宮頸鱗癌組織中TPX2和Aurora-A蛋白的表達(dá)水平及預(yù)后意義

董潔，胡觀麗，況蕾，莊濤，張蓓，2

宮頸癌位居所有女性腫瘤致死原因第3位［1］。宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）被廣泛認(rèn)為是宮頸癌的癌前病變，從CIN進(jìn)展到宮頸癌的過程中涉及一系列分子表達(dá)及功能的異常變化［2］。TPX2（targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2）蛋白為微管相關(guān)蛋白，參與有絲分裂紡錘體形成和穩(wěn)定性形成，Aurora-A（serine/threonine-protein kinase 6）主要功能為在細(xì)胞分裂的過程中調(diào)節(jié)G2/M轉(zhuǎn)變，在染色體穩(wěn)定性方面起了重要作用［3］。TPX2和Aurora-A蛋白已被證明在多種惡性腫瘤中存在基因擴(kuò)增或者過表達(dá)，并且與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)［3］。然而，TPX2和Aurora-A在宮頸鱗癌組織中的蛋白表達(dá)水平與病人預(yù)后的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步研究。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性收集2011年6月至2013年6月于徐州市中心醫(yī)院行手術(shù)治療或?qū)m頸活檢的宮頸鱗癌、CIN及慢性宮頸炎病人的宮頸組織。我們將納入的病人分為四組。宮頸鱗癌組：宮頸鱗癌85例，年齡范圍為22～78歲，平均年齡48.6歲；臨床分期按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）標(biāo)準(zhǔn)［4］，Ⅰ期50例，Ⅱ期25例，Ⅲ期10例；高分化6例，中分化59例，低分化20例。CINⅡ～Ⅲ組：病人（細(xì)胞學(xué)檢查為高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變）30例，年齡范圍為27～76歲，平均年齡46.9歲。CINⅠ組：（細(xì)胞學(xué)檢查為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變）病人30例，年齡范圍為27～65歲，平均年齡45.6歲。慢性宮頸炎組：慢性宮頸炎20例，取自同期因子宮肌瘤行子宮切除手術(shù)的宮頸組織標(biāo)本，年齡范圍為28～60，平均年齡46.25歲。

宮頸鱗癌病人納入標(biāo)準(zhǔn)：病理切片確診為宮頸鱗癌，病人的臨床特征資料完整，均進(jìn)行治療后隨訪，主要包括門診、電話隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、來自于生殖系統(tǒng)其他器官腫瘤的轉(zhuǎn)移癌（包括原發(fā)性雙癌）、有院外治療史病人。本研究病人均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)免疫組織化學(xué)TPX2和Aurora-A一抗抗體購(gòu)于Abcam公司。組織蠟塊按照4 μm厚度連續(xù)切片，采用濃度為3%的過氧化氫處理切片后，高溫環(huán)境進(jìn)行抗原修復(fù)。取出小鼠抗人TPX2單抗，按照1∶100稀釋后4℃孵育過夜。37℃孵育二抗30 min后進(jìn)行DAB顯色。陰性對(duì)照中采用PBS緩沖液替代一抗處理。Aurora-A蛋白表達(dá)檢測(cè)按照相同實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行。TPX2陽性染色為棕黃色著色于細(xì)胞核，Aurora-A陽性為細(xì)胞核及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃褐色顆粒。采用半定量法，隨機(jī)在顯微鏡下選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)的百分比：＜5%為陰性表達(dá)，＞5%為陽性表達(dá)。

1.3隨訪本課題組對(duì)85例宮頸鱗癌病人均進(jìn)行門診或電話隨訪，以病人開始治療的時(shí)間為隨訪起始時(shí)間，2018年6月30日為隨訪截止的日期。總生存期定義為病人從隨訪開始至出現(xiàn)宮頸鱗癌致死的時(shí)間。由于意外或其他不相關(guān)的疾病導(dǎo)致死亡的病人定義為截尾事件進(jìn)行處理。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)資料均為計(jì)數(shù)資料，以例數(shù)及百分率表示，采用整體+分割χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估TPX2和Aurora-A蛋白水平的表達(dá)相關(guān)性。采用Kaplan-Meier建立生存分析模型，采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組總生存率的差異。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌、CIN和慢性宮頸炎病人宮頸組織中的表達(dá)情況TPX2蛋白四組病人宮頸組織中的表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。組間兩兩比較結(jié)果顯示，宮頸鱗癌和CINⅡ～Ⅲ中TPX2蛋白表達(dá)陽性率高于CINⅠ和慢性宮頸炎（P＜0.05）；宮頸鱗癌與CINⅡ～Ⅲ、CINⅠ與慢性宮頸炎之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Aurora-A蛋白在四組病人宮頸組織中的表達(dá)陽性率也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。組間兩兩比較結(jié)果顯示，宮頸鱗癌和CINⅡ～Ⅲ中Aurora-A蛋白表達(dá)陽性率高于CINⅠ和慢性宮頸炎（P＜0.05）；宮頸鱗癌與CINⅡ～Ⅲ、CINⅠ與慢性宮頸炎之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌、CIN和慢性宮頸炎病人宮頸組織中的表達(dá)情況/例（%）

2.2宮頸鱗癌組織中TPX2和Aurora-A蛋白的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)一步利用Spearman相關(guān)分析，研究TPX2和Aurora-A蛋白水平在宮頸鱗癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，TPX2和Aurora-A的蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.229，P=0.035）。見表2。

表2 TPX2和Aurora-A蛋白在85例宮頸鱗癌組織中的表達(dá)相關(guān)性/例

2.3宮頸鱗癌組織中TPX2和Aurora-A蛋白的表達(dá)與病人生存時(shí)間的關(guān)系利用Kaplan-Meier生存分析方法，分別分析TPX2和Aurora-A蛋白的表達(dá)與宮頸鱗癌病人總生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示，TPX2和Aurora-A蛋白陽性表達(dá)病人的平均生存時(shí)間顯著短于陰性表達(dá)病人（P＜0.05），見圖1。TPX2蛋白表達(dá)陽性和陰性病人的5年生存率分別為37.8%和77.7%，Aurora-A蛋白表達(dá)陽性和陰性病人的5年生存率分別為37.3%和83.5%。

多因素Cox回歸分析顯示FIGO分期、病理分級(jí)、肌層浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TPX2、Aurora-A蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌病人預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。在校正了可能的混雜因素后，TPX2和Aurora-A蛋白可作為宮頸鱗癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［風(fēng)險(xiǎn)比（HR）=2.449，95%置信區(qū)間（CI）：1.056～5.676，P=0.037；HR=2.354，95%CI：1.182～4.688，P=0.015］。見表3。

表3 Cox多因素回歸分析宮頸鱗癌85例的預(yù)后影響因素

圖1 TPX2和Aurora-A蛋白表達(dá)與85例宮頸鱗癌病人預(yù)后的關(guān)系：A為TPX2蛋白，B為Aurora-A蛋白

3 討論

TPX2蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，介導(dǎo)Xklp2的COOH-末端與微管的連接，在從G1/S期過渡到胞質(zhì)分裂時(shí)顯著表達(dá)［5］。TPX2蛋白對(duì)細(xì)胞紡錘體的形成具有重要作用并且可以作為評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖能力的生物標(biāo)志物［6］。研究表明，TPX2蛋白在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，包括乳腺癌［7］、肺癌［8］以及前列腺癌［9］等。在細(xì)胞功能方面，TPX2可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而在多種腫瘤中發(fā)揮促癌基因的作用［10］。在宮頸鱗癌細(xì)胞中，干擾TPX2基因的表達(dá)可以抑制宮頸鱗癌細(xì)胞在體外的增殖，并且可以抑制宮頸鱗癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，說明TPX2在宮頸鱗癌中扮演著促癌基因的作用［11］。

Aurora-A是Aurora家族最重要的成員之一，主要功能是參與中心體的復(fù)制、分離與成熟，紡錘體微管的組裝與穩(wěn)定，以及染色體的正常分離等［12］。Aurora-A蛋白的異常表達(dá)與較高的腫瘤發(fā)病率相關(guān)［12］。在促癌作用機(jī)制方面，Aurora-A蛋白可以通過誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性，增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等能力，進(jìn)而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展［13］。在宮頸鱗癌中，研究表明Aurora-A可能參與人乳頭狀瘤病毒（HPV）誘導(dǎo)的宮頸鱗癌的發(fā)生，并且可能作為有效的分子靶標(biāo)，治療HPV誘導(dǎo)的宮頸鱗癌［14］。

在本研究中，我們重點(diǎn)檢測(cè)了TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)，并且與CIN病人、慢性宮頸炎病人進(jìn)行對(duì)比。我們發(fā)現(xiàn)，TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌和CINⅡ～Ⅲ組織中表達(dá)陽性率顯著高于CINⅠ和慢性宮頸炎病人。前期已有的研究表明，TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌和CIN組織中呈現(xiàn)出陽性表達(dá)［15-17］。我們的結(jié)果與之類似，更進(jìn)一步明確發(fā)現(xiàn)，TPX2和Aurora-A蛋白在CINⅡ～Ⅲ中的表達(dá)陽性率開始顯著升高。我們的研究提示，TPX2和Aurora-A蛋白可能在CINⅠ進(jìn)展為CINⅡ～Ⅲ的過程中，發(fā)揮著重要的促癌作用。此外此外我們還發(fā)現(xiàn)，TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌病人組織中表達(dá)顯著正相關(guān)。在分子機(jī)制上，TPX2可以作為Aurora-A的輔助因子，促進(jìn)Aurora-A定位于紡錘體并發(fā)揮生物學(xué)功能；反之，Aurora-A也能促進(jìn)TPX2功能的發(fā)揮［18］。因此，TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌發(fā)生和進(jìn)展過程中，可能發(fā)揮著協(xié)同促癌的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中TPX2和Aurora-A蛋白的陽性表達(dá)與宮頸鱗癌病人較短的總生存期相關(guān)。TPX2和Aurora-A蛋白表達(dá)陽性的宮頸鱗癌病人5年生存期顯著降低，提示TPX2和Aurora-A蛋白可能在宮頸鱗癌進(jìn)展惡化的過程中發(fā)揮重要的作用。這與TPX2和Aurora-A蛋白在其它腫瘤中的預(yù)后意義類似。在消化道惡性腫瘤中，TPX2的陽性表達(dá)與病人較差的預(yù)后相關(guān)［19］；在非小細(xì)胞肺癌病人中，Aurora-A高水平表達(dá)也與病人的耐藥及總生存期相關(guān)［20］。本研究還利用多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，TPX2和Aurora-A蛋白可作為宮頸鱗癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示TPX2和Aurora-A蛋白可以作為預(yù)后生物標(biāo)志物，在宮頸鱗癌病人治療效果預(yù)測(cè)中起到一定的臨床意義。

本研究也存在一定的局限性。本研究?jī)H關(guān)注宮頸鱗癌組織中TPX2和Aurora-A的蛋白表達(dá)，未能研究宮頸腺癌中TPX2和Aurora-A的蛋白表達(dá)水平及預(yù)后意義。

綜上所述，本研究顯示，TPX2和Aurora-A蛋白在宮頸鱗癌、CINⅡ～Ⅲ組織中高表達(dá)，TPX2和Aurora-A蛋白可能在宮頸鱗癌從癌前病變進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的過程中發(fā)揮促癌的作用。同時(shí)，TPX2和Aurora-A蛋白陽性表達(dá)與宮頸鱗癌較差的預(yù)后相關(guān)，可以作為宮頸鱗癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，TPX2和Aurora-A可能作為新的分子靶點(diǎn)，為宮頸鱗癌的治療和預(yù)后提供新的思路。