梓醇對阿爾茨海默病大鼠模型大腦皮質(zhì)保護作用

劉倩倩，劉倩，李文濤，王金紅，曲梅花

神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的主要臨床病征包括進行性學習記憶功能下降、認知功能損害等，對病人、家庭和社會危害嚴重［1-3］，積極探索有效的治療藥物成為近年來重要的研究方向。梓醇是中藥地黃的主要有效成分之一，大量研究證明其有神經(jīng)保護作用［4］。我們前期的研究表明梓醇改善AD大鼠學習記憶能力，其作用機制與膽堿酯酶無關［5］，但可提高AD大鼠模型腦內(nèi)降低的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（choline acetyl-transferase，ChAT）活性［6］。本實驗于2016年5月至2018年2月實施，探討了梓醇對大鼠大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)和膽堿能毒蕈堿受體M1亞型（M1受體）表達的保護作用。

圖1 各組大鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)（HE染色×40）：A為正常對照組，B為阿爾茨海默病模型組，C為梓醇小劑量組，D為梓醇大劑量組

圖2 梓醇對各組大鼠大腦皮層超微結(jié)構(gòu)的影響（透射電鏡，Ⅰ：×5 000；Ⅱ：×20 000）：A為健康對照組；B為阿爾茨海默病模型組；C為梓醇小劑量組；D為梓醇大劑量組

圖3 各組大鼠大腦皮層M1受體的表達（免疫組織化學染色×40）：A為正常對照組，B為阿爾茨海默病模型組，C為梓醇小劑量組，D為梓醇大劑量組

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體（SPF）級健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量范圍為250～300 g，購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，醫(yī)學實驗動物合格證號：No.0010061，許可證號：SCXK（魯）20140007。飼養(yǎng)條件：溫度范圍為20～25℃，濕度范圍為50%～60%，自然晝夜節(jié)律光照，自由進食和飲水。本研究符合一般實驗動物倫理學原則。

1.1.2實驗藥品及試劑 梓醇購自北京索萊寶科技有限公司（批號20161124）；β-淀粉樣蛋白片段25-35（Aβ25-35）購自Sigma公司（批號050M4765）；D-半乳糖為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品（批號20150615）；抗M1受體抗體購自上海江萊生物科技有限公司；辣根酶標記的羊抗兔二抗購自美國Proteintech公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；四甲基乙二胺（TEMED）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；超敏ECL化學發(fā)光即用型底物和DAB試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1模型制備及行為學檢測 側(cè)腦室內(nèi)注射用Aβ25-35溶液的配制：無菌0.9%氯化鈉水溶液稀釋Aβ25-35至2 μg/μL溶液，37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育1周置4℃?zhèn)溆?。D-半乳糖用無菌0.9%氯化鈉水溶液配成20 mg/mL溶液置4℃?zhèn)溆?。參考文獻［7］方法制作AD大鼠模型。大鼠腹腔注射2%D-半乳糖50mg·kg-1·d-1，連續(xù)6周。腹腔注射D-半乳糖第3周的第1天側(cè)腦室內(nèi)定位注射Aβ25-35：大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，固定于腦立體定位儀，剪去手術(shù)區(qū)毛發(fā)，皮膚常規(guī)消毒，沿顱頂中線切開頭皮約2 cm，分離骨膜，暴露顱骨和前囟。參照《大鼠腦立體定位圖》［8］，右側(cè)側(cè)腦室定位于前囟后1.0 mm，右側(cè)1.8 mm，硬膜下3.8 mm，鉆開顱骨，暴露硬腦膜，用微量注射器垂直進針，緩慢注入Aβ25-355 μL即10 μg，注射過程持續(xù)5 min，留針3 min，緩慢拔針。

Y-迷宮實驗檢測大鼠行為學，學習指數(shù)降低表明模型制作成功。

1.2.2動物分組及取材 造模后的大鼠按照體質(zhì)量編號后按隨機數(shù)字表法分組，每組9只：健康對照組、模型組、梓醇小劑量組、梓醇大劑量組。梓醇小劑量組和梓醇大劑量組大鼠分別給予梓醇5 mg·kg-1·d-1、10 mg·kg-1·d-1，健康對照組和模型組大鼠注射等容積0.9%氯化鈉水溶液。均腹腔注射給藥，從側(cè)腦室注射Aβ25-35完畢次日開始給藥，連用7 d。

大腦皮質(zhì)取材：實驗結(jié)束時麻醉大鼠，立即斷頭，于冰上開顱迅速取出腦組織，電鏡檢測取材找到右側(cè)大腦皮質(zhì)，不同大鼠盡量在皮層相同部位，取約1 mm×1 mm×1 mm小塊，放入3%戊二醛中，置4℃冰箱固定進行電鏡觀察，其余腦組織立即放入液氮準備進行蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測。左側(cè)大腦皮質(zhì)取下后放入4%多聚甲醛固定，然后依次進行常規(guī)脫水透明、浸蠟、包埋，切片厚度5 μm，制成石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學染色檢測。

1.2.3指標檢測方法 行為學檢測：Y-迷宮實驗檢測大鼠學習能力［9］，根據(jù)初篩結(jié)果選定工作電壓范圍35～45 V。大鼠每天做逃避反應實驗1次，每次試驗20次，間隔5 s，記錄20次試驗的正確反應次數(shù)及完成該過程的總時間，連續(xù)15 d。正確反應的次數(shù)與總反應時間的比值即學習指數(shù)作為衡量學習能力的指標。

HE染色：石蠟切片脫蠟，二甲苯透明，梯度乙醇脫二甲苯，充分浸洗后蘇木素染色15 min，1%鹽酸乙醇鏡檢分化后入1%氨水藍化2～3 min，蒸餾水充分沖洗，1%伊紅染色3 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

電鏡觀察：組織于3%戊二醛4℃固定，PBS緩沖液反復沖洗后4℃固定于1%四氧化鋨（OsO4）置冰箱固定，系列乙醇梯度脫水和丙酮脫水，包埋劑37℃浸透過夜后環(huán)氧樹脂包埋，恒溫箱逐漸加溫聚合，甲苯胺藍染色，切片厚度70 nm，依次醋酸鈾避光染色和檸檬酸鉛染色，電鏡觀察。

免疫組織化學染色：腦切片常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫室溫30 min，5%牛血清白蛋白（BSA）室溫30 min，依次加抗M1受體一抗（1∶200）4℃過夜（陰性對照以PBS代替）、生物素化二抗37℃45 min、SABC復合物37℃30 min，DAB顯色試劑盒染色，倒置顯微鏡觀察并拍照。各步驟間按照操作要求PBS充分沖洗切片3次。

蛋白質(zhì)印跡法檢測：首先提取組織蛋白，事先準備組織裂解液，將大腦皮質(zhì)從-80℃冰箱取出，放入1.5 mL微型離心管（EP管），加RIPA裂解液研磨，勻漿后用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），每孔上樣50 μg蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗（1∶500稀釋）置4℃孵育過夜，加入二抗、顯色。

1.3統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 11.5處理，經(jīng)方差齊性檢驗后，多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步各組與模型組間采用Dunnett-t檢驗進行比較。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1行為學指標實驗過程中模型組大鼠死亡1只，最終模型組n=8，其余組均n=9。實驗前大鼠學習指數(shù)為第0天的數(shù)據(jù)，側(cè)腦室定位注射后第7天開始每天進行Y-迷宮行為學檢測，連續(xù)15 d。與健康對照組大鼠比較，模型組大鼠的學習指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，除第7天外，梓醇小劑量、大劑量組第14天、第21天均顯著提高了大鼠的學習指數(shù)。見表1。

表1 各組大鼠的學習指數(shù)比較/±s

表1 各組大鼠的學習指數(shù)比較/±s

注：與模型組比較，aP＜0.01，bP＜0.05（第14天：小劑量組t=3.267，P=0.030 9，大劑量組t=4.648，P=0.009 7；第21天：小劑量組t=5.010，P=0.007 4，大劑量組t=4.614，P=0.009 9）

組別健康對照組模型組梓醇小劑量組梓醇大劑量組F值P值鼠數(shù)9899第0天5.4±0.7 5.5±0.9 5.7±1.1 5.5±0.9 0.171 3 0.915 0第7天5.3±0.2a 2.3±0.3 2.8±0.6 3.1±0.7 61.625 1 0.000 0第14天5.6±0.2a 2.6±0.3 3.7±0.5b 4.4±0.6a 71.765 6 0.000 0第21天6.3±0.8a 4.1±0.5 5.3±0.4a 5.8±0.8a 17.395 6 0.000 0

2.2大腦皮質(zhì)HE染色切片在40倍鏡下觀察，健康對照組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列整齊，細胞核深染（圖1A）；模型組皮層結(jié)構(gòu)有損傷性改變，表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元細胞體積有縮小，部分神經(jīng)元細胞核固縮（圖1B）；小劑量梓醇干預后細胞結(jié)構(gòu)有所改善，可見細胞結(jié)構(gòu)較正常，核膜清晰，神經(jīng)元細胞數(shù)目增多（圖1C）；大劑量梓醇對結(jié)構(gòu)的改善作用更明顯（圖1D）。

2.3大腦皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)-電鏡觀察結(jié)果健康對照組大鼠大腦神經(jīng)元形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)大量正常線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體正常分布，脂褐素顆粒極少見，細胞核染色質(zhì)分散，部分可見清晰的突觸結(jié)構(gòu)（圖2A）。模型組大鼠大腦神經(jīng)元固縮多見，電子密度增高，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象，大量脂褐素顆粒見于胞質(zhì)內(nèi)，高爾基復合體異常豐富，線粒體腫脹、嵴脫顆?，F(xiàn)象多見，部分呈空泡樣變，有些細胞核呈不規(guī)則固縮，核周隙局部增寬，甚至有些核內(nèi)異染色質(zhì)呈邊集現(xiàn)象（圖2B）。

梓醇低劑量組細胞核固縮及核周隙增寬現(xiàn)象改善，異染色質(zhì)有部分邊集現(xiàn)象，線粒體較豐富，小部分線粒體嵴紊亂（圖2C）。梓醇高劑量組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與模型組比較有明顯改善，胞質(zhì)和細胞核內(nèi)線粒體豐富，線粒體嵴排列整齊，個別嵴間腔增大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，脫顆粒少見，細胞核常染色質(zhì)均勻，異染色質(zhì)少（圖2D）。

2.4大腦皮質(zhì)M1受體免疫組織化學染色正常大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞體大，細胞多為梭形和橢圓形，突起明顯，M1受體陽性染色分布于神經(jīng)元膜上（圖3A）。模型組陽性染色神經(jīng)元細胞數(shù)目減少，部分萎縮，染色淺（圖3B）。梓醇小劑量組M1受體染色神經(jīng)元個體增大，染色深（圖3C）。梓醇大劑量組神經(jīng)元的形態(tài)和著色深度顯著好轉(zhuǎn)（圖3D）。

各組大鼠免疫組織化學陽性染色神經(jīng)元在顯微鏡下計數(shù)，每張切片選擇3個相鄰視野（1個視野=1 mm3），計數(shù)并取其平均值。結(jié)果可見，模型組的陽性神經(jīng)元個數(shù)（35.7±3.4）個少于健康對照組（41.3±5.1）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.085，P=0.007 1）；梓醇小劑量組神經(jīng)元個數(shù)（38.8±3.9）個增加，與模型組（35.7±3.4）個比較差異有統(tǒng)計學意義（t=2.153，P=0.047 0）；梓醇大劑量組神經(jīng)元個數(shù)（41.4±1.5）個增加顯著，與模型組（35.7±3.4）個比較差異有統(tǒng)計學意義（t=4.514，P=0.000 4）；四組間大鼠皮層M1受體染色陽性神經(jīng)元數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.369 0，P=0.011 2）。

2.5大腦皮質(zhì)M1受體蛋白的表達蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，模型組的M1受體蛋白表達較健康對照組減少，梓醇兩個劑量對其表達有不同程度升高作用。通過蛋白質(zhì)印跡法條帶灰度進行分析比較，以健康對照組蛋白表達為100%計算，模型組大鼠大腦皮質(zhì)M1受體蛋白的表達為64.75%，明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.39，P=0.000 1），梓醇小劑量升高蛋白表達至74.63%，大劑量升高受體蛋白表達至85.74%，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=3.983，P=0.016 4；t=6.694，P=0.002 6）。見圖4。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠大腦皮質(zhì)M1受體蛋白表達

3 討論

AD是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，表現(xiàn)為學習記憶能力逐步減退，嚴重降低病人的生活質(zhì)量。由于發(fā)病機制迄今不明，至今AD臨床治療效果并不理想，而根據(jù)AD研究進展開發(fā)的各種治療措施如Aβ疫苗、腦內(nèi)注射神經(jīng)生長因子（NGF）等在臨床試驗中均存在一定的不足而最終沒有進入臨床［10］，因此，開發(fā)有效治療AD的藥物具有重要的臨床意義。

研究證明，Aβ是老年斑的主要成分，AD時神經(jīng)元退行性病變主要源于Aβ產(chǎn)生和清除失衡導致的Aβ聚集，是各種原因誘發(fā)AD的共同通路。聚集態(tài)Aβ可誘導細胞凋亡，損傷神經(jīng)元，導致學習記憶功能障礙［7］，對體外培養(yǎng)和在體神經(jīng)細胞均可觀察到其毒性作用。Aβ的主要效應片段是Aβ25-35，Aβ25-35已成為制作擬AD動物及細胞模型的常用工具藥［11-12］。因此，本研究選擇用Aβ25-35復制AD大鼠模型。聯(lián)合應用D-半乳糖的機制在于，D-半乳糖是一種小分子單糖，連續(xù)注射后機體內(nèi)含量增多，通過自由基引起氧化應激損傷等途徑誘發(fā)動物衰老［13］。實驗選擇對大腦皮質(zhì)進行觀察，因為大腦皮質(zhì)是學習記憶的關鍵腦區(qū)之一，而且腦M受體的含量與學習記憶密切相關。AD臨床癥狀的產(chǎn)生主要與中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能減退有關，膽堿能系統(tǒng)功能低下，包括相關腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元較正常明顯減少，合成乙酰膽堿的關鍵酶ChAT活性降低，M受體密度降低等。正常情況下，M1受體是大腦皮質(zhì)分布的主要M受體亞型，乙酰膽堿與其結(jié)合后調(diào)節(jié)學習記憶能力，AD病人大腦皮質(zhì)M1受體顯著降低，被認為是AD發(fā)病的重要中間環(huán)節(jié)［14］，尋找提高腦內(nèi)M受體的藥物治療AD具有重要的意義，因此本研究觀察了大腦皮質(zhì)M1受體的表達。

梓醇是從中醫(yī)常用的抗衰老藥物地黃中提取的一種活性成分，研究證實其具有神經(jīng)保護作用［4，15-17］。本研究從大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)和M1受體的表達方面研究梓醇對AD的保護作用，文中梓醇設定了小劑量和大劑量2個組，所用劑量分別為5 mg/kg和10 mg/kg，這是根據(jù)已有的實驗結(jié)果和相關文獻而設定的［6］。

本研究結(jié)果表明，模型大鼠學習指數(shù)降低，說明其學習能力下降，梓醇對這種學習能力有顯著改善作用。大腦皮質(zhì)形態(tài)學檢查中，HE染色發(fā)現(xiàn)梓醇改善了大腦皮質(zhì)組織疏松、神經(jīng)元萎縮等損傷性改變；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)模型大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元固縮、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、脫顆粒，線粒體腫脹、嵴脫顆粒、空泡樣變等結(jié)構(gòu)改變，梓醇抑制了這種超微結(jié)構(gòu)的損傷性改變。中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能異常是導致AD病人學習能力降低的重要因素，腦M1受體減少是AD發(fā)病的重要一環(huán)，因此，提高腦M1受體表達可能改善AD病人的學習記憶能力。本研究觀察到M1受體免疫組織化學陽性染色分布于神經(jīng)元膜上，模型組大鼠M1受體在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的染色淺，陽性染色神經(jīng)元數(shù)目減少，同時蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果也進一步印證了M1受體蛋白表達降低。梓醇能夠增加M1受體的表達，意味著其對中樞的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能有一定改善作用，可能對AD的學習記憶能力產(chǎn)生相應的治療效應。

綜上所述，梓醇具有提高AD模型大鼠學習記憶能力的作用，同時改善大鼠大腦皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常，其改善學習能力可能與提高大鼠腦內(nèi)M1受體表達有關。

（本文圖1～3見插圖10-2）