天進(jìn)樣1次，考察日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果表明日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于15%，符合《中華人民共和國藥典2015版》關(guān)于生物樣品分析方法的要求。

2.4穩(wěn)定性試驗用空白血清和拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)液制備濃度為9.0 μg/mL的含藥血清，反復(fù)凍融3次后，按“1.5血清樣品的處理”方法前處理；在“1.3色譜條件”下檢測。結(jié)果表明3次檢測結(jié)果RSD均小于15%，藥物凍融穩(wěn)定性良好。

2.5回收率試驗用空白血清和拉莫三嗪標(biāo)準(zhǔn)液制備濃度3.0 μg/mL、9.0 μg/mL以及18 μg/mL的含藥血清各3份，按“1.5血清樣品的處理”方法前處理；在“1.3色譜條件”下檢測，計算加樣回收率；用甲醇和拉莫三嗪對照品制備濃度3.0 μg/mL、9.0 μg/mL以及18 μg/mL的工作液，進(jìn)樣測定。以標(biāo)準(zhǔn)血清樣品中拉莫三嗪峰面積與工作液中拉莫三嗪峰面積計算提取回收率。結(jié)果見表1。

表1 拉莫三嗪加樣回收率試驗結(jié)果/%

2.6干擾試驗取口服拉莫三嗪聯(lián)合其他治療藥物（丙戊酸、奧卡西平、卡馬西平、苯妥英鈉、苯巴比妥）病人的血樣。按“1.5血清樣品的處理”方法前處理；在“1.3色譜條件”下檢測。實驗結(jié)果表明，聯(lián)合相關(guān)藥物對拉莫三嗪以及內(nèi)標(biāo)物的出峰時間和峰面積無影響。

2.7臨床應(yīng)用選擇5例在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院門診或住院口服拉莫三嗪的病人，拉莫三嗪片均由該院提供（規(guī)格25 mg×48片/盒，湖南三金制藥 生 產(chǎn) ，批 號 170123，170318，170509，170624，170923），病人的情況和拉莫三嗪治療藥物監(jiān)測結(jié)果見表2。

表2 拉莫三嗪治療藥物監(jiān)測結(jié)果以及個體化用藥分析

根據(jù)神經(jīng)精神藥理學(xué)與藥物精神病學(xué)協(xié)會（AGNP）指南，拉莫三嗪治療藥物監(jiān)測推薦范圍：3～14 μg/mL。治療藥物監(jiān)測可為拉莫三嗪臨床合理、個體化用藥提供參考依據(jù)，在藥物不良反應(yīng)監(jiān)測以及病人服藥依從性方面均可為臨床提供有價值的藥學(xué)服務(wù)信息。

本課題組認(rèn)為，藥學(xué)人員在分析血藥濃度結(jié)果時，應(yīng)當(dāng)擺脫血藥濃度推薦范圍的藥學(xué)思維束縛。根據(jù)血藥濃度監(jiān)測結(jié)果制定個體化治療方案時，綜合考慮血藥濃度監(jiān)測結(jié)果、臨床療效以及藥物不良反應(yīng)情況，在保證病人安全用藥的前提下，使病人獲得最大的治療效益。

3 討論

拉莫三嗪在體內(nèi)有多種代謝途徑，主要在肝臟與葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶以及葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)生葡萄糖醛酸結(jié)合物，由尿液排出體外［8］。與傳統(tǒng)的抗癲癇藥物不同，拉莫三嗪的經(jīng)肝代謝過程中無氧化反應(yīng)，對肝藥酶無誘導(dǎo)或抑制作用，因此拉莫三嗪對其他藥物的代謝無明顯影響。文獻(xiàn)資料表明，當(dāng)拉莫三嗪與肝藥酶誘導(dǎo)劑（如卡馬西平、苯巴比妥）聯(lián)合使用時，血漿清除率增加1.18倍，半衰期明顯縮短；當(dāng)與肝藥酶抑制劑（如丙戊酸）合用時，血漿清除率下降60%，半衰期明顯延長［9］。因此拉莫三嗪的體內(nèi)代謝過程極易受到其他藥物的影響，特別是與酶誘導(dǎo)劑或酶抑制劑聯(lián)合使用時，其相互作用復(fù)雜，對拉莫三嗪血藥濃度影響較大，對使用拉莫三嗪的病人進(jìn)行治療藥物監(jiān)測十分必要［10］。

HPLC在監(jiān)測血藥濃度時，流動相的選擇對待測物和內(nèi)標(biāo)物的峰對稱性、分離情況以及保留時間等色譜行為都存在影響。課題組通過實驗對比甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)以及乙腈-磷酸鹽緩沖液；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-磷酸鹽作為流動相時，色譜峰的拖尾因子及峰寬均隨之降低，同時被測物與內(nèi)標(biāo)物也更加易于分離。但柱壓較高影響色譜柱使用壽命，系統(tǒng)平衡以及檢測后色譜柱沖洗時間較長；乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)的分離效果相當(dāng)，峰均無拖尾；甲醇-水系統(tǒng)的保留時間要短于乙腈-水系統(tǒng)。綜合考慮流動相對儀器及色譜柱的損害情況以及實驗成本，課題組選擇甲醇-水系統(tǒng)作為最終的流動相。

治療藥物監(jiān)測作為臨床藥學(xué)一個重要分支，是在藥物代謝動力學(xué)理論的指導(dǎo)下，運用高通量、高精密度的化學(xué)分析技術(shù)，測定病人血液或其它體液中的藥物濃度，獲取相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)；大多數(shù)藥物藥理作用的強弱以及持續(xù)時間的長短均與藥物在受體部位的濃度呈正比，血藥濃度與藥物的治療效果或毒性反應(yīng)均具有一定的相關(guān)性。因此，根據(jù)藥物濃度進(jìn)行臨床合理用藥方案的制訂或調(diào)整，有助于提高藥物治療的安全性和有效性［11］。

此外，癲癇病人需要長期的院外自行服藥，脫離了醫(yī)護(hù)人員的監(jiān)管，容易出現(xiàn)漏服藥、少服藥以及不服藥等依從性較差的情況。所以對癲癇病人進(jìn)行定期的門診血藥濃度監(jiān)測，也有助于對病人的服藥依從性進(jìn)行判斷，進(jìn)而為臨床準(zhǔn)確地診斷病情提供參考依據(jù)［12］。

本研究建立了一種新的拉莫三嗪血藥濃度的HPLC監(jiān)測方法，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確適合在臨床推廣應(yīng)用。